劉 湘 肖紅云 陳舒華

1 廣東省佛山市第二人民醫(yī)院 528000； 2 邵陽市中心醫(yī)院

鼻咽癌是指惡性腫瘤位置位于鼻咽腔頂部或側(cè)壁的疾病類型，惡性腫瘤發(fā)病類型統(tǒng)計中，在我國該類癌癥屬于高發(fā)性癌癥類型[1]。臨床治療過程中發(fā)現(xiàn)，由于其病理學特征及疾病位置的特殊性，放療是首選的治療辦法。但是在治療過程中的臨床觀測情況了解可知，單純的放射治療對早期鼻咽癌有良好的治療效果，但對病情發(fā)展到一定程度的鼻咽癌臨床療效并不理想，而且會帶來嚴重的放射治療損傷作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌高癌家系與遺傳存在密切關(guān)聯(lián)，且高癌家系鼻咽癌患者多表現(xiàn)為氣虛質(zhì)、復(fù)合質(zhì)和失調(diào)熱質(zhì)，而散發(fā)性鼻咽癌表現(xiàn)為復(fù)合質(zhì)和氣虛質(zhì)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)Annexin A7和RhoGDIβ的表達與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有明顯關(guān)聯(lián)[4]。中醫(yī)中鼻咽癌屬于“氣虛染毒”，此學說已在動物實驗中驗證，但臨床實驗報道較少，因此本文對高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌組織中的RhoGDIβ進行鑒定，觀察其特定病理意義及蛋白質(zhì)組分RhoGDIβ的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗標本 選取2019年11月—2020年11月我院耳鼻咽喉科高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌組織標本、散發(fā)氣虛質(zhì)鼻咽癌組織標本和正常組織標本，每組標本各收集6例。納入者資料完整，且高癌家系中確定兩代人中有3個以上家族成員患癌癥，2個以上患鼻咽癌。納入者均未接受過放化療和均無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且未分化非角化性鱗狀細胞癌；依據(jù)2008鼻咽癌分期標準確診[5]。初診鼻咽癌患者年齡在18～69歲，無嚴重系統(tǒng)性疾病和傳染病，精神意識正常，非月經(jīng)期，排除哺乳期和孕期者。鼻咽組織取出放入-80℃冰箱保存。

1.2 實驗方法 應(yīng)用oligo7.0軟件和參照相關(guān)文獻進行設(shè)計引物，采用BLAST檢索確認引物的特異性，并使用BioEdit軟件進行序列分析比較，RhoGDIβ引物序列：F:5’-GACTTCCTTCCTGTTCTAACTGC-3’，R:5’-CAGTGCTTCACGTCTCTGTCC-3’，產(chǎn)物長度82bp；β-actin引物序列：F:5’-ACCGGAACGGAGCTATGAAC-3’，R:5’-ATCCCACTGGACTCAATGCC-3’，產(chǎn)物長度116bp。

1.3 檢測方法 實驗使用的離心管均經(jīng)無菌無酶處理，勻漿器物品使用0.1%的DEPC溶液進行浸泡37℃過夜，并于126℃下滅菌30min，總RNA提取根據(jù)RNeasy MiniKit試劑盒說明嚴格操作。逆轉(zhuǎn)錄CADNA：參照Thermo Scientific RevertAid Firt Stran cDNA Synthesis Kit試劑盒進行嚴格操作。將試劑盒中各組組分混勻離心，離心后放于冰上，在放置于冰上無菌無核核酸酶的PCR管中。PCR反應(yīng)液配置參照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明進行操作，反應(yīng)體系為25μl，操作時均在冰上進行充分混勻試劑。Westernm blotting法：將總蛋白提取，每組稱重100mg，加入預(yù)冷蛋白裂解液1ml，放于冰上玻璃勻漿器中勻漿至透明無顆粒后分別轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5ml的EP管，4℃，10 000r/min離心5min，轉(zhuǎn)移至上清液并重新預(yù)冷至1.5ml EP管中，放于-80℃下保存。BCA法蛋白：根據(jù)BCA試劑盒說明操作，并采用蛋白標準曲線檢測蛋白濃度。Westernm blotting蛋白免疫印跡結(jié)果分析采用Alpha View SA凝膠圖像進行分析，并分析其光密度值，觀察蛋白光度值與內(nèi)參光度值的比值，并判斷目的蛋白的含量。

2 結(jié)果

2.1 RhoGDIβ Real Time PCR檢測結(jié)果 Real Time PCR分析表達使用2-ΔΔCt值相對量法推算樣本中RhoGDIβcDNAd的模板起始量，內(nèi)參基因使用β-actin；將正常鼻咽組織設(shè)為正常組，觀察高癌家系和散發(fā)氣虛質(zhì)鼻咽癌組中RhoGDIβ的基因表達情況。結(jié)果顯示高癌家系鼻咽癌組中的RhoGDIβ表達量是正常組的0.88倍和3.01倍，而散發(fā)性鼻咽癌組的RhoGDIβ表達無明顯變化。采用單因素方差分析正常組RhoGDIβ基因表達與散發(fā)性鼻咽癌組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；正常組與高癌家系鼻咽癌組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；高癌家系鼻咽癌組與散發(fā)性鼻咽癌組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1～2、圖1～2。

