馬春麗 扈瑞平 苑紅 張競男 包玉龍 董超 徐宋瑤 李麗

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（呼和浩特010110）

隨著生活水平的提高和生活方式的改變，高脂肪飲食和久坐不動的生活方式引起的肥胖及相關(guān)代謝疾病越來越多。肥胖的根本原因包括由于遺傳或環(huán)境因素導(dǎo)致的能量儲存高于消耗，以及身體脂肪細(xì)胞的過度增殖和分化，最終導(dǎo)致體質(zhì)量增加。腸道微生物群由數(shù)以萬億計的細(xì)菌組成，通過調(diào)節(jié)養(yǎng)分吸收、能量和脂肪儲存，影響宿主的養(yǎng)分消化和能量代謝。因此，它在肥胖和相關(guān)代謝疾病的發(fā)展中起著重要作用［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，與非肥胖者相比，肥胖者的微生物群較少［4］。在無菌小鼠中，高能量和高脂肪飲食誘導(dǎo)的體質(zhì)量增加和脂肪積累受到抑制。當(dāng)將肥胖小鼠的微生物群移植到無菌小鼠中時，肥胖表型也發(fā)生了轉(zhuǎn)移。此外，在減少Akkermansia 和擬桿菌數(shù)量、增加Oscillospira 豐度時，小鼠發(fā)生肥胖。這些研究表明微生物群在肥胖的發(fā)展中起著重要作用。同時，肥胖會導(dǎo)致血清脂多糖濃度升高，脂多糖是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，脂多糖可能導(dǎo)致代謝炎癥。研究表明，擬桿菌可以通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFAs）為身體提供能量來促進(jìn)健康，抑制LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞炎癥［5-9］。這些結(jié)果表明，調(diào)節(jié)腸道微生物群可能是預(yù)防肥胖和肥胖相關(guān)代謝綜合征的重要措施。

此外，飲食干預(yù)有助于調(diào)節(jié)細(xì)菌分布［10］。因此，通過飲食治療或使用更有針對性的方法，如給予特定的細(xì)菌菌株來改善營養(yǎng)成分，可能是對抗肥胖的一種新的、更有效的方法。鈣離子是人體的重要營養(yǎng)元素，膳食鈣攝入量與體重、體脂或體重指數(shù)正相關(guān)。有人認(rèn)為鈣會增加糞便能量損失，并導(dǎo)致能量失衡［11］，但是鈣離子如何影響肥胖機體腸道菌群變化以及介導(dǎo)機體肥胖未見報道。本文主要研究氯化鈣是否可以通過調(diào)節(jié)腸道微生物群來改善肥胖。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 30 只C57bl ∕6J 雄性小鼠，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑 氯化鈣為sigma 試劑；小鼠脂多糖（LPS）ELISA 試劑盒，小鼠白細(xì)胞介素1β（IL-1β）ELISA 試劑盒；小鼠免疫球蛋白G（IgG）ELISA 試劑盒，小鼠免疫球蛋白M（IgM）ELISA 試劑盒；小鼠胰島素（INS）ELISA 試劑盒，小鼠白細(xì)胞介素6（IL-6）ELISA 試劑盒，小鼠生長激素（GH）ELISA 試劑盒；甘油三酯（TG）含量檢測試劑盒；總膽固醇（total cholesterol，TC）含量測定試劑盒，均為酶免品牌試劑盒。TransZol（全式金），氯仿（國藥集團(tuán)），異丙醇（滬試），無水乙醇（CNW）DEPC 水（生工生物），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara），普通PCR 試劑（生工生物），qPCR 試劑（Takara）

