聶鈺君 侯燕 錢丹

湖北文理學院附屬醫(yī)院襄陽市中心醫(yī)院（湖北襄陽 441021）

急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leu?kemia，ALL）是兒童發(fā)病率第一位的惡性腫瘤，占兒童白血病的70%，部分具有遺傳傾向［1-2］，多采用化療，5年無病生存率已達80%以上，但有少部分患兒難治或復發(fā)甚至死亡［3］，因此迫切需要探究新的療法提高ALL 的臨床療效?，F(xiàn)有多種治療癌癥的新方法，如多藥聯(lián)合化療、靶向治療、生物治療等［4］，其中，溶瘤病毒治療是近年來發(fā)展的新的生物療法。溶瘤病毒是基因工程病毒或天然存在的病毒，可以選擇性復制并殺死癌細胞而不損害正常組織［5］，這為腫瘤惡性細胞的特異性和靶向選擇治療提供了可能［6］。據(jù)報道，麻疹病毒對兒童B 系ALL 療效顯著［7］，新城疫病毒可抑制ALL 細胞的增殖［8］，呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）與他們同屬副粘病毒家族，但RSV 在白血病鮮有報道。因此，本研究采用MTT、FCM、RT?PCR、Western blot 等方法評估感染RSV后Jurkat 細胞的增殖及凋亡情況，以探究其可能的溶瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料RSV?A2 株及Jurkat 細胞來源于ATCC，MTT 購自美國MedChem Express，TRIzol 來自科瑞生物制品有限公司，M?MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR 試劑盒、引物購自上海Invitrogen，Taq DNA聚合酶購自Fermentas，細胞蛋白裂解液、BCA 蛋白檢測試劑盒及ECL 化學發(fā)光試劑盒均購自碧云天生物公司，cleaved?Caspase?8 單抗購自上海MACK?LIN，其余抗體均購自上海Abcam。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)Jurkat 細胞采用含雙抗（青霉素100 U/mL、鏈霉素0.1 mg/mL）及10%胎牛血清RP?MI?1640 培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗用細胞均處于對數(shù)生長期。

1.2.2 病毒感染細胞在12 孔板中接種Jurkat 細胞，待匯合度達60%時每孔加入1×107PFU/mL 病毒液60 μL（MOI 3），吸附1 h 后再加入含10%胎牛血清的RPMI?1640 培養(yǎng)液900 μL，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于RSV 感染后3、6、12、24 h收集細胞，通過qRT?PCR 檢測RSV?NS2 mRNA 的表達來確認RSV 是否感染Jurkat 細胞。

1.2.3 MTT 實驗收集Jurkat 細胞并調(diào)濃度為5×105/mL，取96 孔板，每孔接種細胞180 μL，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。每孔加入RSV 1×107PFU/mL 病毒液10 μL（MOI 3），設未感染的細胞作為空白對照。培養(yǎng)不同時間后，每孔加入20 μL（濃度為5 g/L）MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔加入100 μL DMSO，振蕩混勻后培養(yǎng)20 h。在酶聯(lián)免疫檢測儀上讀取波長為570 nm處的吸光度值（A值）。實驗組細胞的相對增殖水平=A（實驗孔）/A（陰性對照），實驗重復3 次。

1.2.4 克隆形成實驗RSV 感染Jurkat 細胞后，將細胞以200 個/孔密度接種于6 孔板中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 d，用PBS 小心洗滌細胞3 次，甲醇固定20 min，Giemsa 染液染色20 min，流水緩慢洗去染色液。鏡下計數(shù)大于50 個細胞的克隆數(shù)。

1.2.5 FCM 檢測凋亡細胞接種于24 孔板，RSV作用Jurkat 細胞12、24、48 h 后，收集2×105細胞經(jīng)PBS 洗滌后用Annexin 2V 2FITC（215 μg/mL）和PI（10 μg/mL）染色，避光作用10 min 后，在流式細胞儀上檢測凋亡細胞，實驗均設3 復孔。

