楊軍，孔祥瑞，王讓劍

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹(shù)改良中心福建分中心/農(nóng)業(yè)部福建茶樹(shù)及烏龍茶加工科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，福建 福州 350013）

福建省內(nèi)茶樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富，存在大量野生茶樹(shù)種質(zhì)資源。其中，尤溪野生茶位于福建尤溪縣湯川鄉(xiāng)赤基村騰峰山苦竹林中，灌木為主，少量小喬木，較直立，花冠白色（少數(shù)淡黃色）［1］，制成茶形似雀舌，湯色碧綠，香氣清醇，滋味甘甜，沖泡五、六次仍清爽可口［2］；云霄野生茶位于福建云霄縣火田鎮(zhèn)大帽山，對(duì)云霄縣野生茶樹(shù)子房的茸毛數(shù)量、茸毛長(zhǎng)度、子房外壁紋飾等調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)種質(zhì)資源子房外壁紋飾以凹陷型為主，存在禿房野生茶種質(zhì)資源群體［3］。同時(shí)，茶樹(shù)是山茶科山茶屬茶組的多年生常綠木本植物［4］，且為異花授粉植物，具有高度雜合性，雜交結(jié)實(shí)率低［5］，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，茶樹(shù)種質(zhì)資源傳統(tǒng)鑒定方法時(shí)間長(zhǎng)、鑒定難度大。EST-SSR分子標(biāo)記在茶樹(shù)種質(zhì)資源鑒定與利用方面上有著廣泛應(yīng)用［6－10］，尤其在野生茶樹(shù)種質(zhì)資源鑒定方面有大量研究。彭靖茹［11］等研究表明廣西省9份野生古茶與15份茶樹(shù)栽培種屬于2個(gè)類群，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；陳立杰［12］等基于群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，貴陽(yáng)花溪古茶樹(shù)資源分為喬木型與灌木型，且由喬木型向灌木型進(jìn)化；安紅衛(wèi)［13］等認(rèn)為遺傳變異存在于144份貴州茶樹(shù)種質(zhì)資源個(gè)體間，不同海拔群體間存在較強(qiáng)的基因交流；有研究分別對(duì)安徽省太平猴魁茶產(chǎn)區(qū)柿大茶群體種［14］、廣西省野生茶樹(shù)種質(zhì)資源［15］、云南西雙版納茶資源［16］、云南大葉茶種質(zhì)資源［17］和四川大邑移栽野生大茶樹(shù)［18］進(jìn)行分組與遺傳多樣性分析。因此目前野生大茶樹(shù)種質(zhì)資源鑒定主要集中在遺傳多樣性、資源間親緣關(guān)系與基因交流等方面。本研究對(duì)云霄、尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行分組、親緣關(guān)系與遺傳多樣性研究，旨在對(duì)云霄、尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定與篩選，為茶樹(shù)種質(zhì)資源保護(hù)與利用提供初步依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試材料來(lái)源于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所與福建省云霄縣、尤溪縣，福建省茶樹(shù)品種資源與云霄、尤溪地方野生茶樹(shù)種質(zhì)資源共66個(gè)（表1），采集各材料一芽二葉鮮葉后用液氮迅速冷凍處理，保存在-80℃冰箱中備用。

表1 66份供試材料的名稱與來(lái)源Table 1 Names and origins of 66 specimens collected

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)藝性狀調(diào)查

農(nóng)藝性狀調(diào)查參考陳亮等［19］撰寫(xiě)的《茶樹(shù)種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》。

1.2.2 基因組DNA的提取

采用改進(jìn)的CTAB法［20］提取茶樹(shù)基因組DNA。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行茶樹(shù)基因組分子量大小檢測(cè)，用756-MC型紫外分光光度計(jì)測(cè)定茶樹(shù)基因組DNA的純度（OD260/280比值）。

