楊 慧，張 佳，鐘林江，戴 靜，郭曉恒

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004;2.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106;3.成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610052;4.成都大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610106;5.四川省抗病毒中藥產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心，四川 成都 610106)

0 引 言

丹參為川產(chǎn)道地藥材，常用于活血化瘀、行經(jīng)止痛、涼血消癰等癥狀[1].其代表性物質(zhì)為丹酚酸類水溶性成分和丹參酮類脂溶性成分[2-4].丹參的傳統(tǒng)用藥部位(根及根莖)僅占丹參植株的33%，造成其莖葉資源的浪費[5-6].課題組前期研究表明，丹參莖葉與丹參在化學(xué)成分方面相似[7-8]，為擴大丹參資源利用率，進行丹參莖葉散劑的開發(fā)研究.中藥譜—效關(guān)系研究已逐漸成為中藥研究的一個重要內(nèi)容[9].隨著現(xiàn)代計算機信息技術(shù)日益成熟，數(shù)學(xué)統(tǒng)計分析方法逐漸科學(xué)化，易于構(gòu)建科學(xué)合理的譜—效模型.纖維蛋白原平板法原理是底物經(jīng)水解作用將纖維蛋白原水解成透明的纖維蛋白，根據(jù)透明圈面積與活血活性的量效關(guān)系進行評判.本研究通過建立丹參莖葉散劑的HPLC特征圖譜，并采用纖維蛋白原平板法測定其體外活血活性值，將特征峰與其體外活血活性進行相關(guān)性分析，建立譜—效模型，以實現(xiàn)對藥效作用的預(yù)測和評價，為其臨床的應(yīng)用提供基礎(chǔ).

1 材 料

1.1 儀 器

iChrom P5100型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)，SQP型1/10萬電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)，PS-40型超聲波清洗器(深圳深華泰超聲洗凈設(shè)備有限公司)，JJ-CJ-2FD型潔凈工作臺(蘇州金凈凈化設(shè)備科技有限公司)，DH系列電熱恒溫培養(yǎng)箱(西安禾普生物科技有限公司).

1.2 材 料

尿激酶(批號，170609)，購自麗珠集團麗珠制藥廠；凝血酶(批號，201701107)、牛血纖維蛋白原(批號，F(xiàn)20180302)，購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；瓊脂粉(批號，2017100101)，購自成都市科隆化學(xué)品有限公司；迷迭香酸、丹酚酸B對照品(批號分別為wkq17010504、wkq17061901，質(zhì)量分數(shù)均≥98%)，均購自四川省維克奇生物科技有限公司.

丹參莖葉藥材采自德陽市中江縣，經(jīng)成都大學(xué)郭曉恒副教授鑒定為唇形科植物丹參的莖和葉.

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參莖葉散劑的制備

取丹參莖葉500 g，加入13.41倍水，冷凝回流提取2次，每次0.65 h，合并提取液，抽濾后經(jīng)減壓濃縮(80 ℃、0.085 MPa、47 r/min)至濃縮液相對密度為1.25～1.30(室溫).按照濃縮液∶糊精質(zhì)量比為4∶6混合均勻，經(jīng)過減壓干燥(65 ℃、0.085 MPa)，粉碎，過2號篩，即得.

2.2 丹參莖葉散劑活血活性的測定

2.2.1 供試品溶液的制備

取丹參莖葉散劑約1 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入純化水20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(140 W，頻率42 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用純化水補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液離心10 min(15 000 r/min)，取上清液過0.45 μm水系微孔濾膜，即得.

2.2.2 纖維蛋白原平板的制備

取經(jīng)滅菌后的培養(yǎng)皿，依次加入(85±5)℃的1%瓊脂熱溶液20 mL和0.3%的纖維蛋白原溶液15 mL，混勻，待冷卻至溫度為(30±2)℃時，加入20 U/mL凝血酶1mL，搖勻，靜置30 min，待纖維蛋白原平板冷卻凝固，在其表面打孔，備用.

2.2.3 陰性樣品及對照品溶液的制備

取活性為100 000 U的尿激酶固體粉末1g，精密稱定，置于100 mL棕色容量瓶中，采用生理鹽水定容，即為每1 mL含1 000 U的儲備液.分別稀釋成濃度為每1 mL含50、100、200、300、400、500與600 U的尿激酶對照品溶液，備用.陰性樣品即為純化水和生理鹽水.

2.2.4 標準曲線的繪制

取纖維蛋白原平板，依次點樣對照品溶液25 μL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置16 h，取出，以測定的透明圈面積為縱坐標(Y)，對照品溶液濃度為橫坐標(X)，擬合得線性方程為，Y=0.342 6X+182.21(r=0.998 6).

2.2.5 精密度

1)同板精密度.取纖維蛋白原平板，分別進行同板點樣300 U/mL的對照品溶液25 μL(n=6)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置16 h，取出，游標卡尺測定透明圈面積大小，計算RSD為3.7%.

