郭玉巖，李春成，孫爽，楊大宇，呂邵娃

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040

馬錢子（Strychnosnux-vomica L.）為云南馬錢或馬錢的成熟種子［1］，是臨床常用的一味中藥，苦寒，有大毒，歸肝、脾經(jīng)，具有通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫的功效［2］，由于其藥理活性較為明顯，為歷代醫(yī)家所推崇?，F(xiàn)代研究表明馬錢子可有效拮抗腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，多項(xiàng)報(bào)道顯示馬錢子中的馬錢子堿具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能、抑制腫瘤血管生成、減少腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用［3-5］；同時(shí)，還可以通過調(diào)控癌細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等表達(dá)［6］，影響癌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附能力，抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［7］。目前對于馬錢子的抗腫瘤機(jī)制研究主要集中在活性成分對腫瘤細(xì)胞的生長抑制和促凋亡方面［8-12］，且馬錢子抗腫瘤的作用成分也只限于馬錢子堿［13］，其作用的靶點(diǎn)和通路又是如何，值得深入探討。馬錢子含有近百種化合物，并作用于多種細(xì)胞靶標(biāo)，很難用常規(guī)方法系統(tǒng)地研究馬錢子的協(xié)同作用機(jī)制，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為復(fù)雜的分子機(jī)制及中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了新的方法［14］，通過分析各種復(fù)雜和多層次的交互網(wǎng)絡(luò)更好地闡述了成分和多目標(biāo)藥物的協(xié)同作用及其潛在機(jī)制。已被廣泛應(yīng)用于研究中藥、中藥藥對，中藥復(fù)方作用于疾病的分子機(jī)制研究［15］。為此，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究活性成分抗腫瘤的作用靶點(diǎn)，對成分-靶點(diǎn)-疾病進(jìn)行系統(tǒng)可視化網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，對靶基因進(jìn)行GO功能富集分析、KEGG信號通路分析，進(jìn)而闡明馬錢子抗腫瘤的潛在分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 篩選馬錢子的活性成分以馬錢子為關(guān)鍵詞，從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺中獲取所有化學(xué)成分。將口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-like，DL）≥0.18作為篩選條件，從而得到活性成分。其中OB和DL是篩選活性成分的重要指標(biāo)［16］。

1.2 作用靶點(diǎn)的獲取以馬錢子為研究對象，采用Pharm Mapper Server數(shù)據(jù)庫以人類蛋白靶標(biāo)為研究對象進(jìn)行反向分子對接和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，反向分子對接方法主要通過Pharm Mapper服務(wù)器來實(shí)現(xiàn)，采用藥效團(tuán)匹配方法，以活性小分子為探針，通過對Targetbank、Drugbank數(shù)據(jù)庫預(yù)測活性成分潛在靶點(diǎn)。利用R軟件對UniProt數(shù)據(jù)庫的作用靶點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得其相應(yīng)靶點(diǎn)的人源靶點(diǎn)基因名稱（Gene name）。從Gennecards（https：／／www.genecards.org／）數(shù)據(jù)庫，以“cancer”為關(guān)鍵詞，檢索與腫瘤相關(guān)的靶點(diǎn)基因，導(dǎo)出證據(jù)來源可靠的靶點(diǎn)基因（Relevance score＞20）。利用R軟件對活性成分的作用靶點(diǎn)及腫瘤疾病靶點(diǎn)基因取交集，得到疾病-藥物的共同作用靶點(diǎn)（Gene name），利用Metascape（http：／／metascape.org／）數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入相應(yīng)基因，得到Gene ID。

