符青云 歐陽(yáng)小明 郅 程 曾 亮

1 廣東省江門市五邑中醫(yī)院病理科(江門 529031)

2 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科(廣州 510260)

3 廣州市婦女兒童醫(yī)療中心病理科(廣州 510623)

本研究前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)核結(jié)合蛋白2(nucleobindin- 2，NUCB2)表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)[1]。關(guān)于NUCB2介導(dǎo)的信號(hào)通路有一些報(bào)道，如在結(jié)腸癌及子宮內(nèi)膜癌的研究中發(fā)現(xiàn)NUCB2通過(guò)LKB1/AMPK/TORC1/ZEB1途徑增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[2，11- 12]。NUCB2通過(guò)雷帕霉素靶向途徑抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖[3]。在本研究中，通過(guò)基因芯片方法研究乳腺癌細(xì)胞中NUCB2介導(dǎo)的信號(hào)通路及相關(guān)信號(hào)分子，為進(jìn)一步闡明NUCB2乳腺癌中促轉(zhuǎn)移的功能提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB- 231，培養(yǎng)基為90%高糖DMEM+10%胎牛血清。 生長(zhǎng)條件為95%空氣和5%CO2，37 ℃。qPCR所使用的引物序列見表1。

表1 qPCR的逆轉(zhuǎn)錄引物

1.2 RNAi 慢病毒載體構(gòu)建、包裝、感染細(xì)胞并檢測(cè)感染效率

目的基因及工具載體信息，載體酶切：配制 50 μL 酶切體系。對(duì)載體酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶。目的基因片段的獲取：核心序列、病毒載體構(gòu)建框架、合成單鏈引物、引物退火形成雙鏈 DNA。退火產(chǎn)物與載體進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化。菌落 PCR 鑒定。測(cè)序。質(zhì)粒抽提。最終用于實(shí)驗(yàn)的分組包括對(duì)照組(無(wú)病毒感染的細(xì)胞組)、NC組(陰性對(duì)照病毒感染的細(xì)胞組)、KD組(感染NUCB2基因shRNA病毒的細(xì)胞組)。

1.3 總RNA 抽提及實(shí)時(shí)定量PCR

總RNA 抽提(上海普飛公司Trizol 試劑盒)抽提，收集細(xì)胞(6 孔板 80%細(xì)胞密度)，2 000 r/min離心 5 min，去上清，細(xì)胞沉淀中加入 1 mL Trizol，充分混勻后室溫靜置 5 min，然后轉(zhuǎn)至新的 1.5 mL EP 管中；每管加入 200 μL 氯仿，用手上下顛倒 EP 管 15 s，室溫靜置 10 min。4 ℃、12 800 r/min，離心 15 min。吸取上層液體轉(zhuǎn)至新的 1.5 mL EP 管，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻后 4 ℃靜置 10 min。4 ℃、12 800 r/min 離心 12 min 后，棄上清。加入 1 mL 、75%乙醇(用 DEPC 水新鮮配制)，洗滌沉淀。4 ℃、11 800 r/min離心5 min，棄去大部分上清。 4 ℃、11 800 r/min 再次離心5 min，棄去上清，室溫干燥。待 RNA 沉淀基本透明時(shí)，加入 RNase-free 水，至完全溶解，Nanodrop 2000/2000C 分光光度計(jì)分析測(cè)定所抽提 RNA 的濃度及質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA(使用Promega M-MLV 試劑盒)。

Real-time PCR 檢測(cè)按下列比例配置反應(yīng)體系(12 μL體系)：MicroRNA PCR引物來(lái)自廣州市銳博生物科技有限公司。試劑每管加入量SYBR premix ex taq 6.0 μL，上游引物(5 μmol) 0.5 μL，下游引物(5 μmol) 0.5 μL，模板(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物) 1.0 μL，RNase-Free H2O 4.0 μL。② RNA PCR試劑 每管加入量SYBR premix ex taq 6.0 μL，引物mix(5 μmol) 0.3 μL，模板(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物) 0.6 μL，RNase-Free H2O 5.1 μL。相對(duì)定量分析F=2-ΔΔCt，ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；-ΔΔCt=NC組ΔCt平均值-各樣品ΔCt值；ΔΔCt反映各樣品相對(duì)NC組樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)水平，引物序列見表1。

