倪亞楠， 李宇杰， 馮 蕊， 沈 彤， 張勝紅

（北京石油化工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，化學(xué)化工國家級實驗教學(xué)示范中心，北京 102617）

0 引 言

隨著我國在2016年正式加入國際工程聯(lián)盟的“華盛頓協(xié)議”，國內(nèi)工科高校的本科教學(xué)更加重視創(chuàng)新能力和工程實踐能力的培養(yǎng)，而實驗教學(xué)是培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新意識和實踐能力的重要環(huán)節(jié)［1］?；诠こ探逃龑I(yè)認證的理念和標(biāo)準(zhǔn)，大學(xué)實驗課程不僅要加深學(xué)生對工程基礎(chǔ)和專業(yè)知識的理解，更重要的是要培養(yǎng)學(xué)生基于科學(xué)原理和方法解決實際工程問題的研究能力，如設(shè)計實驗、分析和解釋數(shù)據(jù)、并通過信息綜合得到合理有效的結(jié)論。

具體到制藥工程專業(yè)的物理化學(xué)實驗課程，傳統(tǒng)的驗證性動力學(xué)實驗，如蔗糖水解和乙酸乙酯皂化反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的測定，在工程教育專業(yè)認證背景下已難以有效支撐相應(yīng)的畢業(yè)要求指標(biāo)點。為此，設(shè)計了具有制藥專業(yè)特色的動力學(xué)綜合化學(xué)實驗——阿司匹林水解反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)及其有效期的測定。阿司匹林，又名乙酰水楊酸，是一種常見的非甾體藥物，廣泛用于解熱、陣痛、抗炎和抗血栓等方面［2］。阿司匹林的合成、制劑、溶出、鑒別和質(zhì)量分析是藥物化學(xué)及相關(guān)專業(yè)的經(jīng)典實驗內(nèi)容［3-7］。作為阿司匹林實驗教學(xué)中的重要一環(huán)，其水解反應(yīng)不僅有助于學(xué)生深度理解酯水解反應(yīng)機理和動力學(xué)，而且是阿司匹林有效期預(yù)測和藥物劑型設(shè)計的理論基礎(chǔ)。

1 實驗設(shè)計思路

乙酰水楊酸水解反應(yīng)通常用作阿司匹林定量分析的一個手段［8］，尚未發(fā)展為一個獨立的化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)教學(xué)實驗。究其原因，阿司匹林水解反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的測定主要基于絡(luò)合顯色法［9-11］：即采用可溶性Fe3+鹽與其水解產(chǎn)物形成穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物，然后監(jiān)測該絡(luò)合物在～525 nm波長處的吸光度來間接測定阿司匹林的含量。絡(luò)合顯色法需要pH值為2.5～3.5的弱酸性環(huán)境穩(wěn)定水楊酸鐵絡(luò)合物，因此難以模擬阿司匹林溶液的近中性存儲環(huán)境；此外，該方法操作過程繁瑣且耗時較長，無法滿足4～8 h的物理化學(xué)實驗學(xué)時要求。張彩云等［12］采用雙波長紫外分光光度法消除水楊酸對阿司匹林的干擾，在加速實驗條件下測定了阿司匹林水解反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)。遺憾的是，該方法忽略了產(chǎn)物水楊酸（pKa=2.98）對溶液pH值以及阿司匹林水解速率的影響，理論上存在瑕疵。

借鑒上述研究成果，本實驗采用近中性的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液（pH=6.85，25℃）模擬阿司匹林溶液的存儲環(huán)境，采用紫外分光光度法監(jiān)測產(chǎn)物水楊酸的吸光度以及阿司匹林水解反應(yīng)的進度。通過測定50～80℃范圍內(nèi)阿司匹林水解反應(yīng)的速率常數(shù)k計算該反應(yīng)的平均表觀活化能Ea并推測室溫下（25℃）阿司匹林溶液水解反應(yīng)的速率常數(shù)和有效期。

