周方 孫波 于志丹 李小芹

河南省兒童醫(yī)院（鄭州大學附屬兒童醫(yī)院，鄭州兒童醫(yī)院）消化科（鄭州450053）

膽汁淤積是一種因膽汁形成、分泌和排泄過程中任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙而引發(fā)的臨床綜合征。腸道微生物在肝臟病理生理過程中發(fā)揮重要作用，能通過改變腸道通透性、調(diào)節(jié)膽堿代謝、調(diào)節(jié)膽汁酸代謝等導致肝臟炎癥和（或）纖維化［1］。臨床上已證明微生態(tài)制劑可以作為一種治療手段來恢復腸道菌群的平衡，對緩解膽汁淤積性肝病具有良好的效果，但機制尚不完全明確［2］。本研究應用α-萘異硫氰酸酯（alpha-naphthylisothiocyanate，ANIT）建立大鼠急性肝內(nèi)膽汁淤積型肝炎模型，探討益生菌通過作用于Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）∕核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號轉(zhuǎn)導通路治療淤膽性肝病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，由鄭州大學實驗動物中心提供。動物許可證號：SCXK 豫，2017-0001。

1.2 藥品與試劑 ANIT（美國Sigma 公司，生產(chǎn)批號：N4525-10）；益生菌制劑（復方嗜酸乳桿菌，每片含嗜酸乳桿菌5 × 106CFU，通化金馬藥業(yè)集團股份有限公司生產(chǎn)，批號：國家準字H10940114）；所用引物均由武漢金開瑞生物工程有限公司合成；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成公司，批號：A001-2），丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成公司，批號：A003-1）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（伊萊瑞特生物科技有限公司，批號分別為：E-EL-R2856c，E-EL-R0012c，E-EL-R0015c）；總RNA提取試劑盒（北京天根科技生化有限公司，批號：DP431）；逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR 試劑盒（日本，TaKaRa 公司，批號分別為：RR037A，RR820A）；全蛋白提取試劑盒（凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號：KGP250）；兔抗大鼠NF-κB p65 抗體和山羊抗兔IgG-HRP 二抗（英國，Abcam 公司，批號分別為：ab16502，ab205718）；兔抗大鼠GAPDH 抗體（美國，Affinity Biosciences公司，批號：AF7021）；兔抗大鼠TLR4 抗體（美國，Affinity Biosciences公司，批號：AF7017）。

1.3 儀器 貝克曼庫爾特AU680 自動生化分析儀（美國，貝克曼庫爾特公司）；LightCycler 480II 實時熒光定量PCR 儀（瑞士，Roche 公司）。

1.4 動物分組及模型制備 40 只SD 大鼠正常喂養(yǎng)5 d 后按隨機數(shù)字表分為正常對照組、模型組、模型+益生菌組、正常+益生菌組，每組10 只。ANIT 用橄欖油配制成15 g∕L；復方嗜酸乳桿菌用生理鹽水配制成1×1010CFU∕L 的混懸液備用。模型+益生菌組和正常+益生菌組給予復方嗜酸乳桿菌5×107CFU∕（kg·d）灌胃14 d，正常對照組和模型組灌服生理鹽水5 mL∕（kg·d），均為1 次∕d，并于實驗第12 天給藥后4 h，模型組和模型+益生菌組按75 mg∕kg 給予ANIT 灌胃1 次建立肝內(nèi)膽汁淤積模型，正常對照組及正常+益生菌組等量橄欖油處理，第14 天給藥后4 h（模型建立48 h）用100 g∕L 水合氯醛250 mg∕kg 腹腔注射麻醉實驗動物，取血、分離血清，-20 ℃保存?zhèn)錂z；留取肝臟標本，-80 ℃保存。

1.5 血清學指標檢測 將留取的血清交由河南省兒童醫(yī)院檢驗科，經(jīng)全自動生化分析儀測定各組血清中總膽紅素（TBiL）、直接膽紅素（DBiL）、總膽汁酸（TBA）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）。

1.6 肝臟組織中MDA 和SOD 活性含量檢測 黃嘌呤氧化酶法檢測肝組織中SOD 含量，硫代巴比妥酸比色法檢測MDA 水平。肝臟組織勻漿后根據(jù)南京建成公司試劑盒說明書進行操作。

