韓巖松，鄭 鋅，黃均明，保萬魁，劉紅芳，劉 蜜，王 旭*

［1．中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；2．島津企業(yè)管理（中國）有限公司北京分公司，北京 100020］

目前，中國是全球最大的抗生素生產國和消費國，同時也是全球細菌耐藥最嚴重的國家之一［1］。據(jù)統(tǒng)計，國內抗生素每年總產量大約為21 萬t，消費量約18 萬t，其中用于畜牧及飼料行業(yè)的抗生素就有60 多種，高達9.7 萬t，約占消費總量的54%［2-3］。畜禽攝入的抗生素有30%～90%以原藥或代謝產物的形式排出體外，2013 年中國畜禽養(yǎng)殖使用抗生素總量接近10 萬t，估計畜禽排泄的抗生素達到5 萬多t［4-5］。排泄的抗生素隨著糞便進入農田［6］，導致土壤抗生素污染［7］，且土壤中多種抗生素會產生加和、協(xié)同、拮抗等交互作用，對土壤中的植物、動物、微生物產生的復合污染毒性效應，導致土壤中多種抗生素復合污染［8-11］。在畜禽糞便肥料化利用過程中，抗生素會被不同程度地降解或消減。堆肥化處理技術通過生物作用和非生物作用實現(xiàn)抗生素的有效降解，是目前畜禽糞便無害化和資源化處理的主要方式，包括好氧堆肥、高溫堆肥及厭氧消化3 種［12-23］。

有研究表明，磺胺類、四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素是畜禽養(yǎng)殖中最為常用的幾類抗生素，這些飼用抗生素若隨排泄物進入農田后，可被長期累積，進而對耕地質量、農產品安全、人類和動物健康等造成很大危害［24-33］。然而，目前我國畜禽糞污中抗生素的檢測標準相當薄弱，部分研究只針對四環(huán)素類及大環(huán)內酯類含量進行檢測，而對磺胺類、喹諾酮類的測定近乎空白［34-40］。抗生素的檢測方法有微生物法［41-42］、生物傳感法［43-44］、酶聯(lián)免疫法［45-48］、液 相 色 譜 法［49-53］、液 相 色 譜-質 譜法［54-59］等。其中，微生物法和生物傳感法操作簡單、檢測效率高、成本低，但特異性差、靈敏度較低；酶聯(lián)免疫法前處理簡單、靈敏度高、分析速度快，但檢測結果會出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象；液相色譜法存在分析時間長、檢出限高等缺點；相比之下，液相色譜-質譜法（尤其是液相色譜-串聯(lián)質譜法）具有選擇性強、靈敏度和準確性高等優(yōu)點，特別適合基體復雜、抗生素含量低的樣品分析，現(xiàn)已成為抗生素的主流檢測方法。根據(jù)畜禽糞便樣品基體復雜等特點，建立液相色譜-串聯(lián)質譜法聯(lián)合測定方法研究有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑

所用試劑和溶液的配制，在未注明規(guī)格和配制方法時，均應按HG/T 3696 規(guī)定執(zhí)行。超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法用水為超純水。

甲醇：色譜純。乙腈：色譜純。正己烷：色譜純。鹽酸：優(yōu)級純。氫氧化鈉：分析純。

氫氧化鈉溶液：c（NaOH）= 0.01 mol/L。

磷酸氫二鈉溶液：c（Na2HPO4）= 0.2 mol/L。檸檬酸溶液：c（C6H8O7）= 0.1 mol/L。

Mcllvaine 溶液：將磷酸氫二鈉溶液與檸檬酸溶液按體積比5∶8 混合。

Na2EDTA-Mcllvaine 提 取 液：c（Na2EDTAMcllvaine）= 0.1 mol/L。稱取37.2 g 二水乙二胺四乙酸 二 鈉（Na2EDTA·2H2O）于1 L Mcllvaine 溶 液中，用HCl 或NaOH 調至pH 值為4.0。