2 實驗實施

2.1 實驗教學(xué)方法

本實驗采用問題導(dǎo)向的探究性教學(xué)。首先啟發(fā)學(xué)生思考：為什么常見的阿司匹林藥品是片劑而不是針劑或者口服液？然后引出化學(xué)穩(wěn)定性是影響藥物劑型的重要因素，進而介紹藥品有效期的概念并引導(dǎo)學(xué)生思考如何通過加速實驗法測定阿司匹林水解反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)和藥物有效期。

2.2 實驗安排

本實驗項目定位為綜合性或開放性物理化學(xué)實驗，也可進一步融入藥學(xué)相關(guān)的專業(yè)綜合實驗。實驗時長為8學(xué)時，教學(xué)組織方面可以采用2人1組或4人1組，要求學(xué)生共同設(shè)計實驗方案并分工協(xié)作。第1階段（4學(xué)時），任課教師講解實驗原理、儀器操作和實驗注意事項，重點引導(dǎo)學(xué)生檢討并修訂實驗內(nèi)容和方案。學(xué)生配制相關(guān)溶液，確定紫外可見光譜儀的工作波長并測定70和80℃時阿司匹林水解反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)。第2階段（4學(xué)時）：學(xué)生測定50和60℃時阿司匹林水解反應(yīng)的速率常數(shù)。

2.3 實驗原理

阿司匹林在水溶液中不穩(wěn)定，易于水解生成水楊酸和醋酸。

其中，酸和堿（尤其是H+和OH-離子）都能夠催化該水解反應(yīng)，盡管堿催化阿司匹林水解反應(yīng)的速率遠高于酸催化或自水解反應(yīng)速率［13］。因此，實際測得的速率是同步發(fā)生的各水解反應(yīng)速率的總和［14］，即

式中：k0，kH和kOH分別為阿司匹林自水解、H+和OH-離子催化阿司匹林水解反應(yīng)的速率常數(shù)；而kHA和kB分別為其他廣義酸（HA）和堿（B）催化該反應(yīng)的速率常數(shù)。

盡管阿司匹林水解反應(yīng)可能存在不同的路徑，但在pH值恒定的實際反應(yīng)中該過程通常只由一種機理主導(dǎo)，并且該反應(yīng)在水介質(zhì)中可以按準(zhǔn)一級反應(yīng)處理［14］。因此，阿司匹林水解反應(yīng)速率與其濃度呈正比，即

式中：c為時間t時阿司匹林的濃度；k為速率常數(shù)。

將式（2）積分得：

式中，c0為阿司匹林的初始濃度。

根據(jù)Lambert-Beer定律，在選取的工作波長（如水楊酸的最大吸收波長）處，反應(yīng)未開始、達到平衡和任意t時刻的溶液吸光度（記作A0，A∞和At）可以分別采用下式表示：

式中：b為石英比色皿的內(nèi)部寬度；ε和ε′分別為阿司匹林和水楊酸在選定波長下的摩爾吸光系數(shù)。

此外，鑒于阿司匹林水解反應(yīng)的平衡常數(shù)遠大于106，可以合理假設(shè)反應(yīng)達到平衡時阿司匹林完全水解并采用濃度為c0的水楊酸溶液的吸光度數(shù)值替代A∞［14］。

將式（4）～（6）聯(lián)立，得：

進一步將式（7）和（8）代入式（3）得：

以ln（A∞-At）對t作圖，由擬合直線的斜率即可求得反應(yīng)在不同溫度時的速率常數(shù)k。假設(shè)該反應(yīng)的表觀活化能Ea在50～80℃區(qū)間內(nèi)為定值，依據(jù)

中的Arrhenius方程以lnk對1/T作圖并由擬合直線的斜率即可得到水解反應(yīng)的Ea值。

進一步假設(shè)該反應(yīng)的Ea在20～80℃范圍內(nèi)為常數(shù)，將式（10）外推至298 K即可計算25℃時阿司匹林水解反應(yīng)的k值。藥品的有效期通常是指藥物有效組分損失10%所需的時間（τ0.9）。相應(yīng)地，阿司匹林水溶液的τ0.9值可以根據(jù)25℃時水解反應(yīng)的k值由下式進行計算：