1.7 用ELISA 方法檢測肝臟組織中TNF-α、IL-6、IL-1β 水平 肝臟組織勻漿后根據(jù)試劑盒說明書操作方法，用ELISA 檢測肝組織中TNF-α、IL-6、IL-1β 含量。

1.8 用RT-qPCR檢測肝組織NF-κB、TLR4 mRNA表達水平 于冰上取約100 mg 肝組織按照總RNA提取試劑盒說明進行總RNA 提取，清除殘存的基因組DNA 后，測定其濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并置于-20 ℃保存。進行實時熒光定量PCR 檢測，反應條件：95 ℃預變性30 s，擴增40 個循環(huán)（95 ℃5 s，60 ℃20 s）。在PCR反應過程中，設(shè)定無cDNA 樣品的空白管作為陰性對照，引物序列見表1。以管家基因GAPDH 為內(nèi)參，用2-ΔΔCt對各基因的原始拷貝數(shù)進行相對定量分析。

表1 實時熒光定量RT-PCR 引物序列Tab.1 The primer sequences for RT-qPCR

1.9 用Western blot 法檢測肝組織NF-κB、TLR4蛋白表達水平 按試劑盒說明提取肝臟組織總蛋白后BCA法測定蛋白濃度，蛋白上樣量均為40 μg，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，加入目的蛋白NF-κB（1∶2 000）、TLR4（1∶1 000）和內(nèi)參蛋白GAPDH（1∶5 000）的一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后室溫孵育辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000）1 h，ECL 化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像，AlphaEaseFC 軟件處理系統(tǒng)測定分析結(jié)果，判斷各組NF-κB、TLR4蛋白表達水平。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清肝功能指標比較 與正常對照組比較，模型組TBA、TBiL、DBiL、AST 和ALT 均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型+益生菌組TBA、TBiL、DBiL、AST 和ALT 均低于模型組（P＜0.05）；正常+益生菌組與正常對照組比較各指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2）。

表2 各組大鼠TBiL、DBiL、ALT、AST 和TBA 結(jié)果比較Tab.2 Comparison of TBiL，DBiL，ALT，AST and TBA in rats of each group ±s

表2 各組大鼠TBiL、DBiL、ALT、AST 和TBA 結(jié)果比較Tab.2 Comparison of TBiL，DBiL，ALT，AST and TBA in rats of each group ±s

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別正常對照組模型組模型+益生菌組正常+益生菌組F 值P 值n 10 10 10 10 TBiL（μmol∕L）1.08±0.19 78.36±7.47**59.92±6.32**##1.12±0.26##358.88＜0.001 DBiL（μmol∕L）0.32±0.07 48.13±5.67**42.23±3.03**#0.28±0.05##391.47＜0.001 ALT（U∕L）48.61±6.72 611.24±96.70**386.63±67.26*##52.79±5.86##195.27＜0.001 AST（U∕L）26.83±3.64 425.33±45.98**354.15±34.64**##28.12±2.89##368.49＜0.001 TBA（μmol∕L）8.02±1.47 94.28±8.16**82.27±7.70**#7.93±1.14##205.32＜0.001

2.2 各組肝組織SOD 活性、MDA 含量及TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 模型組與正常對照組比較，SOD 活性明顯降低（P＜0.05），MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平增加（P＜0.05）；模型+益生菌組SOD活性明顯高于模型組（P＜0.05），MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β 含量低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；正常+益生菌組與正常組比較，SOD、MDA、TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表3）。

表3 各實驗組大鼠SOD、MDA、TNF-α、IL-6 和IL-1β 結(jié)果比較Tab.3 Comparison of SOD，MDA，TNF-α，IL-6 and IL-1β in rats of each group ±s

表3 各實驗組大鼠SOD、MDA、TNF-α、IL-6 和IL-1β 結(jié)果比較Tab.3 Comparison of SOD，MDA，TNF-α，IL-6 and IL-1β in rats of each group ±s

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05,##P ＜0.01

組別正常對照組模型組模型+益生菌組正常+益生菌組F 值P 值n 10 10 10 10 SOD（U∕mg）121.36±8.47 72.83±5.79**88.23±8.16*##126.94±9.52##95.36＜0.001 MDA（nmol∕mg）0.84±0.09 1.89±0.27**1.65±0.18**#0.81±0.07##127.55＜0.001 TNF-α（pg∕mg）116.04±13.31 345.13±46.30**279.27±38.76**##120.37±14.87##122.71＜0.001 IL-6（pg∕mg）86.46±17.14 247.72±41.37**213.35±32.17**#85.20±19.48##88.28＜0.001 IL-1β（pg∕mg）159.24±32.69 518.30±89.63**467.62±71.14**##151.70±29.57##205.64＜0.001