1.3 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建將馬錢子活性成分所對應(yīng)的靶點(diǎn)基因和腫瘤相關(guān)的靶標(biāo)基因進(jìn)行匹配，獲得兩者的共同基因即馬錢子抗癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。使用Cytoscape軟件（Version 3.6.1）構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)（node）代表成分、靶點(diǎn)與疾?。痪W(wǎng)絡(luò)中的邊（edge）用來連接藥物與活性成分、活性成分與靶點(diǎn)基因。整個(gè)網(wǎng)絡(luò)展示馬錢子藥物-活性成分-靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建將所得的交集靶點(diǎn)基因輸入STRING在線分析平臺，物種類別選擇Homo sapiens，獲得靶點(diǎn)相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，利用R軟件篩選關(guān)鍵的靶基因。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析利用R軟件并使用STRING和Bioconductor數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入相應(yīng)基因，P值選擇0.05作為篩選條件，得到GO、KEGG通路富集分析結(jié)果，并分別繪制柱形圖和氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 主要活性成分的篩選本研究基于數(shù)據(jù)的復(fù)雜性、樣本量的考慮，選擇DL≥0.18，OB≥30%作為篩選條件。通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺共檢索出62個(gè)化學(xué)成分，剔除未找到作用靶點(diǎn)的成分，最終共得到活性化合物14個(gè)。對活性成分?jǐn)?shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，（+）-兒茶素、（S）-金罌粟堿、馬錢子堿氮氧化物在這些活性成分中具有較高的OB值，而馬錢子堿、士的寧，雖然OB、DL值較低，但文獻(xiàn)報(bào)道這些化合物含量較高，是具有藥效的活性成分，故一并納入，最終確定候選馬錢子活性化合物14個(gè)，見表1。

表1 馬錢子活性成分的篩選

2.2 網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及共有靶點(diǎn)的篩選通過反向分子對接預(yù)測馬錢子的活性成分作用靶點(diǎn)有25個(gè)，在Genecards數(shù)據(jù)庫檢索腫瘤共有11 606相關(guān)的靶點(diǎn)，篩選相關(guān)性分?jǐn)?shù)（Relevance score）＞20得到487個(gè)腫瘤疾病靶點(diǎn)。利用R軟件篩選共有靶點(diǎn)，共有7個(gè)馬錢子作用靶點(diǎn)分別為ESR1、PGR、AR、ESR2、NCOA1、PLAU，CASP3。見表2。

表2 馬錢子抗腫瘤疾病相關(guān)靶點(diǎn)

2.3 藥物成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建以TCMSP和Genecards為平臺，將藥物成分與共有靶點(diǎn)之間的關(guān)系、共有靶點(diǎn)與疾病之間的關(guān)系做成Excel表格，輸入Cytoscape 3.6.1生成相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖，因共有靶點(diǎn)與藥物之間共有4個(gè)成分與共有靶點(diǎn)關(guān)系緊密，故刪除多余藥物成分，建立藥物成分-靶點(diǎn)-疾病關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。該網(wǎng)絡(luò)圖中黃色節(jié)點(diǎn)代表化學(xué)成分，紫色節(jié)點(diǎn)代表腫瘤藥物靶點(diǎn)，從圖中可以看出，馬錢子通過多成分、多靶點(diǎn)起到抗腫瘤的作用。見圖1。

圖1 馬錢子藥物成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 構(gòu)建靶點(diǎn)基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖通過STRING在線分析平臺，得到靶點(diǎn)相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖共有7個(gè)節(jié)點(diǎn)14條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為4，采用R軟件計(jì)算靶點(diǎn)相互作用出現(xiàn)的頻數(shù)，依次為ESR1、PGR、AR、CASP3、NCOA1、ESR2，PLAU，這些靶點(diǎn)是在馬錢子抗腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中最關(guān)鍵的7個(gè)基因，進(jìn)而闡釋了馬錢子作用于這7個(gè)靶點(diǎn)，靶點(diǎn)之間相互聯(lián)系、相互作用、相互協(xié)同，起到抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用。見圖2。

圖2 共有靶點(diǎn)相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO及KEGG富集分析通過R軟件對馬錢子抗腫瘤作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，篩選P＜0.05的生物過程共有105個(gè)，并對前20個(gè)重要的功能分析進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理，結(jié)果見圖3、圖4。由此得出GO生物過程富集分析的馬錢子抗腫瘤轉(zhuǎn)移靶點(diǎn)所涉及的生物過程包括核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體活性、類固醇結(jié)合、RNA聚合酶II基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機(jī)制結(jié)合、基底RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄機(jī)制結(jié)合、ATP酶結(jié)合、β-連環(huán)蛋白結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。提示馬錢子的活性成分可能通過干預(yù)以上生物學(xué)過程而抑制腫瘤的生成和轉(zhuǎn)移。