1.2.3 引物合成

參照文獻(xiàn)［21］引物序列，序列由上海Sangon公司合成，引物信息見(jiàn)表2。

表2 29對(duì)SSR引物及其序列Table 2 Nucleotide sequences of 29 primer pairs

1.2.4 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物鑒定

PCR反應(yīng)體系為：ddH2O 18.8 μL，10×Buffer（Mg2+）2.5μL，dNTP（10 mmol·L-1）0.5 μL，上、 下 游 primer（10 μmol·L-1） 各 0.5 μL，Taq polymerase（0.5 U）0.2 μL，模板 DNA 2 μL。PCR反應(yīng)于美國(guó)ABI-9600型擴(kuò)增儀上進(jìn)行，熱循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入下列溫度循環(huán)：94℃變性45 s，不同溫度條件退火60 s，72℃延伸75 s，重復(fù)35個(gè)熱循環(huán)；72℃延伸10 min，最后4℃保存。

引物統(tǒng)一在反向引物（R）的5’段標(biāo)記熒光（FAM/TAMRA），由上海百力格生物科技有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物 0.5 μL，GeneScan? 500 ROX? 0.5 μL，HiDi 9 μL，混勻后使用ABI公司3730XL進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用ABI公司的GeneMapper4.0軟件，選擇GeneScan? 500 ROX?作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每一個(gè)擴(kuò)增出的條帶記錄大小。運(yùn)用PopGen3.2軟件計(jì)算Shannon信息指數(shù)（I）和Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）。運(yùn)用NTSYSpc2.1中的Tree plot程序進(jìn)行聚類分析。利用GenAlEx 6.4.1（Peakall and Smouse，2006）進(jìn)行分子方差分析（analysis of molecular variances，AMOVA）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 云霄、尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源葉片性狀調(diào)查

從表3中看能出，云霄、尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源在葉面、葉片長(zhǎng)寬比性狀上差異不大。兩地茶樹(shù)種質(zhì)資源在葉面性狀上皆為微隆起與隆起，葉片長(zhǎng)寬比均屬于長(zhǎng)橢圓形（2.5＜長(zhǎng)寬比＜3.0）。在葉身性狀、葉緣性狀、葉面積、葉齒數(shù)、葉脈對(duì)數(shù)等方面上有所差異。云霄茶樹(shù)種質(zhì)資源葉身多為平與稍背卷，葉緣多為微波與波狀，尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源多為平與內(nèi)折，葉緣多為平與微波；云霄茶樹(shù)種質(zhì)資源葉面積范圍11.29～58.74 cm2，平均值為28.56 cm2，說(shuō)明云霄茶樹(shù)種質(zhì)資源多為中葉種（20 cm2＜葉面積＜40 cm2），少量種質(zhì)資源為大葉種；尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源葉面積范圍18.89～84.01 cm2，平均值為41.94，說(shuō)明尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源多為大葉種（40 cm2＜葉面積＜60 cm2），少量種質(zhì)資源為特大葉種；云霄茶樹(shù)種質(zhì)資源葉齒數(shù)平均值大于尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源，葉脈數(shù)平均值小于尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源。

表3 農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果Table 3 Agronomic characteristics of germplasms

（接表3）

2.2 親緣關(guān)系分析

66個(gè)參試材料可以劃分為4個(gè)類群（圖1）。類群A主要為八仙茶、早春毫與云霄地方茶樹(shù)種質(zhì)資源，說(shuō)明云霄地方茶樹(shù)種質(zhì)資源與八仙茶、早春毫親緣關(guān)系相對(duì)較近；類群B與類群C內(nèi)的主要茶樹(shù)品種資源按照不同茶類聚類在一起，類群B主要為福建省烏龍茶品種資源，類群C主要為福建省紅、綠茶品種資源，推測(cè)茶樹(shù)品種適制性與茶樹(shù)品種的親緣關(guān)系相關(guān)；類群D皆為尤溪地方茶樹(shù)種質(zhì)資源，單獨(dú)形成一個(gè)聚類，說(shuō)明尤溪地方茶樹(shù)種質(zhì)遺傳背景比較特殊，屬于當(dāng)?shù)卦铇?shù)種質(zhì)資源，有待進(jìn)一步鑒定與挖掘。