甲醇溶液：φ（CH3OH）=15%。甲醇溶液：φ（CH3OH）=65%。

磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺噻唑（STZ）、磺胺吡啶（SPD）、磺胺甲基嘧啶（SM1）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺甲噻二唑（SMT）、磺胺對甲氧嘧啶（SMD）、磺胺氯噠嗪（SCP）、磺胺甲氧噠嗪（SMP）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（SDM′）、磺胺間二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺甲基異噁唑（SMZ）、磺胺二甲基異噁唑（SIZ）、苯甲?；前罚⊿B）、磺胺喹惡啉（SQ）、磺胺醋酰（SAA）、甲氧芐氨嘧啶（TMP）、磺胺苯吡唑（SPA）、金霉素（CTE）、四環(huán)素（TCY）、土霉素（OXY）、強力霉素（DOX）、依諾沙星（ENX）、氧氟沙星（OFX）、諾氟沙星（NOR）、培氟沙星（PEF）、環(huán)丙沙星（CIP）、洛美沙星（LOM）、達氟沙星（DAN）、恩諾沙星（ENF）、沙拉沙星（SAR）、雙氟沙星（DIF）、司帕沙星（SPX）單標儲備液：ρ= 100 mg/L。（購買經國家認證并授予標準物質證書的標準溶液物質，有效期2 個月）

34 種混合標準溶液：ρ= 1 mg/L。分別吸取單標儲備液0.1 至10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，于-20℃避光保存，有效期為1 周。

1.2 儀器

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀（LCMS-8045，日本島津）；冷凍干燥機（德國Christ Beta 2-8 LD plus）；漩渦混合器（艾卡IKA-MS3）；超聲波清洗機（YUYI）；離心機（8000 r/min）；旋轉蒸發(fā)儀（步琦BUCHI R-100）；固相萃取裝置；HLB 固相萃取柱：500 mg；電子天平（精度0.0001 g）。

1.3 供試樣品

樣品來源于收集的牛糞、羊糞、豬糞、雞糞以及肥料樣品共若干個（表1）。

表1 供試樣品信息

1.4 樣品前處理

本方法采用甲醇、Na2EDTA-Mcllvaine 提取液各10 mL 分2 次 提 取，超 聲10 min、離 心5 min，固相萃取流速3 ～5 mL/min 提取畜禽糞便中的抗生素。

1.4.1 試樣的制備

樣品經冷凍干燥后，縮分至約100 g，迅速研磨至全部通過0.5 mm 孔徑試驗篩（如樣品潮濕，可通過1.00 mm 試驗篩），混合均勻，置于潔凈、干燥容器中，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 試樣溶液的制備

稱取試樣0.5 ～1 g（精確至0.0001 g）置于50 mL 離心管中，加入Na2EDTA-Mcllvaine 提取液10 mL，渦旋混勻，再加入10 mL 甲醇，渦旋混勻，常溫超聲提取10 min，在4 ℃下8000 r/min 離心5 min，上清液轉移至棕色分液漏斗，固體部分重復提取一次，合并提取液，加入10 mL 正己烷去脂后，下層濾液過0.45 μm 微孔濾膜，將過膜后液體在旋轉蒸發(fā)儀（水浴溫度不超過40℃為宜）旋蒸至3 ～5 mL，用于凈化。

HLB 固相萃取柱使用前依次用5 mL 甲醇和5 mL 水活化。將以上提取液以3 ～5 mL/min 流速過柱，用5 mL 的15%甲醇溶液淋洗HLB 固相萃取柱并抽干，用10 mL 的65%甲醇溶液洗脫目標抗生素，洗脫液于旋轉蒸發(fā)儀旋蒸至近干，用流動相定容至1 mL，過0.22 μm 膜，上機待測。

1.5 儀器條件

1.5.1 液相色譜參考條件

色 譜 柱：Shim-pack GIST，2 μm，（2.1×100）mm，或者相當；流動相：由0.1%甲酸溶液（A）與乙腈（B）組成，梯度洗脫程序見表2。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