1.1.3 儀器 超低溫冰箱（Forma 900 series，Thermo Fisher Scientific），酶標(biāo)儀（Multiskan FC，Thermo Fisher Scientific），恒溫培養(yǎng)箱（DNP型，精宏），DNA∕protein analyier（SMA4000 Merinton），PCR 擴 增 儀（ETC811，蘇州東勝），qPCR 儀（7300 plus Thermo），渦旋儀（0003340025，IKA VORTEX 3），低速掌上離心機（DWB，D1088），電泳電源（DYY-6D 型，北京六一生物科技），化學(xué)發(fā)光成像儀（ChemiScope6200，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗設(shè)計 將雄性C57BL∕6 野生型小鼠鼠房中飼養(yǎng)：溫度（25 ± 2）℃，相對濕度（55 ±10）%，12 h光照∕12 h黑暗的明暗循環(huán)。自由飲水，自由飲食標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，將30 只小鼠隨機分為對照組（C）、模型組（M）、氯化鈣處理組（D），每組10只。C組喂標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水，M組喂高脂飼料和飲用水，D組喂高脂飼料和1.5 g∕100 mL氯化鈣。連續(xù)喂養(yǎng)11 周，11 周后采樣。取樣前12 h 禁食。收集小鼠糞便于離心管中用于高通量測序。記錄小鼠體質(zhì)量。斷頭取血收集于離心管中，靜置30 min，于4 ℃、3 000 r∕min 離心15 min，分離血清。迅速剝離脾臟、腎臟周圍脂肪組織，并稱質(zhì)量。

1.2.2 生化分析和細(xì)胞因子測量 TG、TC、LDL-C、HDL-C 采用全自動生化分析儀測定。LBP、TNF-α、IL-6、IL-1β 和IFN-γ 使用商業(yè)ELISA 試劑盒（酶免品牌）定量。

1.2.3 腸道微生物群分析 11 周實驗結(jié)束時，從每組中選擇3 個小鼠糞便樣品進(jìn)行微生物群16S rRNA。CTAB∕SDS 方法提取總細(xì)菌基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳評估DNA 提取數(shù)量和質(zhì)量，DNA 終濃度1 μg∕μL。選取特定的引物16S V4：515F-806R（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）擴增16S rRNA 的16S V4∕16S V3∕16S V3-V4∕16S V4-V5區(qū)域。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit（Illumina，USA）進(jìn)行文庫構(gòu)建，Qubit@2.0 Fluorometer（Thermo Scientific）和Agilent Bioanalyzer 2100 系統(tǒng)對文庫進(jìn)行評估，Illumina NovaSeq測序。原始讀取被存入NCBI 序列讀取存檔（SRA）數(shù)據(jù)庫。原始16S rRNA 基因測序讀數(shù)經(jīng)過多路分解、質(zhì)量過濾和合并。對具有97%相似性的操作分類單元（OTU）進(jìn)行聚類，識別并刪除嵌合序列。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 通過Perl 語言和R 語言軟件進(jìn)行分析，分析樣品內(nèi)物種豐富度、均勻度和多樣性、不同樣品間的共有和特有OTU 等信息。采用SPSS 16.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，比較行單因素方差分析，并進(jìn)行Tukey′s 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氯化鈣抑制高脂肪飲食誘導(dǎo)的小鼠體質(zhì)量增加 研究結(jié)束時，高脂飲食喂養(yǎng)的雄性小鼠體質(zhì)量顯著高于標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)和高脂飲食喂養(yǎng)+1.5 g∕100 mL 氯化鈣喂養(yǎng)的小鼠，氯化鈣+高脂飲食小鼠體質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)飲食小鼠體質(zhì)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明氯化鈣減少了高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的體質(zhì)量增加。見圖1。

圖1 小鼠體質(zhì)量數(shù)據(jù)Fig.1 Mouse body weight data

2.2 氯化鈣防止高脂飲食介導(dǎo)的小鼠脂肪組織增加 由于氯化鈣降低了高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠體質(zhì)量，通過稱量脂肪質(zhì)量可知體質(zhì)量增加的減少是否由于脂肪組織質(zhì)量的減少。與標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)組相比，高脂飲食顯著增加了肝臟、附睪、腎臟和腸系膜脂肪的重量。氯化鈣+高脂飲食組與高脂飲食組小鼠相比，脂肪重量明顯降低，表明氯化鈣降低了高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪量增加。脂肪量與喂食氯化鈣相關(guān)，氯化鈣誘導(dǎo)的體質(zhì)量增加減少可歸因于脂肪組織質(zhì)量的減少。結(jié)果顯示，與高脂飲食組相比，氯化鈣顯著降低體內(nèi)脂肪質(zhì)量（P＜0.05），表明氯化鈣可能抑制了體內(nèi)脂肪生成。見圖2。