1.2.6 Western blot 實驗采用細胞蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，10%SDS?PAGE 凝膠電泳，至marker 出現(xiàn)清晰條帶停止電泳。200 mA 轉(zhuǎn)3 h 至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫搖床封閉2 h，一抗cleaved?Caspase?3（1∶500）、cleaved?Caspase?8（1∶1 000）、cleaved?Caspase?9（1∶1 000）、Bcl2（1∶1 000）、TRAF6（1∶2 000）、p?NF?κB（1∶2 000）、NF?κB（1∶2 000）及GAPDH（1∶2 500）4 ℃孵育過夜，羊抗兔二抗（1∶2 500）室溫搖床孵育90 min，TBST 洗膜后采用ECL 化學發(fā)光法壓片、顯影、定影。膠片采用GDS?8000 型凝膠成像系統(tǒng)進行灰度掃描，以目的條帶與GAPDH 灰度比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.2.7 qRT?PCR 實驗25 μL 的PCR 反應體系含有2 μL 逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物、10 μmol/L 特異引物各1 μL 以及0.5 μL TaqDNA 聚合酶，反應在DNA 擴增儀上進行：95 ℃變性2 min，擴增條件為95 ℃30 s，退火溫度72 ℃1 min，循環(huán)35 次。用GAPDH作為RSV?NS2 和TRAF6 的內(nèi)部參照，目的基因的相對表達量以與GAPDH 的比值計算，實驗重復3 次。目的基因的引物序列見表1。

表1 qRT?PCR 目的基因的引物序列Tab.1 Primer sequence of qRT?PCR target gene

1.3 統(tǒng)計學方法應用GraphPad Prism 8 軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。多因素比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RSV 感染Jurkat 細胞將RSV 感染對數(shù)生長期Jurkat 細胞，感染3、6、12、24 h 后收集細胞，采用qRT?PCR 檢測RSV 是否感染Jurkat 細胞。結(jié)果顯示，Jurkat 細胞內(nèi)RSV?NS2 表達隨時間延長而增強，6 h表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。

2.2 RSV抑制Jurkat細胞增殖RSV感染Jurkat細胞3、6、12、24 h 后收集細胞，采用MTT 檢測Jurkat細胞增殖，結(jié)果顯示Jurkat 細胞的增殖能力從6 h后顯著下降，呈時間依賴性（P<0.05，圖1A）。RSV 感染Jurkat 細胞后12 d，克隆形成實驗顯示Jurkat 細胞的克隆數(shù)明顯減少（P<0.05，圖1B）。

圖1 RSV 抑制Jurkat 細胞的增殖Fig.1 RSV inhibited the proliferation of Jurkat cells

2.3 RSV 促進Jurkat 細胞凋亡將RSV 感染對數(shù)生長期Jurkat 細胞，12、24、48 h 后收集細胞，流式細胞術結(jié)果顯示RSV 感染后，Jurkat 細胞的凋亡水平逐漸上升，有時間依賴性（P<0.05，圖3A）。Western blot 結(jié)果顯示，cleaved Caspase?3 和cleaved Caspase?9 的表達均顯著增加，Bcl2 的表達明顯減少，呈時間依賴性（P<0.05，圖3B），cleaved Cas?pase?8 的表達無明顯改變。

圖2 RSV 促進Jurkat 細胞的凋亡Fig.2 RSV promoted the apoptosis of Jurkat cells

2.4 RSV 抑制TRAF6/NF?κB 通路活化RSV 感染Jurkat 細胞12、24、48 h 后收集細胞，qRT?PCR 結(jié)果顯示RSV 顯著抑制了TRAF6 的表達，有時間依賴性（P<0.001）。Western blot 的實驗結(jié)果顯示，TRAF6 和p?NF?κB 的表達隨感染時間的延長而降低（圖3）。

圖3 RSV 抑制TRAF6/NF?κB 通路的活化Fig.3 RSV inhibited the activation of TRAF6/NF?κB pathway