1.4 Affymetrix基因表達(dá)譜芯片篩選下游通路相關(guān)基因

RNA 質(zhì)檢使用 NanoDrop2000 與 Agilent 2100 檢測(cè)。3′IVT 反應(yīng)：總 RNA 起始量范圍：50～500 ng。RNA 擴(kuò)增程序: First-Strand cDNA Synthesis 42 ℃，2 hr → 4 ℃保持。Second-Strand cDNA Synthesis 16 ℃，1 hr → 65 ℃，10 min → 4 ℃保持。IVT 40 ℃，16 hr → 4 ℃保持。Fragmentation 94 ℃，35 min → 4 ℃保持。poly-A RNA 對(duì)照準(zhǔn)備：將稀釋好的 poly-A RNA 與總 RNA 混合，poly-A RNA 作為整個(gè)操作流程的內(nèi)部對(duì)照。一鏈 cDNA 合成：配制一鏈合成反應(yīng)液，加入 poly-A RNA/總 RNA mix。使用“First-Strand cDNA Synthesis”程序孵育，合成 cDNA。二鏈 cDNA 合成：配制二鏈合成反應(yīng)液，加入一鏈合成產(chǎn)物。使用“Second-Strand cDNA Synthesis”程序孵育，合成雙鏈的 cDNA 模板。IVT 反應(yīng)：配制 IVT(體外反轉(zhuǎn))反應(yīng)液，加入二鏈合成產(chǎn)物。使用“IVT”程序孵育，反轉(zhuǎn)獲得帶生物素標(biāo)簽的 aRNA。aRNA 純化：用 GeneChip 3′IVT Express Kit 內(nèi)的純化試劑純化 aRNA。純化的 aRNA 用 nanodrop 2000 測(cè)定濃度。 aRNA 片段化：配制 aRNA 片段化反應(yīng)液，加入已純化的 aRNA。Hybridization 98 ℃，10 min→ 45 ℃，3 min→ 45 ℃保持。使用“Fragmentation”程序孵育，獲得片段化產(chǎn)物。雜交: 配制雜交反應(yīng)液。使用“Hybridization”程序加熱雜交液。同時(shí)，向芯片注入 130 μL 預(yù)雜交液，45 ℃雜交爐預(yù)雜交 10 min。吸去芯片的預(yù)雜交液，注入 130 μL 雜交液。放于雜交爐中，45 ℃，60 r/min 雜交 16 min。雜交完成后取出芯片，用 GeneChip Fluidics Station 450 儀器進(jìn)行自動(dòng)洗染。洗染完成后進(jìn)行掃描，獲得數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。需要分析的2組通過(guò)F檢驗(yàn)(方差同質(zhì)性檢驗(yàn))進(jìn)行檢驗(yàn)。當(dāng)F檢驗(yàn)值大于0.05時(shí)，采用等方差雙樣本檢驗(yàn)得到t檢驗(yàn)值。當(dāng)F檢驗(yàn)值小于0.05時(shí)，采用異方差雙樣本檢驗(yàn)得到t檢驗(yàn)值。t檢驗(yàn)值<0.05，說(shuō)明兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t檢驗(yàn)值>0.05，說(shuō)明2組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qPCR檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中NUCB2的表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示與NC組比較，KD組NUCB2基因敲減效率達(dá)到90.6%，見圖1和表2。

圖1 qPCR顯示siRNA敲除后 MDA-MB- 231細(xì)胞株中NUCB2的mRNA水平

表2 qPCR顯示siRNA敲除后 MDA-MB- 231細(xì)胞株中NUCB2mRNA水平

2.2 Path-Array 芯片研究NUCB2介導(dǎo)的差異表達(dá)基因

在本項(xiàng)目中，使用基于經(jīng)驗(yàn)偏差分布的線性模型來(lái)計(jì)算顯著性差異水平P值，并使用Benjamini-Hochberg方法來(lái)校正顯著性差異水平(false discovery rate,FDR)。顯著差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為|Fold Change|>1.5和FDR<0.05。與NC組比較，KD組上調(diào)基因186個(gè)，下調(diào)基因356個(gè)，部分差異表達(dá)基因見表3、表4。