2)異板精密度.取纖維蛋白原平板(n=6)，分別進行異板點樣300 U/mL的對照品溶液25 μL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置16 h，取出，游標卡尺測定透明圈面積大小，計算RSD為4.2%.

2.2.6 重復(fù)性

取丹參莖葉散劑粉末適量，按“2.2.1”項方法平行制備供試品溶液(n=6)，取纖維蛋白原平板，依次點樣供試品溶液、300 U/mL對照品溶液與陰性樣品各25 μL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置16 h，游標卡尺測定透明圈面積，計算活血活性值，RSD為4.8%.

2.2.7 穩(wěn)定性

取丹參莖葉散劑粉末適量，按“2.2.1”項方法制備供試品溶液，取纖維蛋白原平板，分別于0、0.5、1、1.5、2與2.5 h后點樣供試品溶液、300 U/mL對照品溶液與陰性樣品各25 μL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置16 h，游標卡尺測定透明圈面積，計算活血活性值，RSD為5.3%.

2.2.8 加樣回收率

取活血活性值為3 065 U/g丹參莖葉散劑粉末約0.5 g(n=6)，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入濃度為150 U/mL的對照品溶液和純化水各10 mL，照“2.2.1”項下制備供試品溶液.分別取纖維蛋白原平板，依次點樣供試品溶液、300 U/mL對照品溶液與陰性樣品各25 μL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置16 h，取出，游標卡尺測定透明圈面積，計算活血活性平均回收率為83.2%，RSD為6.7%.

上述研究表明方法學(xué)符合相關(guān)技術(shù)要求，陰性樣品無干擾.

2.2.9 活血活性值測定

分別取丹參莖葉散劑粉末約1 g，精密稱定，按“2.2.1”項方法制備6批供試品溶液，取纖維蛋白原平板，依次點樣供試品溶液、300 U/mL對照品溶液與陰性樣品各25 μL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置16 h，游標卡尺測定透明圈面積，計算6批丹參莖葉散劑活血活性值，詳見表1.

表1 6批丹參莖葉散劑活血活性值

2.3 丹參莖葉散劑特征圖譜的構(gòu)建

2.3.1 供試品溶液的制備

取丹參莖葉散劑粉末約1 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入純化水20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(140 W，頻率42 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用純化水補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液離心10 min(15 000 r/min)，取上清液過0.45 μm水系微孔濾膜，即得.

2.3.2 對照品溶液的制備

分別取迷迭香酸與丹酚酸B對照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含迷迭香酸125 μg，丹酚酸B 50.72 μg的單一對照品溶液.

2.3.3 色譜條件

色譜柱為Supersil ODS2色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm).流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～10 min，12%～12%A；10～20 min，12%～14%A；20～36 min，14%～24%A；36～50 min，24%～22%A；50～65 min，22%～38%A；65～70 min，38%～12%A；70～75 min，12%～12%A.柱溫30 ℃,流量1.0 mL/min,進樣量10 μL,檢測波長280 nm.

2.3.4 精密度

取丹參莖葉散劑粉末約1 g，精密稱定，按照“2.3.1”項方法制備供試品溶液和“2.3.3”項色譜條件，分別對供試品溶液重復(fù)進樣分析6次，計算各共有峰相對峰面積RSD<1.8%，相對保留時間RSD<1.5%，結(jié)果表明儀器精密度良好.

2.3.5 穩(wěn)定性

取丹參莖葉散劑粉末約1 g，精密稱定，按照“2.3.1”項方法制備供試品溶液和“2.3.3”項色譜條件，分別于0、4、8、12、16與24 h進樣分析，計算各共有峰相對峰面積RSD<4.1%，相對保留時間RSD<2.2%，結(jié)果表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.3.6 重復(fù)性

取丹參莖葉散劑粉末約1 g，精密稱定，按照“2.3.1”項方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.3.3”項色譜條件進樣分析，計算各共有峰相對峰面積RSD<4.23%，相對保留時間RSD<3.1%，結(jié)果表明供試品制備方法重復(fù)性良好.

2.3.7 特征圖譜的構(gòu)建

取6批丹參莖葉散劑粉末適量，按照“2.3.1”項方法平行制備供試品溶液，按照“2.3.3”項色譜方法進行測定.將所得各批成品特征色譜圖采用“中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(tǒng)(A版)”進行處理，詳見圖1.經(jīng)系統(tǒng)擬合得到對照特征圖譜，詳見圖2，確定9個共有特征峰，通過丹酚酸B和迷迭香酸單一對照品進行指認，鑒定出7號峰為迷迭香酸，9號峰為丹酚酸B.供試品溶液、丹酚酸B對照品、迷迭香酸對照品以及空白溶液疊加圖譜，詳見圖3.