圖2 小鼠脂肪數(shù)據(jù)Fig.2 Mouse fat data

2.3 氯化鈣改善高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的血清脂質(zhì)并減輕全身炎癥 肥胖伴隨著血清脂質(zhì)、血糖水平和炎性細(xì)胞因子水平的升高。與標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)組相比，高脂飲食喂養(yǎng)組小鼠血清TC、血糖、IL-6、IL-1β 顯著升高，與標(biāo)準(zhǔn)飲食組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與高脂飲食組相比，氯化鈣+高脂飲食組血清脂質(zhì)水平（TC）、血糖和全身炎癥指標(biāo)（IL-6、IL-1β）明顯降低（P＜0.05）。表明氯化鈣能使高脂小鼠TC、血糖、IL-6、IL-1β 降低。見圖3。

圖3 脂質(zhì)、血糖水平和炎性細(xì)胞因子變化Fig.3 Changes in lipids，blood sugar levels and inflammatory cytokines

2.4 氯化鈣改善高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的血清IgM和IgG 升高 與標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)組相比，高脂飲食喂養(yǎng)組小鼠血清IgM 和IgG 降低，與標(biāo)準(zhǔn)飲食組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與高脂飲食組相比，氯化鈣+高脂飲食組血清IgM 和IgG 升高，說明氯化鈣在高脂飲食中升高了IgM 和IgG 水平（P＜0.05）。見圖4。

圖4 血清IgM 和IgG 變化Fig.4 Serum IgM and IgG changes

2.5 氯化鈣改善高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的血清脂多糖濃度的升高 與標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)組相比，高脂飲食喂養(yǎng)組小鼠血清LPS 顯著升高，與標(biāo)準(zhǔn)飲食組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與高脂飲食組相比，氯化鈣顯著降低了血清LPS水平（P＜0.05）。見圖5。

圖5 血清脂多糖濃度變化Fig.5 Changes in serum lipopolysaccharide concentration

2.6 氯化鈣改善肥胖小鼠腸道微生物群組成 在喂養(yǎng)11 周后，對小鼠糞便樣本進(jìn)行測序，以闡明標(biāo)準(zhǔn)飲食、高脂飲食和高脂飲食補充氯化鈣對腸道微生物群結(jié)構(gòu)的影響。門和屬含量前十的菌群物種相對豐度見圖6、7。厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、脫硫球菌門（Desulfobacterota）是最豐富的門，它們存在于所有組中。厚壁菌門和擬桿菌門是人體腸道中最重要的兩個細(xì)菌門，占85.6%。高脂飲食組的厚壁菌門比例從41.2% 增加到61.8%，擬桿菌門的比例從44.4%下降到13.7%。高脂飲食+氯化鈣組小鼠腸道微生物群譜存在差異，厚壁菌門比例為58.1%，變性菌門比例低至0.9%，放線菌門升高至7.1%。見表1。同時，從屬中可以看到雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）比例升高，標(biāo)準(zhǔn)飲食組為3.9%，氯化鈣+高脂飲食組為8.9%。表明氯化鈣可能通過調(diào)節(jié)放線菌門來抑制體質(zhì)量增加。

圖6 腸道菌群門水平豐度Fig.6 Relative abundances of the gut microbiota at the phylum level

表1 小鼠腸道厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、脫硫球菌門所占比例Tab.1 Percentage of Firmicutes，Bacteroidota，Proteobacteria，Actinobacteriota，Desulfobacterota in the mouse intestine %

3 討論

肥胖是一種皮下或腹部脂肪組織過度堆積的狀態(tài)。這種脂肪組織主要用于儲存能量，當(dāng)前認(rèn)為這些脂肪組織參與調(diào)節(jié)生理和病理過程，包括免疫和炎癥［12］。飲食在肥胖和其他病理生理狀況中起著關(guān)鍵作用。健康的飲食和一些營養(yǎng)素通常被認(rèn)為是有益的［13］。

