李 媛，范芳芳，張敏娟，張利娟，康 婕

陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，陜西西安 710048

0 引言

維生素D是一種脂溶性維生素，不易溶于水，易溶于乙醇等有機(jī)溶劑。維生素D可促進(jìn)人體鈣、磷吸收，皮膚細(xì)胞生長、分化及調(diào)節(jié)免疫功能，主要有維生素D2（麥角鈣化醇）和維生素D3（膽鈣化醇）兩種活性形式。維生素D缺乏會導(dǎo)致人體出現(xiàn)佝僂病、骨質(zhì)軟化癥，嬰幼兒、孕婦、中老年等人群是缺乏維生素D的高危人群，要增加維生素D供給量到每天10 μg（相當(dāng)于400 IU）[1～5]。

為此，嬰幼兒配方乳粉和功能乳粉均對維生素D的含量進(jìn)行了強(qiáng)化，準(zhǔn)確測定乳粉中維生素D的含量則成為質(zhì)量控制中的一個重要環(huán)節(jié)。目前，常用的檢測方法為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6～9]和高效液相色譜法[10～12]?？紤]到乳粉的基質(zhì)復(fù)雜，同位素內(nèi)標(biāo)價格較昂貴，本文采用半制備-高效液相色譜法建立了一種乳粉中維生素D2和D3的測定方法，為日常檢測分析提供借鑒。

1 試驗方法

1.1 儀器與試劑

LC-20AR半制備正相高效液相色譜儀（配紫外可見光檢測器）、LC-20ADXR反相高效液相色譜儀（配紫外可見光檢測器），島津（上海）實驗器材有限公司；MultiVortex-12渦旋混合器，廣州得泰儀器科技有限公司；WE-3水浴恒溫振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司；H1750R臺式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；FV64氮吹儀，廣州得泰儀器科技有限公司）；Vortex-Genie 2漩渦混合器，美國SI儀器公司；UPH-Ⅲ-20T純水機(jī)，四川優(yōu)普超純科技有限公司。

維生素D2和D3標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.60%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；無水乙醇（色譜純）、甲醇（色譜純），德國默克公司；正己烷（色譜純），賽默飛世爾科技公司；抗壞血酸（分析純）、氫氧化鉀（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗用水均為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液

準(zhǔn)確稱取維生素D2標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用無水乙醇溶解并定容于100.00 mL棕色容量瓶，制成100.00 μg/mL維生素D2標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃冰箱中密封保存。準(zhǔn)確稱取維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用無水乙醇溶解并定容于100.00 mL棕色容量瓶，制成100.00 μg/mL維生素D3標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃冰箱中密封保存。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)中間液

準(zhǔn)確吸取維生素D2標(biāo)準(zhǔn)儲備液10.00 mL，用甲醇稀釋并定容于100.00 mL棕色容量瓶，制成10.00 μg/mL維生素D2標(biāo)準(zhǔn)中間液。準(zhǔn)確吸取維生素D3標(biāo)準(zhǔn)儲備液10.00 mL，用甲醇稀釋并定容于100.00 mL棕色容量瓶，制成10.00 μg/mL維生素D3標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液

分別準(zhǔn)確吸取維生素D2和D3標(biāo)準(zhǔn)中間液0.02 mL、0.04 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、1.00 mL于10.00 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋成0.02 μg/mL、0.04 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.40 μg/mL、1.00 μg/mL維生素D2和D3混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 皂化

稱取2.00 g（精確至0.01 g）混合均勻的固體試樣于50.00 mL具塞離心管中，加入0.40 g抗壞血酸，加入6.00 mL約40 ℃溫水，渦旋混勻1.00 min。加入12.00 mL乙醇，渦旋混合30 s，再加入6.00 mL氫氧化鉀溶液（50.00 g氫氧化鉀加入50.00 mL水溶解），渦旋混勻30 s后放入水浴恒溫振蕩器中，60 ℃避光水浴振蕩30.00 min（如樣品組織較為緊密，可每隔5.00～10.00 min取出渦旋30 s），取出后立即用冷水冷卻至室溫。

1.3.2 提取

冷卻后的皂化液中加入20.00 mL正己烷，渦旋提取3.00 min，在4 ℃冷凍離心機(jī)中6 000 r/min離心5.00 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一50.00 mL離心管中，加入25.00 mL水，輕微晃動30 次，6 000 r/min冷凍離心5.00 min，取上層有機(jī)相備用。

1.3.3 濃縮

取10 mL上述有機(jī)相至10 mL氮吹管中，40 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1.00 mL正己烷，振蕩溶解殘渣，過0.22 μm有機(jī)濾膜，供半制備正相高效液相色譜儀進(jìn)行半制備，凈化待測液。

1.4 色譜條件

1.4.1 半制備正相高效液相色譜條件

色譜柱：GL SciencesInertsilSIL-100A硅膠柱，4.6 mm×250.0 mm，5 μm；流動相：環(huán)己烷+正己烷（1+1），并按體積分?jǐn)?shù)0.80%加入異丙醇；流速：1 mL/min；波長：264 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：500 μL。