3 討論

ALL 作為兒童時期最常見的惡性血液?。?］，5年無病生存率已達80%以上，但仍有少部分患兒復發(fā)。溶瘤病毒是近年來研究較多的生物療法，已有報道證實麻疹病毒、新城疫病毒均對白血病細胞有抑制作用，但RSV對白血病細胞的作用尚未明確。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，RSV 可誘導前列腺癌細胞［10］、肝癌細胞［11］、皮膚癌細胞［12］、肺癌細胞［13］凋亡，提示RSV 可誘導多種腫瘤細胞凋亡，但關于RSV 是否誘導白血病細胞凋亡鮮有報道，其機制尚未明確。本研究選擇Jurkat 細胞［14］為研究對象，探索RSV 對Jurkat 細胞的作用及可能的分子機制。

研究顯示RSV 編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NS2 參與RSV 作用的過程［15］，因此，本研究采用qRT?PCR 檢測RSV?NS2 mRNA 的表達來確認RSV 是否感染Jurkat 細胞。研究結(jié)果顯示，Jurkat 細胞在感染后3 h 內(nèi)RSV?NS2 表達開始出現(xiàn)，6 h 明顯增高，隨時間延長，RSV?NS2 RNA 在Jurkat 細胞中的表達逐漸增多，提示RSV 可感染Jurkat 細胞。

眾所周知，細胞增殖［16］和細胞凋亡［17］是評價細胞生長的重要指標，因此，本研究采用以下方法評估RSV 對Jurkat 細胞的作用。本實驗MTT 及克隆形成實驗結(jié)果顯示Jurkat 細胞的增殖能力下降，克隆數(shù)明顯減少，提示RSV 抑制了Jurkat 細胞增殖。FCM 結(jié)果顯示RSV 感染后Jurkat 細胞的凋亡率呈時間依賴性上升，說明RSV 感染Jurkat 細胞后細胞凋亡增加。Western blot 的結(jié)果提示RSV 大部分通過Caspase?3、9 和Bcl2 通路誘導Jurkat 細胞凋亡。

腫瘤壞死因子受體相關因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）是腫瘤壞死因子超家族和Toll 樣受體超家族的重要結(jié)合蛋白［18］。另一方面，NF?κB 轉(zhuǎn)錄因子是免疫應答和應激反應以及細胞生長的關鍵調(diào)節(jié)因子，可通過與其他通路協(xié)調(diào)作用來影響細胞的增殖［19］。TRAF6 的激活啟動下游信號傳導，導致NF?κB 亞單位從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，促進相關基因表達，對細胞增殖和免疫應答起正反饋調(diào)節(jié)［20］。抑制TRAF6 泛素連接酶活性，對NF?κB 激活和自噬功能的TLR4 信號進行負性調(diào)節(jié)，如殺菌活性、癌細胞遷移及侵襲［21］。有研究顯示TRAF6 通過激活TRAF6?NF?κB/AP?1 信號通路，促進大腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移［22］。TLR3 或TLR4 激活誘導的自噬通過促進TRAF6 泛素化增強各種細胞因子的產(chǎn)生，從而促進肺癌細胞的遷移和侵襲［23-26］。本研究發(fā)現(xiàn)RSV 感染Jurkat 細胞12 h 以后，TRAF6 和p?NF?κB 的表達隨感染時間的延長而減弱，說明RSV 感染抑制了TRAF6/NF?κB的表達，因此，筆者推斷RSV 通過TRAF6/NF?κB 通路抑制Jurkat 細胞的增殖。然而，RSV 影響Jurkat細胞的其他機制還有待進一步的探究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RSV感染對Jurkat細胞具有抑制作用，這種作用可能通過抑制TRAF6/NF?κB 信號通路的活化實現(xiàn)的。如能在動物實驗中加以驗證，探明RSV 致瘤體細胞凋亡機制，將為白血病的溶瘤治療提供理論基礎。