本研究主要探討鈣的補充對高脂飲食小鼠體質(zhì)量、脂肪、生化指標(biāo)、炎癥因子及腸道菌群的影響。結(jié)果顯示，高脂飲食組體質(zhì)量增加、體內(nèi)脂肪的重量以及TC 含量均顯著增加。氯化鈣干預(yù)后，相比高脂飲食組，小鼠體重降低、體內(nèi)脂肪質(zhì)量降低、TC 較低，同時，鈣的補充增加了雙歧桿菌豐度，降低了擬桿菌豐度。

圖7 腸道菌群屬水平豐度Fig.7 Relative abundances of the gut microbiota at the genus level

研究表明，腸道微生物群在肥胖中扮演著重要角色［14］，飲食對其組成有重大影響［15］。高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠由于長期攝入過多造成能量過剩，被轉(zhuǎn)化為脂肪儲存在體內(nèi)。在飲食肥胖的動物中補充鈣有利于微生物和宿主代謝之間的相互作用，通過補充鈣制劑能夠增加腸道中潛在的有益細(xì)菌，進(jìn)而促進(jìn)腸道ANGPTL4 的誘導(dǎo)。這兩種作用都與宿主動物血漿內(nèi)毒素LPS 水平較低和表型較瘦有關(guān)。同時，鈣的攝入量減少了Firmicus 門的代表性細(xì)菌梭狀芽孢桿菌（Clostridium spp.）［16］，鈣對放線桿菌、雙歧桿菌兩種細(xì)菌的生長具有益生作用，說明鈣為它們的生長提供了適宜的環(huán)境。雙歧桿菌屬（Bifidobacterium spp.）可以降低內(nèi)毒素血癥和炎癥張力，內(nèi)毒素是一種細(xì)菌衍生的分子，參與了肝臟組織中輕度炎癥的發(fā)生。同時，與脂多糖和腸道ANGPTL4 呈負(fù)相關(guān)，后者被認(rèn)為是一種潛在的脂肪調(diào)節(jié)因子。在高脂飲食下，ANGPTL4的表達(dá)減少，而補充具有益生素特征的化合物刺激其表達(dá)，從而抑制LPS 活性并降低脂肪酸攝取。高脂肪飲食引起的肥胖與慢性低度炎癥狀態(tài)有關(guān)，巨噬細(xì)胞逐漸浸潤到肥胖的脂肪組織，釋放細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6 和TNFα，創(chuàng)造一個促炎環(huán)境，炎癥的產(chǎn)生容易導(dǎo)致胰島素抵抗。本實驗中氯化鈣能夠增加雙歧桿菌屬豐度，降低LPS 增多觸發(fā)的炎癥［17-18］；同時，細(xì)菌也能通過調(diào)節(jié)LPS影響炎癥，LPS 是革蘭氏陰性細(xì)菌如擬桿菌門的主要組成成分，有研究報道肥胖個體中厚壁菌門∕擬桿菌門比例較大，本研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食+鈣離子小鼠中擬桿菌數(shù)目進(jìn)一步降低，可能通過擬桿菌門的降低引起LPS 降低，降低炎癥的發(fā)生。

血清免疫球蛋白（Igs）在通過中和病原體調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［19］，有研究發(fā)現(xiàn)肥胖和高甘油三酯血癥人群中發(fā)現(xiàn)血清免疫球蛋白A（IgA）濃度升高［20］，而在血脂異常的情況下觀察到不同濃度的免疫球蛋白M（IgM）。肥胖受試者免疫功能降低，免疫球蛋白IgM 較正常人群相比降低，本研究IgM 結(jié)果與前述研究相符，高脂+鈣離子飲食下，IgM 水平升高。

綜上所述，本研究結(jié)果支持了鈣攝入量有助于對抗老鼠肥胖的假設(shè)。鈣離子能夠調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，與高脂飲食相比，高脂飲食+鈣離子使小鼠IgM 和IgG 升高、炎癥因子降低，提高免疫能力，抑制LPS 引起的腸道炎癥，控制肥胖發(fā)展。