1.5.2 質譜參考條件

表2 梯度洗脫程序

離子化模式：電噴霧電離（ESI），正離子模式；接口電壓：4500 V；霧化氣：氮氣3.0 L/min；干燥氣：氮氣10 L/min；加熱氣：空氣10 L/min；碰撞氣：氬氣；DL 溫度：250℃；加熱模塊溫度：400℃；接口溫度：300℃；掃描模式：多反應監(jiān)測（MRM）模式，MRM 參數(shù)見表3；駐留時間：5 ms；延遲時間：3 ms。對于不同質譜儀器，儀器參數(shù)可能存在差異，測定前應將質譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。

1.6 基質匹配混合標準曲線的繪制

取若干份空白試樣，按1.4.2 步驟處理與凈化。然后用該空白試樣溶液和混合標準溶液配制成濃度為10 ～200 μg/L 基質匹配的混合標準系列溶液，供液相色譜-串聯(lián)質譜分析測定。該系列溶液需臨用現(xiàn)配。按濃度由低到高進樣檢測，以標準系列溶液質量濃度（μg/L）為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線?？筛鶕?jù)不同儀器靈敏度或樣品含量調整標準系列溶液的質量濃度。

1.7 試樣溶液的測定

1.7.1 定性

在色譜質譜條件下，分別對基質匹配的混合標準系列溶液和試樣溶液進行測定，34 種目標抗生素質譜選擇離子參數(shù)見表3。

表3 34 種抗生素MRM 優(yōu)化參數(shù)表

表3（續(xù)）

在相同實驗條件下進行樣品測定時，如果檢出色譜峰的保留時間與標準樣品相一致，偏差在2.5%之內；并且在扣除背景后的樣品質譜圖中，所選擇的離子均出現(xiàn)，而且所選擇的離子豐度與標準樣品的離子豐度相一致，偏差不超過表4 規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在該抗生素。

1.7.2 定量

表4 定性分析時相對離子豐度的最大允許相對偏差

采用基質匹配標準曲線校準、外標法定量。34種抗生素的基質匹配標準曲線的相關系數(shù)應不小于0.99。所測樣品中抗生素的響應值應均在該標準曲線的線性范圍內。若超出該線性范圍，則需減少試樣量重新實驗或將試樣溶液和基質匹配標準溶液做相應稀釋后重新測定。

2 結果與分析

2.1 實驗條件的確立

針對樣品前處理條件的優(yōu)化，分別考察了鮮羊糞、鮮牛糞、鮮豬糞、鮮雞糞、處理豬糞及處理雞糞樣品所需提取劑用量及提取次數(shù)、超聲時間及離心時間、固相萃取時液體流速對結果的影響。

2.1.1 抗生素提取劑用量及提取次數(shù)優(yōu)化

實驗采用甲醇、Na2EDTA-Mcllvaine 提取液各5 mL 分2、3 次提取與各10 mL 分2 次對S1 ～S6空白基質樣品進行提取實驗。空白基質樣品加標量為50 μg/L，每個樣品進行兩次平行測定，處理豬糞結果見圖1。

圖1 S4 空白基質34 種抗生素提取劑用量及提取次數(shù)優(yōu)化試驗

結果顯示，在S4 空白樣品中，采用甲醇、Na2EDTA-Mcllvaine 提取液各10 mL 分2 次提取是抗生素的最佳提取次數(shù)。對S1、S2、S3、S5、S6空白樣品進行了同條件驗證，驗證結果與圖1 結果相吻合。

2.1.2 提取方式的選擇

實驗分別考察了超聲10、15 min，離心5、10 min 2 個時間點，試樣提取液固相萃取流速1、3 及5 mL/min 3 個時間點。各基質空白樣品加標量為50 μg/L，進行兩次平行測定，S4 空白樣品結果見圖2、3。