圖1 6批丹參莖葉散劑HPLC疊加特征圖譜

圖2 丹參莖葉散劑HPLC對照特征圖譜

S1-供試品，K1-空白，D1-迷迭香酸對照品，D2-丹酚酸B對照品

2.4 譜—效分析

2.4.1 主成分分析和相關(guān)性分析[10]

采用“SPSS”中“Reduction”組的“Factor”分析其主成分數(shù)目，由主成分分析解釋總方差表2可知，第6位及以后主成分解釋數(shù)據(jù)變異的總比例為100%，且碎石圖在成分數(shù)5之后具有平緩趨勢，詳見圖4所示，基于此，該分析模型的最優(yōu)主成分數(shù)為5.再由Spearman相關(guān)性分析確定主成分特征峰，Spearman分析中各共有峰峰面積活血活性相關(guān)性強弱見表3.優(yōu)選相關(guān)性較強的5個特征峰，優(yōu)選3、4、5、7、8號特征峰與活血活性構(gòu)建譜—效模型.

表3 各共有特征峰活血活性相關(guān)性強弱

圖4 碎石圖

表2 主成分分析解釋的總方差

2.4.2 多重線性回歸分析[11]

運用“SPSS”中“Regression”組的“Linear”法，對峰3、4、5、7(迷迭香酸)、8與活血活性值進行線性擬合，以特征峰峰面積為橫坐標(X)，活血活性值為縱坐標(Y)，采用多重線性回歸分析，建立其譜—效模型，回歸方程表示為，Y=0.269X峰3+0.008X峰4+0.244X峰5-0.024X峰7-0.051X峰8+64.506(r=0.999 6).

2.5 丹參莖葉散劑譜—效評價模型的驗證

為驗證已建立譜—效評價模型的適用性及準確性，另取6批丹參莖葉散劑，采用HPLC測定其特征圖譜3、4、5、7、8號峰面積，帶入譜—效模型，得到其活血活性預(yù)測值.采用纖維蛋白原平板法測定其體外活血活性測量值.預(yù)測值及測量值，詳見表4.

表4 丹參莖葉散劑活血活性的預(yù)測值和測量值

由表4可知，丹參莖葉散劑活血活性譜—效模型預(yù)測值與測量值的相對誤差較小，表明所建立的譜—效模型可較好地評價丹參莖葉散劑的活血活性值.

3 討 論

HPLC特征圖譜逐漸成為評價中藥整體質(zhì)量的一種方式，但其一般只能從“模糊”的角度控制相對出峰時間、相似度與相對峰面積等指標，雖然可以定性對藥品的均勻性進行表征，但并不能控制藥物“有效性”的屬性，本研究在建立丹參莖葉散劑HPLC特征圖譜基礎(chǔ)上，通過數(shù)學(xué)公式擬合丹參莖葉散劑的內(nèi)在化學(xué)成分群與活血活性的相關(guān)性方程，建立其譜—效模型，達到快速預(yù)測其體外活血活性的目的.經(jīng)相關(guān)性分析闡述了內(nèi)在化學(xué)成分群對活血活性的密切程度及作用方向，即協(xié)同和拮抗作用，采用丹酚酸B和迷迭香酸對照品對特征峰進行指認，進一步評價丹參莖葉散劑HPLC特征峰，以期實現(xiàn)用藥品質(zhì)量標準表征藥品臨床療效的目標.

在進行譜—效分析時，經(jīng)主成分分析和Spearma分析時，峰1對譜—效模型雖然不是主成分，但對活血活性卻顯負相關(guān)作用，現(xiàn)還未知峰1是何種成分.峰2、3、4、5、6、7(迷迭香酸)、8與9(丹酚酸B)對活血活性顯正相關(guān)，文獻表明迷迭香酸具有活血活性的藥理活性[12].Lee等[13]由實驗證明丹酚酸B可抑制動脈粥樣硬化，表明丹酚酸B可有效抑制血小板的凝血活性，本研究結(jié)果與相關(guān)文獻報道一致.現(xiàn)還未知峰1、2、3、4、5、6與8是何種物質(zhì)，本課題下一步將采用液—質(zhì)連用技術(shù)對其成分進行研究，探究其對活血作用的關(guān)系.

中藥作為一個極其復(fù)雜的化合物體系，通過以上分析，其發(fā)揮治療作用可能是幾種成分互相作用的結(jié)果，正符合中藥“多成分，多靶點”的特點.本研究以主成分分析、相關(guān)性分析和多重線性回歸分析3種方法對特征圖譜色譜峰和活血活性值進行譜—效分析，經(jīng)降維與相關(guān)性研究后，將相關(guān)性強的主成分和活血活性進行線性回歸，線性方程相關(guān)系數(shù)為0.999 6，驗證實驗中，預(yù)測值與測量值相對誤差不大，表明本研究建立的丹參莖葉散劑譜—效模型可較好地預(yù)測其體外活血活性.