表1 觀察3組RhoGDIβ mRNA的表達差異

圖1 RhoGDIβ mRNA在正常組、散發(fā)性鼻咽癌組及高癌家系鼻咽癌組中的表達情況

表2 觀察3組RhoGDIβ mRNA相對表達

圖2 RhoGDIβ mRNA在正常組、散發(fā)性鼻咽癌組及高癌家系鼻咽癌組中的相對表達

2.2 Western blotting檢測結(jié)果 采用兔抗人RhoGDIβ抗體作為1抗，β-actin作為內(nèi)參蛋白，對3組中的RhoGDIβ蛋白表達進行檢測，檢測顯示內(nèi)參蛋白β-actin在3組鼻咽組織中均有表達(P>0.05)，見圖3。RhoGDIβ蛋白與β-actin的OD比較發(fā)現(xiàn)，正常組RhoGDIβ蛋白相對表達量為1.01±0.28，散發(fā)性鼻咽癌組為0.29±0.18，高癌家系鼻咽癌組為3.15±1.13，3組蛋白表達結(jié)果經(jīng)方差分析比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=18.110，P=0.000<0.01)。組間兩兩比較顯示，正常組高于散發(fā)性鼻咽癌組(P=0.011)，但低于高癌家系鼻咽癌組(P=0.015)散發(fā)性鼻咽癌組低于高癌家系鼻咽癌組(P=0.006)。即高癌家系鼻咽癌組織中表達明顯上調(diào)，而散發(fā)性鼻咽癌組則下調(diào)。見圖4。

圖3 RhoGDIβ蛋白Western blotting蛋白免疫印跡結(jié)果

圖4 RhoGDIβ蛋白在正常組、散發(fā)性鼻咽癌組及高癌家系鼻咽癌組中的相對表達

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)早期采用蛋白組學鑒定高癌家系鼻咽癌組織中的RhoGDIβ蛋白表達較其他蛋白質(zhì)表達更加明顯，但蛋白組學法自身存在明顯不足[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)氣虛體質(zhì)與鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展存在明顯關(guān)聯(lián)，且RhoGDIβ與癌細胞的生長、分化、發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等存在密切關(guān)聯(lián)[8-9]。RhoGDIβ可能屬于癌基因的產(chǎn)物，可能受抑癌基因和癌基因的調(diào)控，或通過某種方式而激活癌基因[10-11]。目前關(guān)于RhoGDIβ蛋白表達的情況多于細胞轉(zhuǎn)移、淋巴組織的分布和細胞凋亡等有關(guān)，且實驗證實RhoGDI2可持續(xù)性激活Racl/cdc42GTPases，從而起到促進細胞轉(zhuǎn)移[12-13]。研究顯示RhoGDIβ蛋白可促進胃癌細胞的生長和發(fā)展，且RhoGDI2過表達癌細胞中的B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)的基因明顯上調(diào)，Bcl-2在RhoGDI2過表達中對順鉑的耐藥性起到了中介作用[14-15]。RhoGDIβ蛋白不僅在胃癌中有表達，在結(jié)直腸癌、膀胱癌和乳腺癌中均有表達。

本文通過PCR檢測RhoGDIβ在散發(fā)氣虛質(zhì)鼻咽癌和高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌組織中的表達情況，顯示RhoGDIβRNA在高癌家系組中的表達明顯較正常組和散發(fā)性鼻咽癌組上調(diào)，而正常組與散發(fā)性鼻咽癌組經(jīng)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，本研究認為可能與散發(fā)性鼻咽癌組中的RhoGDIβ表達對人體無影響，且推測散發(fā)性鼻咽癌組中的RhoGDIβ受Etsl的調(diào)節(jié)，從而表現(xiàn)出了雙重作用，最終導致RhoGDIβ表達與正常組無明顯差異。本文發(fā)現(xiàn)，RhoGDIβ RNA在高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌組織中的表達明顯上調(diào)，而根據(jù)相關(guān)文獻研究發(fā)現(xiàn)高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌組織中可能存在遺傳缺陷，加上氣虛可能對DNA有明顯影響，導致?lián)p傷修復(fù)基因發(fā)生變化。Western blotting法檢測發(fā)現(xiàn)RhoGDIβ可能與高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌患者存在明顯正相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)RhoGDI2的高表達促進了高癌家系氣虛質(zhì)鼻咽癌患者的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)RhoGDI2蛋白促進了CRC細胞增殖和轉(zhuǎn)移，部分通過信號通路激活了PI3K/AKt。研究提示檢測鼻咽癌組織中RhoGDIβ的表達情況可能對早期診斷和分子靶向治療起到了重要意義。

綜上所述，實驗證實RhoGDIβ屬于本課題早期鑒定出的表達蛋白，在高癌家系氣虛鼻咽癌患者中RhoGDIβ存在明顯高表達作用，可作為早期診斷和篩查的重要標記物。