1.4.2 半制備凈化

取維生素D2和D3混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液各1.00 mL于10.00 mL氮吹管中，按1.3.3步驟濃縮復(fù)溶，將標(biāo)準(zhǔn)待測液100 μL注入正相高效液相色譜儀測定，確定維生素D保留時間為18.84 min。然后將標(biāo)準(zhǔn)待測液500 μL注入正相高效液相色譜儀，并在18.00～20.00 min收集維生素D餾分于試管中，再將樣品待測液500 μL按照上述步驟收集餾分于試管中，40 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑瑴?zhǔn)確加入1.00 mL甲醇，振蕩溶解殘渣，供反相高效液相色譜儀測定。

1.4.3 反相高效液相色譜參考條件

色譜柱：Omni Bond Orca C18柱，4.6 mm×250.0 mm，5 μm；流動相：甲醇；流速：1 mL/min；檢測波長：264 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：100 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

維生素D極性較弱，且和水不相容，同時考慮到乳粉基質(zhì)復(fù)雜，富含脂肪和蛋白質(zhì)，所以本方法在提取過程中選用正己烷為提取溶劑，4 ℃低溫冷凍離心。為減少凈化過程中的損失，本方法在半制備時將配好的維生素D2和D3混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液各取1.00 mL，40 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，加?.00 mL正己烷溶解殘渣，過0.22 μm有機(jī)濾膜后同樣品溶液同步半制備凈化處理。這種前處理的方法簡便快速、回收率高（平均加標(biāo)回收率＞90.00%），可以滿足實際檢測要求。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

維生素D2和D3屬于固醇類衍生物，具有相同的化學(xué)性質(zhì)，在正相高效液相色譜儀中無法分離，需在反相高效液相色譜儀中將其分離。因此，本方法選用了Waters XBridge C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）、Omni Bond Orca C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）、GL SciencesInertsil ODS-3 C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）三種色譜柱。結(jié)果表明，Omni Bond Orca C18柱對維生素D2和D3有較好的保留和分離效果。同時對100%甲醇、甲醇+水（95.00%+5.00%）、甲醇+乙腈（90.00%+10.00%）三種流動相進(jìn)行了試驗，確定100%甲醇時保留時間合適、分離效果較好。使用該優(yōu)化條件的標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的色譜圖見圖1和圖2。

圖1 維生素D標(biāo)準(zhǔn)溶液正相反相色譜圖

圖2 樣品中維生素D正相反相色譜圖

2.3 線性范圍和檢出限

將半制備凈化所得濃度為0.01 μg/mL、0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL維生素D2和D3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入反相高效液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。維生素D2的線性回歸方程為y=306088x - 1104.10，相關(guān)系數(shù)為0.999 6；維生素D3的線性回歸方程為y=307579x - 674.92，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。結(jié)果表明，在0.01～0.50 μg/mL范圍內(nèi)線性較好。當(dāng)稱樣量為2.00 g時，以3 倍信噪比計算，維生素D2或D3的檢出限為0.7 μg/100 g，定量限為2.00 μg/100 g，能滿足乳粉中維生素D的分析要求。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

對中國檢驗檢疫科學(xué)研究院（中檢院）和英國政府化學(xué)家實驗室（LGC）乳粉中維生素D的質(zhì)控樣品按本方法進(jìn)行檢測，每個質(zhì)控樣測定6 次，結(jié)果如表1所示。中檢院質(zhì)控樣特性值區(qū)間5.68～8.92 μg/100 g，LGC特性值區(qū)間6.20～16.20 μg/100 g，所有測定結(jié)果都在特性值范圍內(nèi)?！禛B/T 27404—2008 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》[13]中指出被測組分含量為100 μg/kg時，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（變異系數(shù)）應(yīng)小于15.00%；真值含量為0.010～10.000 mg/kg時，測定含量平均值與真值的偏差范圍應(yīng)在-20.00%～+10.00%。質(zhì)控樣品測試結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對誤差均滿足該標(biāo)準(zhǔn)要求，本方法測量結(jié)果準(zhǔn)確、精密度高。

表1 維生素D質(zhì)控樣品測定結(jié)果

2.5 實際樣品檢測和加標(biāo)回收率

利用本方法對市場銷售的5 種乳粉（嬰兒配方乳粉、較大嬰兒配方乳粉、幼兒配方乳粉、孕婦乳粉、中老年乳粉各1 罐）中的維生素D進(jìn)行檢測，并對其進(jìn)行加標(biāo)試驗，維生素D2和D3的添加含量均為2.00 μg/100 g、4.00 μg/100 g、6.00 μg/100 g、8.00 μg/100 g、10.00 μg/100 g，樣品結(jié)果和加標(biāo)回收率結(jié)果如表2所示。5 種乳粉均未檢出維生素D2，其加標(biāo)回收率在89.50%～98.70%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.33%～8.26%；維生素D3的加標(biāo)回收率在88.17%～95.90%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.61%～8.81%。

表2 樣品檢測和加標(biāo)回收率試驗結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了一種乳粉中維生素D2和D3含量的半制備-高效液相色譜測定方法。本方法的樣品前處理的方法簡便快速、回收率高，測定結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，方法定量限及精密度均能滿足實際檢測要求，為乳粉中維生素D含量的質(zhì)量控制和安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。