圖1 遺傳相似系數(shù)聚類圖Fig. 1 Dendrogram on genetic similarity

2.3 群體遺傳多樣性分析

從表4中看出，A-D群體中類群C的Shannon遺傳多樣性指數(shù)最高，類群C主要為福建省綠茶品種，其中福云系列茶樹(shù)品種具有云南大葉種遺傳背景，增加類群C的遺傳多樣性；尤溪、云霄茶樹(shù)種質(zhì)資源Shannon遺傳多樣性指數(shù)均高于類群B，類群B主要為福建省烏龍茶品種資源，因此，尤溪、云霄茶樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性較為豐富。

表4 對(duì)比4個(gè)群體遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of 4 groups

（接表4）

Hardy-Weinberg遺傳偏離指數(shù)D主要反映Ho（觀測(cè)雜合度）和He（期望雜合度）之間的平衡關(guān)系，D值越接近0，基因型的分布就越接近于平衡狀態(tài)，D值大于0說(shuō)明存在雜合子過(guò)剩，D值小于0，說(shuō)明存在雜合子缺失現(xiàn)象［22］。其中，類群A的Ho與對(duì)應(yīng)的He相當(dāng)，說(shuō)明類群A基因型的分布就越接近于平衡狀態(tài)，說(shuō)明云霄地方茶樹(shù)種質(zhì)資源群體相對(duì)穩(wěn)定；類群B、C的Ho大于對(duì)應(yīng)的He，說(shuō)

明存在雜合子過(guò)剩，由類群B、C內(nèi)主要為福建省茶樹(shù)品種，品種之間親緣關(guān)系相對(duì)較近等原因造成，基因型的分布就未處于平衡狀態(tài)；類群D的Ho小于對(duì)應(yīng)的He，說(shuō)明存在雜合子缺失現(xiàn)象，類群D單獨(dú)為尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源，與外來(lái)資源遺傳交換較少，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因此可能存在雜合子缺失。

2.4 群體遺傳分化與基因流分析

Wright［23］等認(rèn)為種群間的遺傳分化系數(shù)FST值越大，種群的分化程度越高，F(xiàn)ST≤0.05時(shí)，兩群體幾乎無(wú)分化；0.05＜FST≤0.15時(shí)，種群中度分化；0.15＜FST≤0.25，種群發(fā)生明顯分化；當(dāng)FST＞0.25時(shí)，種群極度分化。FST越接近0，種群間越相似，越接近于1，分化越顯著。由表5中可以看出，類群D（主要為尤溪地方茶樹(shù)種質(zhì)資源）與類群A、類群B、類群C間的FST值為0.15～0.25，說(shuō)明尤溪地方茶樹(shù)種質(zhì)資源與其它類群發(fā)生明顯分化；類群B與類群C間的FST為0.589，非常接近0.05，說(shuō)明類群B與類群C幾乎無(wú)分化；類群A與類群B、類群C的FST值為0.05～0.15，說(shuō)明類群A（主要為云霄地方茶樹(shù)種質(zhì)資源）與類群B、類群C處于中度分化。

表5 4個(gè)類群之間遺傳分化系數(shù)（對(duì)角線以下）和基因流（對(duì)角線以上）Table 5 Genetic difference （below diagonal line） and gene flow （above diagonal line） among 4 groups

基因流（Nm）則可衡量群體間基因交流的水平。不同地理種群的基因流用Nm值表示，一般當(dāng)Nm＞4時(shí)，表明種群之間的基因流比較充分；若Nm＜1，則表明種群可能由于遺傳漂變而發(fā)生了分化［24］。類群D與類群C的Nm為1.0489，非常接近1，說(shuō)明類群D與類群C間可能由于遺傳漂變而發(fā)生了分化；類群B與類群C的Nm為3.9918，非常接近4，表明類群B與類群C間的基因流比較充分。

2.5 不同群體的AMOVA分析

不同群體遺傳變異的分子變異分析結(jié)果見(jiàn)表6，不同地理種群間的遺傳分化（Fst）變異較大（Fst＝0.207，P＜0.001）；不同個(gè)體間的遺傳分化（Fit）變異較大（Fit＝0.220，P＜0.001）。78%遺傳變異主要發(fā)生在個(gè)體間，而群體間的遺傳變異為21%，1%遺傳變異發(fā)生在群體內(nèi)個(gè)體間，說(shuō)明參試材料的遺傳變異主要來(lái)自于不同群體間和個(gè)體間，群體內(nèi)個(gè)體間遺傳分化（Fis）變異較小。