圖3 馬錢子活性成分抗腫瘤關(guān)鍵靶基因GO富集分析

通過對馬錢子抗腫瘤轉(zhuǎn)移靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號通路富集分析，篩選出P＜0.05的信號通路117條，利用R軟件分析后將重要的20條通路可視化，結(jié)果見圖5。馬錢子的抗腫瘤轉(zhuǎn)移靶點(diǎn)主要涉及催乳素信號通路、前列腺癌、內(nèi)分泌抵抗、雌激素信號通路、癌癥的蛋白多糖等，協(xié)同參與調(diào)控腫瘤生成和轉(zhuǎn)移過程而起到抗腫瘤作用。

圖5 馬錢子抗腫瘤KEGG通路富集分析

3 討論

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測得到馬錢子中馬錢子堿（Brucine）、刺罌粟堿［（S）-Stylopine］、Icaride A、兒茶素［（+）-Catechin］4種抗腫瘤活性成分。據(jù)報(bào)道，馬錢子堿具有顯著的抗腫瘤作用，可抑制人三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲和血管生成擬態(tài)形成［17］，能夠有效抑制肝癌細(xì)胞黏附，阻止肝癌細(xì)胞運(yùn)動和侵襲［18］，還可明顯抑制人白血病K562細(xì)胞株及HL-60細(xì)胞，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［19］。而除馬錢子堿外，其中刺罌粟堿、Icaride A、兒茶素等3種潛在藥效成分也可起到協(xié)同抗腫瘤作用，值得進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。通過反向分子對接和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究篩選得到ESR1、PGR、AR、ESR2、NCOA1、PLAU、CASP3等7個(gè)最關(guān)鍵的靶點(diǎn)。通過構(gòu)建馬錢子藥物-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)間通過相互作用，共同協(xié)調(diào)增殖、凋亡、分化和代謝過程進(jìn)而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。其中ESR1［20］、CASP3［21］是馬錢子抗腫瘤重要的靶點(diǎn)。雌激素受體ESR1在正常的乳腺發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，ESR1擴(kuò)增與腫瘤大小、陽性淋巴結(jié)數(shù)目、陰性ERalpha和陽性人表皮生長因子受體狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)，且與ER蛋白的較高表達(dá)水平密切相關(guān)，其對腫瘤進(jìn)展及內(nèi)分泌治療耐藥的產(chǎn)生發(fā)揮重要作用。CASP3是馬錢子抗腫瘤的重要作用靶點(diǎn)，是腫瘤細(xì)胞凋亡反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［22］，在腫瘤發(fā)生過程中顯示與半胱氨酸蛋白酶鈣蛋白酶家族的相互作用，其表達(dá)影響腫瘤患者的特異性生存率，并在不同的表型中提供了更多的預(yù)后價(jià)值［23］。

進(jìn)一步對馬錢子抗腫瘤相關(guān)的作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物過程富集分析、KEGG信號通路分析，得到6條信號通路與抗腫瘤有關(guān)，包括催乳素信號通路、前列腺癌、內(nèi)分泌抵抗、雌激素信號通路、癌癥中的蛋白多糖等。研究表明，其中具有代表性的內(nèi)分泌抵抗［24］、雌激素信號通路［25］、催乳素信號通路［26］在腫瘤發(fā)生和發(fā)展所有階段的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮重要作用，不僅可以通過自身的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程介導(dǎo)細(xì)胞活性，還可共同介導(dǎo)細(xì)胞中復(fù)雜的生物活動；馬錢子抗腫瘤轉(zhuǎn)移靶點(diǎn)所涉及的生物過程包括核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體活性、類固醇結(jié)合等。通過對馬錢子抗腫瘤相關(guān)的作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物過程富集分析、KEGG信號通路分析，證明了馬錢子是通過多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

本文通過篩選馬錢子活性成分并預(yù)測抗腫瘤作用靶點(diǎn)，構(gòu)建成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，對靶點(diǎn)進(jìn)行GO、KEGG分析等網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法深入研究馬錢子的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的分子機(jī)制，成功預(yù)測了馬錢子抗腫瘤的主要活性成分、抗腫瘤作用靶點(diǎn)及與其相關(guān)的信號通路和生物過程，體現(xiàn)了中藥多成分多靶點(diǎn)作用于疾病的復(fù)雜機(jī)制，對于馬錢子抗腫瘤提供了研究基礎(chǔ)。