吳發(fā)勝，周堯紅，何錦軼，李洲強，陳曉宇，陳慧，練祖平，侯恩存

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升，2018年全球新診斷乳腺癌患者約210萬例，占所有新診斷癌癥病例的24.2%，占所有與癌癥相關(guān)女性病死率的15%［1］，在女性惡性腫瘤中的病死率僅次于肺癌。近年來，臨床對乳腺癌的治療也越來越重視。中藥具有療效顯著、不良反應(yīng)小的特點，故在癌癥領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。

枳實是蕓香科酸橙及其栽培品種或甜橙的干燥幼果，具有破氣消積、化痰消痞的功效，且有“非枳實不能消痞”一說。臨床上枳實被用于治療諸多疾?。?-6］。枳實含有多種有效成分和作用的靶點，但由于其潛在的活性成分及在乳腺癌治療中的作用機制尚不清楚，故本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接，進一步探討枳實治療乳腺癌的機制，并為其應(yīng)用于腫瘤疾病提供一定思路。

1 材料與方法

1.1 枳實活性化合物收集與篩選采用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）（http：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）進行研究，以藥物生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為條件篩選枳實的活性化合物。

1.2 枳實化合物靶點收集將1.1中篩選出的活性化合物通過導(dǎo)入Drug Bank數(shù)據(jù)庫（https：／／www.drugbank.ca／），進一步得到枳實化合物對應(yīng)的作用靶點。

1.3 枳實化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建篩選出不重復(fù)的靶點，使用String數(shù)據(jù)庫，輸入靶點名稱，并將物種限制為人類，最終得到所需靶點，利用Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建枳實的化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 乳腺癌相關(guān)靶點的獲取以“breast cancer”為檢索詞，使用Gene Cards（https：／／www.genecards.org／）、CTD（http：／／ctd.mdibl.org／）數(shù)據(jù)庫檢索得到乳腺癌的所有靶點，構(gòu)建疾病數(shù)據(jù)庫，篩選并剔除重復(fù)后得到目標(biāo)靶點基因。

1.5 藥物-疾病共同靶點的篩選及構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖利用Venn在線分析工具獲得枳實和乳腺癌共同交集的靶點，并用Cytoscape3.7.2軟件制作靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析

利用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫對枳實作用于乳腺癌的靶蛋白進行GO功能富集分析，包括生物功能（biological function，BP）、細胞組分（cell composition，CC）、分子功能（molecular function，MF）?？梢暬治鲨讓嵶饔糜谌橄侔┑陌悬cGO功能富集結(jié)果。

1.7 京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopaedia of gene and genomes，KEGG）通路富集分析

進入DAVID平臺，利用其中的KEGG通路富集分析功能，對枳實作用于乳腺癌靶點相關(guān)的43個蛋白質(zhì)功能進行深入研究，結(jié)果得到共103條信號通路，將此導(dǎo)入omicshare（http：／／www.omicshare.com／）處理平臺進行可視化分析。

1.8 分子對接通過TCMSP獲得活性成分mol2格式，采用RCSB PDB（http：／／www.rcsb.org／）數(shù)據(jù)庫檢索相關(guān)蛋白晶體結(jié)構(gòu)，保存為pdb格式，應(yīng)用AutoDock軟件進行分子對接。根據(jù)得到的binding energy的值評價活性成分和關(guān)鍵靶點之間的對接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 枳實活性化合物的篩選利用TCMSP軟件檢索枳實中的活性化合物共65個，在藥物標(biāo)準(zhǔn)OB≥30%和DL≥0.18的條件下篩選出22個化合物，包括：枸橘苷（poncirin）、異橙黃酮（Isosinensetin）、5，7，4'-三甲氧基黃酮（5，7，4'-Trimethylapigenin）、異櫻花素-7-蕓香糖苷（isosakuranetin-7-rutinoside）、獨活素（Prangenin）、白芷屬腦（prangenin hydrate）等。各化合物的OB和DL值見表1。

2.2 枳實化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)將枳實化合物對應(yīng)的靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，去除非人源蛋白和重復(fù)蛋白，得到兩者之間更直觀的相互作用，最后通過整合獲得116個靶點。其中表1中poncirin（MOL013276）、prangenin hydrate（MOL013433）和Obacunone（MOL013352）這3個成分沒有相對應(yīng)的靶點。再次利用Cytoscape軟件，構(gòu)建枳實化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，在網(wǎng)絡(luò)圖中有135個節(jié)點274條相互關(guān)系，見圖1。

圖1 枳實化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)