結果顯示，在S4 空白樣品中34 種抗生素藥物的提取，選擇超聲10 min、離心5 min，固相萃取流速3 ～5 mL/min 是抗生素提取的最佳條件，同條件也適合S1、S2、S3、S5、S6 空白樣品。

2.2 基質匹配回歸方程、線性范圍和檢出限

用各基質的空白試樣溶液和全混合標準工作溶液配制成濃度為0.5 ～200 μg/L 基質匹配的混合標準系列溶液。在所選擇的最佳實驗條件下進行測定，得到回歸方程、線性范圍和相關系數(shù)見表5、6。

圖2 S4 空白基質34 種抗生素提取方式的選擇

圖3 S4 空白基質34 種抗生素提取液固相萃取流速的確立

表5 S1 ～S3 基質中34 種抗生素線性范圍及相關系數(shù)

（續(xù)表）

表6 S4 ～S6 基質中34 種抗生素線性范圍及相關系數(shù)

（續(xù)表）

表5、6 結果顯示，在液質聯(lián)用色譜法中，各基質中磺胺類在0.5 ～200 μg/L 范圍內具有良好的線性關系；在S1 和S2 基質中，喹諾酮類及四環(huán)素類在0.5 ～200 μg/L 范圍內具有良好的線性關系；在S3、S4、S5 及S6 樣品基質中，喹諾酮類及四環(huán)素類在1 ～200 μg/L 范圍內具有良好的線性關系。

用各基質空白樣品添加34 種混合抗生素濃度為0.2、0.5、1、2、5 μg/L，用上述前處理方法進行樣品處理，依照確定的色譜和質譜條件進行分析，進樣5 μL，進樣次數(shù)10 次，用噪音理論確定34 種抗生素的檢出限（3 倍信噪比）和定量限（10 倍信噪比）。本方法6 種基質中34 種抗生素檢出限為0.5 ～2.0 μg/kg，定量限為2.0 ～5.0 μg/kg。

2.3 精密度實驗

為考察超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法的精密度，對各基質進行添加回收實驗，添加量為20、50、100 μg/kg，每個添加量平行測定6 次，連續(xù)重復測定3 d，考察批內和批間重復性。采用已建立的方法進行測定，各基質中34 種抗生素含量見表7。結果表明各空白基質方法批內變異系數(shù)、批間變異系數(shù)均不超過25%。

表7 各基質中34 種抗生素含量 （μg/kg）

（續(xù)表）

2.4 準確度實驗

通過加標回收實驗來評價超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法的準確性。在S1 ～S6 基質樣品中，加入定量的34 種抗生素標準溶液。經兩次平行測定，統(tǒng)計本方法的回收率，基質樣品本底值見表7。方法對各基質樣品中的34 種抗生素回收率均在64.6%～117.9%之間（表8 ～10）。

2.5 10 μg/L 標準溶液中34 種抗生素色譜圖

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀（LCMS-8045，日本島津）測定10 μg/L 標準溶液中34 種抗生素色譜圖（圖4）。

表8 各基質中34 種抗生素含量回收率（加標量為20 μg/kg） （%）

表9 各基質中34 種抗生素含量回收率（加標量為50 μg/kg） （%）

表10 各基質中34 種抗生素含量回收率（加標量為100 μg/kg） （%）

圖4 10 μg/L 標準溶液中34 種抗生素色譜圖

3 結論

建立了同時測定畜禽糞便中34 種抗生素含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法，并對該方法的樣品前處理條件、穩(wěn)定性、準確性、可靠性等參數(shù)進行了研究。結果顯示，這種方法的精密度、準確性等方法性能指標均能滿足檢驗的要求，適合畜禽糞便中抗生素的檢測。方法的建立將進一步為以畜禽糞便為原料加工成肥料產品的質量監(jiān)督和市場監(jiān)管提供技術支撐，從而有效地降低農產品與耕地污染風險，保護生態(tài)環(huán)境。