2.4 主要試劑及儀器

試劑：乙酰水楊酸（阿司匹林），水楊酸，醋酸，NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4，均為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

儀器：G-10雙光束紫外可見分光光度計（讓奇儀器科技有限公司）；SYC-15c超級恒溫水?。暇┥Ａ﹄娮釉O(shè)備廠）；電子分析天平，容量瓶，100 mL磨口錐形瓶。

2.5 實驗步驟和注意事項

（1）溶液配制。首先配制NaH2PO4和Na2HPO4濃度均為25 mmol/L的緩沖溶液1 L并以此為溶劑配制濃度為0.1 mmol/L的阿司匹林溶液，以及等濃度的水楊酸和醋酸溶液。

（2）確定工作波長。待紫外可見分光光度計穩(wěn)定后，以緩沖溶液為參比測定阿司匹林、水楊酸和醋酸溶液在210～600 nm波長范圍內(nèi)的紫外可見吸收光譜，選擇阿司匹林和醋酸干擾較小的水楊酸最大吸收波長為工作波長。

（3）測定阿司匹林水解反應(yīng)速率常數(shù)。將盛有適量新鮮配制的阿司匹林溶液的帶塞錐形瓶分別置于50、60、70和80℃的恒溫水浴槽中并開始計時。每隔10 min吸取少許反應(yīng)液滴入石英比色皿中并置于大量室溫水浴中冷卻2 min，然后以緩沖溶液為參比測定該反應(yīng)液的吸光度。其中，50、60、70和80℃恒溫水浴反應(yīng)的時長分別控制為180、180、120和90 min。

注意事項：阿司匹林溶液要現(xiàn)用現(xiàn)配，配制過程可以采用超聲輔助溶解；水浴加熱過程中錐形瓶磨和磨口之間可以夾持細濾紙條，在保證實驗安全的情況下盡可能地減少溶劑的揮發(fā)。

細節(jié)對于小說的情節(jié)發(fā)展和人物塑造有著至關(guān)重要的作用，這一點在虛構(gòu)文學(xué)作品中顯而易見。而放到“非虛構(gòu)”作品中，它卻常常被人所忽略。誠然，任何“非虛構(gòu)文學(xué)”都不可能沒有一點虛構(gòu)的成分，適當(dāng)合理的虛構(gòu)是必要的，也恰恰是將“非虛構(gòu)文學(xué)”推向成功的必然因素之一。顯然寧肯清楚的認識到了這一點，并成功的將其熟稔掌握，為小說文本增添了許多張力。

3 結(jié)果與討論

3.1 工作波長的確定

乙酰水楊酸、水楊酸和醋酸的pKa分別為3.57、2.98和4.75，在近中性的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中3者主要以離子的形式存在且對光的吸收集中在紫外區(qū)，如圖1所示。其中，水楊酸及其共軛離子的最大吸收波長為296 nm，阿司匹林和醋酸的共軛酸堿對在此波長理論上均不存在吸收［14］。由于常溫下阿司匹林水溶液的輕微水解，實際測得的A0和A∞分別為0.007 8和0.401 4。因此，實驗中可以忽略阿司匹林和醋酸的影響，采用296 nm波長處的吸光度A監(jiān)測水楊酸的濃度以及阿司匹林水解反應(yīng)的進度。

圖1 阿司匹林及其水解產(chǎn)物的紫外-可見吸收光譜

3.2 阿司匹林水解反應(yīng)的速率常數(shù)

圖2所示給出了不同溫度和反應(yīng)時長時阿司匹林水解反應(yīng)液在296 nm處的吸光度。隨著反應(yīng)時間的延長，吸光度的數(shù)值逐步增大，表明阿司匹林逐漸轉(zhuǎn)化為水楊酸；此外，隨反應(yīng)溫度從50℃提高到80℃，吸光度的遞增明顯加劇，表明升高溫度能夠加快阿司匹林水解反應(yīng)進程。