表1 枳實22個活性成分信息

2.3 枳實治療乳腺癌的作用靶點在Gene Cards（https：／／www.GeneCards.org／）、CTD（http：／／ctd.mdibl.org／）數(shù)據(jù)庫中收集乳腺癌靶點，剔除重復(fù)數(shù)據(jù)后得到449個。利用Venn分析工具，繪制枳實化學(xué)成分與乳腺癌發(fā)病相關(guān)的靶點韋恩圖，見圖2，共有43個靶點基因，分別為MMP2、NOS2、MET、IL-10、MAPK1、BIRC5、MDM2、EGFR、IL-2、CREB1、ERBB2、IFNG、CHEK1、BCL2、TOP2A、MAPK8、BCL2L1、MAPK3、PPARG、RELA、GSTP1、RB1、CDK2、CYP19A1、TP53、INSR、CASP9、CDKN1A、CAT、AKT1、XIAP、PTGS2、CCND1、ESR1、CDK4、VEGFA、JUN、ESR2、BAX、MMP1、IL6、CASP3、MMP9。

圖2 枳實-乳腺癌靶點韋恩圖

2.4 枳實治療乳腺癌的作用靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)將韋恩圖中交集的43個潛在靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見圖3。圖中共有43個節(jié)點，579條邊，其中Degree值較大者是TP53、AKT1、CASP3、JUN、VEGFA、CCND1、MAPK1，表明這些蛋白是枳實治療乳腺癌的關(guān)鍵靶點蛋白。

圖3 枳實治療乳腺癌作用靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.5 枳實治療乳腺癌靶點GO功能富集分析GO功能富集分析，得出317條BP，主要包括轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA模板化、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的正調(diào)控、細胞增殖和一氧化氮生物合成過程的正向調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控、藥物反應(yīng)、毒性反應(yīng)等；有34條CC，包括細胞核、細胞質(zhì)、細胞質(zhì)膜微囊、胞液、線粒體、周期蛋白依賴的蛋白激酶全酶復(fù)合物等；有62條MF，包括蛋白質(zhì)異構(gòu)化活性、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、激酶活性、蛋白質(zhì)同源二聚活性、BH3域綁定等。根據(jù)P值由小到大選取排名前10位的條目，通過GraphPad 8.4.0軟件做出了BP、CC、MF的條形圖，見圖4。

圖4 枳實治療乳腺癌靶點的GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析和氣泡圖富集結(jié)果分析，枳實治療乳腺癌共有103條通路，其中有癌癥通路（Pathways in cancer）、PI3K-Akt信號通路（PI3KAkt signaling pathway）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、FoxO信號通路（FoxO signaling pathway）、p53信號通路（p53 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）等。排除“Hepatitis B”“Bladder cancer”“Pancreatic cancer”等與乳腺癌不相關(guān)的通路，根據(jù)P值，從小到大選擇前20個的通路，將其導(dǎo)入omicshare平臺，制作高級氣泡圖，見圖5。

圖5 枳實治療乳腺癌作用靶點KEGG通路富集分析氣泡圖

2.7 KEGG通路富集分析圖利用KEGG分析，將2.6中得到的103條通路按P值大小選取前20條信號通路。點擊PI3K-Akt信號通路Chart，見圖6。

圖6 枳實中PI3K-Akt信號通路潛在靶基因的KEGG通路富集分析

2.8 分子對接驗證選取“枳實化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)”圖中排名前3位的化合物luteolin、naringenin、nobiletin與PPI網(wǎng)絡(luò)圖中Degree值排名靠前的8個關(guān)鍵節(jié)點TP53、AKT1、CASP3、JUN、VEGFA、CCND1、MAPK1、MAPK3，利用AutoDock軟件進行分子對接。其中naringenin與AKT1、CASP3、MAPK1對接以及nobiletin與TP53、AKT1、JUN、VEGFA、CCND1、MAPK1對接的能量大于-5 kcal·mol-1，其余對接結(jié)果均小于-5 kcal·mol-1，證明枳實化合物活性成分和靶蛋白結(jié)合穩(wěn)定，見表2。利用Pymol軟件對活性化合物與luteolin結(jié)果進行可視化處理，見圖7。

圖7 分子對接模式圖

表2 枳實化合物活性成分和靶蛋白對接結(jié)果

3 討論

乳腺癌屬中醫(yī)“乳巖”“乳石癰”“石癰”等范疇?！夺t(yī)宗金鑒》提出“堅硬巖行引胸腋”，同時指出乳巖是由肝脾兩傷和氣郁凝結(jié)而成的。乳巖辨證以痰瘀互結(jié)證、肝氣瘀滯證最為常見［7］，治療需標(biāo)本兼顧，治以疏肝理氣、活血利水。枳實為常用中藥材，其味辛、苦，性微寒。《景岳全書》中枳實的功效是“除脹滿，消宿食，削堅積，化稠痰，破滯氣，平咳喘，逐瘀血停水，解傷寒結(jié)胸，去胃中濕熱”［8］。研究表明，枳實具有促動力［9］、抗氧化、抗炎［10-11］、抗凝［12］、抗腫瘤、增強細胞免疫［13］等多種活性。目前，未檢索到有相關(guān)文獻對枳實治療乳腺癌的活性成分、作用靶點、信號通路等作用機制的研究。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺，構(gòu)建枳實化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)，并對枳實治療乳腺癌的靶點進行了GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析，進一步分析枳實治療乳腺癌的機制。