表3 阻斷nucb2后MDA-MB- 231細(xì)胞部分上調(diào)基因

續(xù)表

續(xù)表

表4 阻斷NUCB2表達(dá)后MDA-MB- 231細(xì)胞部分下調(diào)基因

2.3 用qPCR驗(yàn)證部分差異表達(dá)基因的表達(dá)情況

在MDA-MB- 231細(xì)胞株中，qPCR檢測(cè)阻斷NUCB2后部分上調(diào)基因，即與NC組比較KD組上調(diào)基因，包括即刻早期反應(yīng)3相互作用蛋白1(immediate early response 3 interacting protein 1，IER3IP1)、基本轉(zhuǎn)錄因子3樣4(basic transcription factor 3-like 4， BTF3L4)、Rho-GDP解離抑制因子β(Rho GDP dissociation inhibitor beta，ARHGDIB)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1(insulin like growth factor binding protein 1，IGFBP1)，共濟(jì)失調(diào)蛋白1(ataxin, ATXN1)。結(jié)果顯示KD組IER3IP1、BTF3L4、ARHGDIB、IGFBP1、ATXN1的mRNA水平高于NC組，見圖2A-E。

在MDA-MB- 231中，qPCR檢測(cè)阻斷NUCB2后下調(diào)基因，即與NC組比較KD組下調(diào)基因，包括腸細(xì)胞激酶(intestinal cell kinase，ICK)、鉀通道四聚體化結(jié)構(gòu)域12(potassium channel tetramerization domain containing 12, KCTD12)、熱休克蛋白家族D成員1(heat shock protein family D member 1, HSPD1)、PDX1 C末端抑制因子1(PDX1 C-terminal inhibiting factor 1，PCIF1)、細(xì)胞周期蛋白E2(cyclin E2, CCNE2)。結(jié)果顯示KD組的ICK、KCTD12、HSPD1、PCIF1、CCNE2的mRNA水平低于NC組，見圖2F-J。

圖3 qPCR對(duì)kd和nc部分差異表達(dá)基因的表達(dá)水平

2.4 NUCB2介導(dǎo)的差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析

2.4.1 基于獨(dú)創(chuàng)性通路分析(ingenuity pathway analysis,IPA)的經(jīng)典通路分析 圖4顯示差異基因在經(jīng)典通路中的顯著性富集情況。在圖4中，橫坐標(biāo)為通路名稱，縱坐標(biāo)為富集的顯著性水平(以10為底的負(fù)對(duì)數(shù)變換)；其中，橙色標(biāo)注表示通路被激活(Z-score>0)，藍(lán)色標(biāo)注表示通路被抑制(Z-score<0)，橙色和藍(lán)色的深淺(或Z-score的絕對(duì)值)代表激活或抑制的程度(依照IPA的內(nèi)部算法和標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為Z-score>2代表該通路被顯著激活，Z-score<- 2代表該通路被顯著抑制)；Ratio表示在此信號(hào)通路中差異基因數(shù)與該通路中包含的所有基因數(shù)的比值。在本項(xiàng)目中，膽固醇生物合成的超途徑(Superpathway of Cholesterol Biosynthesis)被顯著抑制，Z-score為- 3.162。

圖4 通過(guò)PathArray進(jìn)行的NUCB2介導(dǎo)的經(jīng)典路徑分析

2.4.2 基于IPA的上游控制分析 上游調(diào)控因子分析表展示了本項(xiàng)目中所有差異基因的上游調(diào)控因子。上游調(diào)控因子可以是任何能夠影響基因表達(dá)的分子，它覆蓋了全部的分子類型，包括轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞活素，小RNA，受體，激酶，化學(xué)分子和藥物。IPA使用了Activation Z-score算法，對(duì)上游調(diào)控子的激活或者抑制進(jìn)行預(yù)測(cè)，并降低了由于隨機(jī)數(shù)據(jù)造成的顯著預(yù)測(cè)。在本項(xiàng)目中NUPR1被預(yù)測(cè)為強(qiáng)烈激活，該基因存在45個(gè)一致激活的基因，E2F1被預(yù)測(cè)為強(qiáng)烈抑制，該基因存在21個(gè)一致抑制的基因。