2.3 各組肝組織NF-κB、TLR4 mRNA表達比較模型組NF-κB、TLR4 mRNA 表達量高于正常對照組（P＜0.05）；模型+益生菌組與模型組比較，NF-κB、TLR4 mRNA 表達量明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；正常+益生菌組NF-κB、TLR4 mRNA 表達與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表4）。

表4 各實驗組大鼠NF-κB 和TLR4 mRNA 表達的比較Tab.4 Comparison of NF-κB and TLR4 mRNA in rats of each group ±s

表4 各實驗組大鼠NF-κB 和TLR4 mRNA 表達的比較Tab.4 Comparison of NF-κB and TLR4 mRNA in rats of each group ±s

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別正常對照組模型組模型＋益生菌組正常＋益生菌組F 值P 值n 10 10 10 10 NF-κB 0.97±0.07 2.79±0.81**2.19±0.54**#0.90±0.07##33.26＜0.001 TLR4 1.53±0.39 4.01±0.79**3.15±0.53**#1.50±0.24##50.19＜0.001

2.4 各組肝組織NF-κB、TLR4 蛋白表達比較 與mRNA 表達水平一致，模型組NF-κB、TLR4 蛋白表達量高于正常對照組（P＜0.05）；模型+益生菌組NF-κB、TLR4 蛋白表達量低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；正常對照組與正常+益生菌組比較，NF-κB、TLR4 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖1 及表5）。

圖1 Western blot 檢測各實驗組大鼠NF-κB、TLR4 蛋白表達Fig.1 The protein expression of NF-κB and TLR4 in rats of each group by Western blot

表5 各實驗組大鼠NF-κB 和TLR4 蛋白表達的比較Tab.5 Comparison of NF-κB and TLR4 protein in rats of each group ±s

表5 各實驗組大鼠NF-κB 和TLR4 蛋白表達的比較Tab.5 Comparison of NF-κB and TLR4 protein in rats of each group ±s

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別正常對照組模型組模型＋益生菌組正常＋益生菌組F 值P 值n 10 10 10 10 NF-κB 0.56±0.06 1.33±0.52**1.01±0.39**#0.49±0.06##19.35＜0.001 TLR4 0.29±0.05 0.69±0.15**0.49±0.14**#0.33±0.06##16.73＜0.001

3 討論

近年來，隨著對腸-肝軸的不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，作為腸道的重要組成的腸道菌群在誘導和促進肝內(nèi)膽汁淤積性肝病發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用［2］。ANIT 誘導大鼠產(chǎn)生生化和病理改變與人肝內(nèi)膽汁淤積性肝病相似，已被廣泛應用于肝內(nèi)膽汁淤積動物模型的建立［3］。因此，本實驗應用這一模型進行研究。

人類腸道菌群是一個動態(tài)的、復雜的生態(tài)系統(tǒng)，在種類和數(shù)量上保持相對穩(wěn)定、制約與平衡［4］。膽汁酸可影響腸道細菌增長，調(diào)節(jié)腸道菌群種類、數(shù)量，具有清潔功能和直接抑菌作用［5］。肝內(nèi)膽汁淤積時，膽汁分泌、排泄異常，進入腸道的膽汁酸減少，腸道菌群的種類、數(shù)量改變，腸道黏膜機械、化學、生物及免疫屏障均被損害，腸道細菌及代謝產(chǎn)物如內(nèi)毒素等通過“腸-肝”軸，導致一系列炎性因子的產(chǎn)生，進一步誘發(fā)和加重肝臟損傷［6-7］。益生菌是指對腸道內(nèi)菌群平衡有益的活的微生態(tài)制劑，可分為多聯(lián)活菌制劑和單菌制劑。益生菌可以恢復腸道微生態(tài)平衡，修復腸道黏膜屏障，提高腸道定植抗力，抑制潛在致病菌過度增長，調(diào)節(jié)全身免疫功能等達到對肝臟的保護和治療作用［8］。2015年耶魯∕哈佛研討會“益生菌的應用共識意見”首次增加了益生菌在肝臟疾病中的應用，包括兒童非酒精性脂肪肝、肝性腦病和酒精性脂肪肝等［1］。本研究選用的復方嗜酸乳桿菌片為臨床常用益生菌，主要包括枯草桿菌、糞鏈球菌、日本株嗜酸乳桿菌、中國株嗜酸乳桿菌。研究發(fā)現(xiàn)，給予益生菌干預后，膽汁淤積大鼠血清TBiL、DBiL、TBA、ALT 和AST 水平明顯降低，與黃方等［9］研究結(jié)論一致，說明益生菌可減輕膽汁淤積性肝病的肝臟損傷，改善膽汁淤積癥狀，促進肝功能恢復。