圖2 溫度和時間對阿司匹林溶液吸光度的影響

為降低原始數(shù)據(jù)點散亂性引起的誤差，利用Origin軟件中的ExpGro1型指數(shù)遞增函數(shù)擬合吸光度數(shù)據(jù)并采用擬合的At值以ln（A∞-At）對t作圖，結(jié)果如圖3所示。ln（A∞-At）與t高度線性相關(guān)，證實阿司匹林水解遵從一級反應(yīng)動力學(xué)。由擬合直線斜率得到阿司匹林水解反應(yīng)在50、60、70和80℃的速率常數(shù)分別為1.67×10-3、4.06×10-3、8.02×10-3和1.70×10-2min-1。

圖3 不同溫度下阿司匹林水解溶液的ln（A∞-A t）～t曲線

3.3 阿司匹林水解反應(yīng)的表觀活化能

基于不同溫度下阿司匹林水解反應(yīng)的k值，以lnk對1/T作圖并進行線性擬合，結(jié)果如圖4所示。擬合直線的線性回歸決定系數(shù)R2為0.998，較好地吻合Arrhenius方程。由擬合直線斜率得到的Ea為72.6 kJ/mol，符合68.6～73.6 kJ/mol的文獻值［15］，同時也接近傳統(tǒng)絡(luò)合顯色法測得的弱酸性介質(zhì)中阿司匹林水解反應(yīng)的活化能（69.8～73.0 kJ/mol）［9-11］，表明此實驗方法具有較高的準(zhǔn)確性。

圖4 溫度對阿司匹林水解反應(yīng)速率常數(shù)的影響

將圖4中的擬合直線進一步外推可得25℃時阿司匹林水解反應(yīng)的k為1.75×10-4/min，這一數(shù)值與Baker［16］的研究結(jié)果（1.54×10-4/min，22.5℃）吻合。相應(yīng)地，阿司匹林在NaH2PO4和Na2HPO4緩沖溶液中的有效期τ0.9為602 min，即10 h。如此短的藥物有效期表明阿司匹林不宜采用溶液型注射劑的形式保存。

3.4 阿司匹林水解反應(yīng)機理

阿司匹林水解反應(yīng)的機理與溶液的pH值密切相關(guān)。文獻［13-14］中詳細研究了不同pH值下的阿司匹林水解反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在pH值為4.5～8.5時其水解反應(yīng)速率幾乎不變且反應(yīng)機理以Br?nsted堿（B堿）輔助的水分子親核加成為主，即：

水分子不是一個活潑的親核試劑，在中性環(huán)境中難以進攻酯羰基碳并引發(fā)酰氧鍵的斷裂（反應(yīng)決速步）。但阿司匹林的羧基在pH值大于4.5的環(huán)境中主要以羧酸根離子（B堿）的形式存在，能夠誘導(dǎo)水分子的去質(zhì)子化并賦予其更強的親核能力［14］。因此，中性環(huán)境中阿司匹林水解反應(yīng)的機理主要為分子內(nèi)B堿輔助的水分子親核加成。

4 結(jié) 語

阿司匹林有效期的測定是一個以化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)為主，同時涵蓋紫外分光光度法、酯水解反應(yīng)機理和藥物劑型設(shè)計等相關(guān)知識點的短學(xué)時綜合化學(xué)實驗。該實驗以學(xué)生感興趣的真實問題為導(dǎo)向，能夠有效激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)主動性并訓(xùn)練其綜合運用所學(xué)理論知識分析和解決實際問題的能力。此外，該實驗反應(yīng)條件溫和、試劑使用量少、不產(chǎn)生酸堿廢液且不涉及大型高端儀器的使用，有望替代傳統(tǒng)的蔗糖水解和乙酸乙酯皂化反應(yīng)動力學(xué)實驗在普通高等院校物理化學(xué)實驗教學(xué)中推廣。