圖5 NUCB2上游調(diào)控因子網(wǎng)絡(luò)圖

2.4.3 基于IPA的疾病和功能分析 圖6顯示差異基因在疾病與功能中的顯著性富集情況。在圖6中，橫坐標(biāo)為通路名稱，縱坐標(biāo)為富集的顯著性水平(以10為底的負(fù)對(duì)數(shù)變換)。柱狀圖顯示出明顯的激活相關(guān)功能，包括金屬釋放、脂質(zhì)積聚和明顯的抑制相關(guān)功能如細(xì)胞死亡、肌肉萎縮。

圖6 NUCB2介導(dǎo)的疾病功能分析柱狀圖

圖7顯示差異基因表達(dá)水平的變化對(duì)疾病與功能的激活抑制關(guān)系。橙色代表疾病或功能狀態(tài)被激活(Z-score>0)，藍(lán)色代表疾病或功能狀態(tài)被抑制(Z-score<0)，灰色表示疾病或功能狀態(tài)未確定(Z-score無(wú)法計(jì)算)。依照IPA的內(nèi)部算法和標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為Z-score>2代表該疾病或功能被顯著激活，Z-score<- 2代表該疾病或功能被顯著抑制。顯著激活的疾病或功能包括：發(fā)病率或死亡率(Z-score=4.080)，生物的死亡(3.921)等；顯著抑制的疾病或功能包括：成纖維細(xì)胞株凋亡(- 2.481)，葡萄糖代謝障礙(- 2.380)等。

圖7 NucB2介導(dǎo)的疾病和功能的熱圖

圖8顯示基因與疾病或功能之間的激活與抑制關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)中包含與指定的疾病或功能相關(guān)的所有差異基因，并展示了它們之間基于Ingenuity知識(shí)庫(kù)的可能的互作關(guān)系和表達(dá)變化趨勢(shì)。其中橙色線表示基因表達(dá)水平變化對(duì)該功能具有激活作用，藍(lán)色線表示基因表達(dá)水平變化對(duì)該功能具有抑制作用，黃色線表示基因表達(dá)水平變化對(duì)該功能的影響與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道不一致，灰色線表示調(diào)控關(guān)系未知。

圖8 基因疾病或功能網(wǎng)絡(luò)圖

2.4.4 基于IPA的調(diào)控效應(yīng)分析 圖9顯示差異基因參與的上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與下游功能的可能的作用途徑。Consistency Score是網(wǎng)絡(luò)中上游調(diào)控因子、數(shù)據(jù)集和疾病與功能之間的因果關(guān)系一致性和密集連接的度量標(biāo)準(zhǔn)，Consistency Score越高，表示調(diào)控效應(yīng)結(jié)果越準(zhǔn)確。在本項(xiàng)目中DLL4等調(diào)控子通過(guò)CCNE2等基因?qū)enign lesion具有激活作用。

圖9 調(diào)控效應(yīng)分析表

圖10展示了數(shù)據(jù)集中的基因與調(diào)控子和功能之間的相互作用關(guān)系。此調(diào)控效應(yīng)分析中排名第一的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)展示了數(shù)據(jù)集可能由于調(diào)控子DLL4, HDL-cholesterol, mir- 8通過(guò)CCNE2, DHCR7, EGR1, ETS1, FDFT1, FHOD1, GATA3, MCM3, MCM7, MYH10, NR2F2, SKP2, TGFB2等基因?qū)α夹圆∽?benign lesion)，先心病(congenital heart disease)，生長(zhǎng)阻滯(growth failure)，圍產(chǎn)期死亡(perinatal death)具有激活作用，對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(cell movement), 體質(zhì)量(size of body)具有抑制作用。

圖10 調(diào)控效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

本研究在以往對(duì)乳腺癌中NUCB2作用的蛋白質(zhì)組學(xué)和臨床病理學(xué)研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用Path-Array芯片篩選了NUCB2介導(dǎo)的下游和信號(hào)通路。乳腺癌細(xì)胞中阻斷NUCB2后，發(fā)現(xiàn)共有186個(gè)上調(diào)基因和356個(gè)下調(diào)基因，其中一些差異表達(dá)基因經(jīng)過(guò)mRNA檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果和Path-Array結(jié)果的高度一致。