表6 群體內(nèi)和群體間AMOVA分析結(jié)果Table 6 AMOVA for intra-and inter-population variations

3 討論與結(jié)論

3.1 云霄、尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源親緣關(guān)系分析

本實(shí)驗(yàn)以福建省主要栽培品種為參照對(duì)云霄、尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行初步鑒定，鑒定結(jié)果顯示，福建主要栽培品種分為2個(gè)類群，分別主要為類群B（烏龍茶類型群）與類群C（綠茶類型群），而云霄、尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源分別形成單一類群，未與參照品種（福建省主栽茶樹(shù)品種）聚類在一起，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其中，云霄茶樹(shù)種質(zhì)資源分別與類群B、類群C的遺傳分化的系數(shù)FST值為0.1342、0.1332，處于中度分化；與八仙茶、早春毫（為廣東省鳳凰水仙茶樹(shù)品種的F2代）親緣關(guān)系相對(duì)較近，且王澤涵等［3］鑒定顯示云霄茶樹(shù)種質(zhì)資源中存在子房無(wú)茸毛情況與廣東省鳳凰水仙相似，推測(cè)云霄茶樹(shù)種質(zhì)資源與廣東省鳳凰水仙等類型茶樹(shù)種質(zhì)資源相似。尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源與類群A、類群B與類群C的遺傳分化的系數(shù)FST值均大于0.15，平均值為0.1765，處于明顯分化；與類群B、類群C的Nm分別為1.1049、1.0489，非常接近1，存在遺傳漂變分化，基因交流少。同時(shí)，群體間的遺傳變異為21%，且達(dá)到顯著性水平，說(shuō)明云霄、尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源與參照品種的遺傳差異達(dá)到顯著性水平，有必要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)其價(jià)值。

3.2 云霄、尤溪茶樹(shù)種質(zhì)遺傳多樣性分析

茶樹(shù)種質(zhì)資源Shannon多樣性指數(shù)大小是衡量茶樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性的重要指標(biāo)之一。38個(gè)湖南黃金茶Shannon多樣性指數(shù)為0.55［25］；122個(gè)云南野生茶樹(shù)Shannon多樣性指數(shù)為0.88［26］；14份廣西野生茶樹(shù)種質(zhì)資源Shannon多樣性指數(shù)0.97［11］；廣東歷史名茶群體種曲江羅坑茶與豐順馬圖茶Shannon多樣性指數(shù)分別為1.22與1.23［27］；16個(gè)白化、黃化茶樹(shù)品種Shannon信息指數(shù)0.79［28］；云霄茶樹(shù)種質(zhì)資源Shannon多樣性指數(shù)0.95，尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源Shannon多樣性指數(shù)0.86。云霄、尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性相對(duì)較高，且云霄茶樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性高于尤溪。

3.3 云霄、尤溪茶樹(shù)種質(zhì)基因雜合度分析

基因雜合度是指群體中某個(gè)位點(diǎn)上雜合子的頻率，反映群體的遺傳變異程度，被認(rèn)為是衡量群體遺傳變異的最適參數(shù)［29］。本實(shí)驗(yàn)參試材料的期望雜合度（0.6072）遠(yuǎn)高于觀測(cè)雜合度（0.5231），存在雜合子缺失。其中，類群B與類群C的期望雜合度低于觀測(cè)雜合度，屬于雜合子過(guò)剩，可能部分參照品種（如茗科1號(hào)、金牡丹等）是通過(guò)人工雜交獲得，增加類群B與類群C雜合子數(shù)量；云霄茶樹(shù)種質(zhì)資源的期望雜合度與觀測(cè)雜合度相當(dāng)，基因型的分布就越接近于平衡狀態(tài)；尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源期望雜合度高于觀測(cè)雜合度，與參試材料一樣存在雜合子缺失。參試材料的雜合子缺失可能由于云霄、尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源與參照品種之間缺少遺傳交流，云霄、尤溪茶樹(shù)種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)利用較少，具有當(dāng)?shù)刭Y源的獨(dú)特性。