腸道菌群失衡、腸道細菌和內(nèi)毒素易位是膽汁淤積導致內(nèi)毒素血癥和多器官功能衰竭的病理過程。內(nèi)毒素血癥對肝臟的損傷是由一系列的氧化應激與炎癥反應所造成［10］。SOD 和MDA 是機體最常見的兩類氧化應激指標，SOD 是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，主要作用為清除體內(nèi)多余的自由基，防止自由基發(fā)生脂質(zhì)過氧化，其活力的高低代表機體清除氧自由基的能力；MDA 是過氧化反應的產(chǎn)物，高低可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度［11］。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組MDA 含量升高，SOD 降低；給予益生菌干預后不僅可顯著增強SOD 活性，并且明顯降低肝臟MDA含量。提示ANIT 誘導的膽汁淤積性肝病與ANIT誘導產(chǎn)生的氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)，而益生菌可減輕內(nèi)毒素血癥，抑制氧化應激反應，最終起到改善膽汁淤積的作用。

TLR4 屬于細胞表面信號轉(zhuǎn)導跨膜受體，負責先天性免疫和炎癥反應，廣泛表達于多種肝臟細胞如肝細胞、肝枯否細胞、肝星狀細胞及肝樹突狀細胞等，參與介導肝臟炎癥或免疫調(diào)節(jié)等復雜免疫反應，在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［12-13］。TLR4 是激活脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，也稱為內(nèi)毒素）信號轉(zhuǎn)導的受體，LPS 通過與TLR4 結(jié)合激活細胞內(nèi)信號通路、釋放各種炎癥因子等引起肝損傷［14］。NF-κB 是細胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控下游多種基因的表達參與細胞的生長發(fā)育、炎癥反應、免疫調(diào)節(jié)和細胞凋亡等過程。NF-κB 信號通路受多種上游信號分子刺激而激活，TLR4 就是其中之一。TLR4 誘導NF-κB 激活轉(zhuǎn)移至胞核后可促進IL-6、IL-8、IL-12、IL-1β 及TNF-α 等細胞因子釋放，這些炎癥因子表達過量又可正反饋作用于NF-κB，繼而加重炎癥反應、加重肝組織的損傷［15-16］。LI 等［17］研究發(fā)現(xiàn)TLR4∕NF-κB 信號通路與非酒精性脂肪肝發(fā)病及進展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，益生菌能明顯抑制膽汁淤積大鼠TLR4、NF-κB 表達，降低TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平。提示益生菌可能通過糾正腸道菌群紊亂，減輕腸道通透性及內(nèi)毒素血癥，下調(diào)TLR4 表達，抑制NF-κB 激活，抑制TLR4∕NF-κB 信號通路，進而下調(diào)TNF-α、IL-1β 及IL-6 的釋放，減輕肝臟炎性反應，最終發(fā)揮保護肝臟及促進肝臟功能的恢復的作用。益生菌處理的正常大鼠肝功能各指標正常，提示在此治療劑量下，未發(fā)現(xiàn)益生菌有肝損傷的不良反應；TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β 表達與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，進一步證明在健康肝臟中TLR 的表達水平較低，沒有TLR4∕NF-κB 信號通路的激活，從而維持機體對內(nèi)毒素的不敏感性，這與既往報道［18］一致。

綜上所述，TLR4∕NF-κB 通路是肝臟組織炎癥反應的關(guān)鍵通路，益生菌可通過抑制TLR4∕NF-κB信號通路的活化，抑制肝臟炎癥瀑布級聯(lián)反應的啟動及氧化應激反應，從而發(fā)揮對肝內(nèi)膽汁淤積性肝病的治療作用，具有良好的安全性和耐受性。但對于益生菌作用于TLR4∕NF-κB 通路的上游調(diào)控機制，尚有待于進一步研究。