應(yīng)用IPA分析不同表達(dá)基因。首先，經(jīng)典的通路分析表明，阻斷NUCB2可抑制一系列通路包括膽固醇生物合成超級(jí)通路、膽固醇生物合成通路I、膽固醇生物合成通路II、膽固醇生物合成通路III、ERK/MAPK信號(hào)，其中膽固醇生物合成超級(jí)通路受到最顯著的抑制。據(jù)報(bào)道 Nesfatin- 1通過(guò)其受體誘導(dǎo)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白CREB的磷酸化，從而激活神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的[4]。NUCB2調(diào)控EGF刺激的MAPK激酶/ERK信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖和脂肪細(xì)胞分化，NUCB2敲除細(xì)胞的細(xì)胞增殖顯著降低[5]。

但是，NUCB2與膽固醇生物合成關(guān)系的研究還沒有直接報(bào)道。其次，上游調(diào)控因子分析表明，上游調(diào)控因子可以是影響基因表達(dá)的任何分子，它涵蓋了所有的分子類型，包括轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子、小RNA、受體、激酶、化學(xué)分子和藥物。本研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控NUCB2的分子中，NUPR1被預(yù)測(cè)為強(qiáng)烈激活，E2F1被預(yù)測(cè)為強(qiáng)烈抑制，該基因有21個(gè)一致的基因。進(jìn)一步的上游調(diào)控子網(wǎng)絡(luò)圖顯示了與上游調(diào)控因子直接相關(guān)的數(shù)據(jù)集中上游調(diào)控因子與下游分子共存的相互作用。例如，NUPR1可以提高Ets1的mRNA水平，但在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中Ets1明顯下調(diào)。NUPR1和IPP的表達(dá)趨勢(shì)一致。此外，IPA的疾病和功能柱狀圖顯示出明顯的激活相關(guān)功能，包括金屬釋放、脂質(zhì)積聚和明顯的抑制相關(guān)功能如細(xì)胞死亡、肌肉萎縮。

這些生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，一方面是參與脂質(zhì)合成和代謝的途徑和分子可能在NUCB2功能中發(fā)揮重要作用，值得進(jìn)一步研究。另一方面是釋放與NUCB2功能相關(guān)的金屬，NUCB2與G蛋白偶聯(lián)受體相互作用，導(dǎo)致鈣離子增加，這與培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元中蛋白激酶C的激活有關(guān)[6]。NUCB2通過(guò)N型通道刺激鈣離子內(nèi)流激活迷走神經(jīng)傳入神經(jīng)元，證實(shí)NUCB2可將信號(hào)傳到腦組織[7]。NUCB2也參與高爾基體內(nèi)鈣離子儲(chǔ)存，以及涉及DNA結(jié)合和蛋白質(zhì)相互作用的生物學(xué)過(guò)程。在沒有鈣離子的情況下，NUCB的鈣離子結(jié)合域處于無(wú)結(jié)構(gòu)狀態(tài)，而加上Ca2+則會(huì)折疊[8,4]。據(jù)報(bào)道，NUCB2可抑制核因子kappa-B依賴性炎癥反應(yīng)，減輕大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后caspase- 3介導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[9]。NUCB2通過(guò)參與Bax、Bcl-Xl和Bcl- 2基因以及ERK1/2, p38 和JNK1/2 信號(hào)級(jí)聯(lián)，抑制人腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞模型(H295R)細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)凋亡。這提示NUCB2在腎上腺皮質(zhì)區(qū)發(fā)育中發(fā)揮作用，也可能是腎上腺癌的治療靶點(diǎn)[10，12]。據(jù)報(bào)道，NUCB2通過(guò)mTOR和RhoA/ROCK信號(hào)通路誘導(dǎo)凋亡，抑制人卵巢上皮癌HO- 8910細(xì)胞系的增殖[3]。NUCB2調(diào)控EGF刺激的MAPK激酶/ERK信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖和脂肪細(xì)胞分化[5]。

關(guān)于NUCB2在疾病特別是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中信號(hào)通路的研究報(bào)道較少，對(duì)于本研究發(fā)現(xiàn)的一些NUCB2相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)一步的研究重點(diǎn)是闡明NUCB2功能與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)系。