本研究檢索到枳實活性成分19個，有對應(yīng)靶點的成分16個，構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)枳實主要通過neohesperidin-qt、luteolin、nobiletin、naringenin、Sinensetin、Tetramethoxyluteolin等有效成分發(fā)揮藥理學(xué)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，neohesperidin-qt（新橙皮苷）可以誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡［14］。王宏［15］、劉俊磊［16］的實驗表明，新橙皮苷有很好的體內(nèi)外抗腫瘤和抑制腫瘤細胞增殖的作用，聯(lián)合用藥下調(diào)了MAPK信號通路的磷酸化活化程度以及Bcl-2和p-AKT表達水平，使核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達降低。另外，乳腺癌細胞MDA-MB-231中橙皮素抑制CYP1A1和CYP1B表達，刺激INSIG1表達，進而發(fā)揮了抗腫瘤的作用。木犀草素已被證實，可顯著抑制腫瘤細胞增殖。Zhang等［17］發(fā)現(xiàn)，拉帕替尼和木犀草素聯(lián)合應(yīng)用可以通過提高HER2人乳腺癌移植瘤中兩個關(guān)鍵基因FOXO3a和NQO1的表達以抑制HER2人乳腺癌。由此推斷，枳實應(yīng)用于機體后，它的一些有效成分在腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移過程中扮演了重要角色。

Venn分析得到枳實與乳腺癌相關(guān)的43個潛在靶點，用Cytoscape軟件可視化，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，圖中顯示Degree值較大者是TP53、AKT1、CASP3、JUN、VEGFA、CCND1、MAPK1，說明它們是藥物與疾病相互作用的關(guān)鍵節(jié)點。TP53基因改變是最普遍的［18］，它是17號染色體的基因，這是一個十分重要的癌癥風(fēng)險因素。TP53是一種轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)細胞在應(yīng)激反應(yīng)中被激活時，調(diào)節(jié)一系列與細胞過程相關(guān)的基因，包括細胞周期、凋亡及衰老［19］。研究證實，受TP53直接調(diào)控的miR-34a在乳腺癌、肺癌、肝癌等組織中均有異常的表達，其對腫瘤增殖有負性調(diào)控作用，可直接抑制乳腺癌和大腸癌中的乳酸脫氫酶A的表達［20］。在含有TP53錯義突變的癌細胞系中，APR-246通過ROS誘導(dǎo)p73和Noxa表達上調(diào)，從而誘導(dǎo)顯著凋亡［21］。作為高突變率的AKT1基因在腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展過程中亦起著重要的作用。Li等［22］研究發(fā)現(xiàn)，Akt1基因敲除可刺激βcatenin核聚集，導(dǎo)致乳腺癌細胞侵襲，吉非替尼可潛在地抑制Akt1抑制誘導(dǎo)的乳腺癌轉(zhuǎn)移。由此，我們在臨床上可根據(jù)乳腺癌相關(guān)的潛在靶點，針對性用藥，可為將來發(fā)現(xiàn)新型的治療藥物提供依據(jù)。為了進一步研究枳實治療乳腺癌的作用，利用AutoDock軟件做分子對接，結(jié)果顯示枳實對乳腺癌的多個作用靶點和有效活性成分對接的binding energy小于-5 kcal·mol-1，證明枳實能與乳腺癌受體蛋白穩(wěn)定結(jié)合并發(fā)揮重要作用。

本研究對枳實治療乳腺癌的靶基因進行了GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，治療的生物過程中，主要體現(xiàn)在細胞增殖、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、一氧化氮生物合成過程、凋亡過程、有毒物質(zhì)反應(yīng)等方面，還包括酶結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)異構(gòu)化活性、激酶活性等分子功能。根據(jù)KEGG通路富集分析，枳實與乳腺癌最相關(guān)的通路包括PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、FoxO信號通路、p53信號通路和雌激素信號通路。Yurasakpong等［23］發(fā)現(xiàn)，枳實提取物通過阻斷Akt／mTOR／HIF-1軸減少己糖激酶Ⅱ的表達，進而抑制乳腺癌細胞的增長，促進其凋亡。PI3K-Akt信號通路作用顯著，腫瘤的發(fā)生、增殖、分化、轉(zhuǎn)移和凋亡過程中均起重要作用［24］。通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路可以干擾乳腺癌增殖和侵襲的能力，誘導(dǎo)細胞凋亡［25-26］，并且與化療還有協(xié)同作用，抑制癌細胞對藥物的耐藥性［27］。PI3K-Akt信號通路的靶向治療逐漸成為乳腺癌治療的熱點。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，對枳實治療乳腺癌的多成分、多靶點、多通路機制進行了研究，可體現(xiàn)出中藥治療疾病的復(fù)雜性。由于在研究的過程中可能存在數(shù)據(jù)庫資料收集不全面、篩選不夠精準(zhǔn)等不足之處，故本研究初步探討了枳實治療乳腺癌的藥理機制，通過生物信息學(xué)等技術(shù)探究了中藥與疾病的潛在作用靶點及機制。