黃康勤

廣西河池大化縣人民醫(yī)院，廣西 河池 530800

呼吸道感染（respiratory tract infection，RTI）是指由于各種原因?qū)е虏≡w如細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲等侵襲人體呼吸道引起的感染，臨床癥見(jiàn)流涕、咳嗽、頭痛、咽痛、發(fā)熱、乏力、肢體酸痛［1］等，是臨床常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，全年皆可發(fā)病。該病發(fā)病率高，人群普遍易染，而且呼吸道感染未及時(shí)得到治療可引發(fā)中耳炎、支氣管炎、肺炎，甚至敗血癥、腎炎、病毒性心肌炎等全身炎癥癥狀［2］。目前主要以對(duì)癥處理為主，予抗病毒藥物聯(lián)合抗菌藥物治療，但抗生素選擇的針對(duì)性較差，且隨著抗生素長(zhǎng)期廣泛應(yīng)用，耐藥菌株不斷增多，加之抗生素毒副作用相對(duì)較大，因此從天然產(chǎn)物尤其是從中藥中分離篩選有效抗菌組分成為抗菌藥物研發(fā)領(lǐng)域的研究方向之一。穿心蓮內(nèi)酯是從穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees中分離出的二萜內(nèi)酯，具有抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用［3］，能抗人體呼吸系統(tǒng)感染，被譽(yù)為“天然抗生素”［4］，其潛在機(jī)制仍有待研究。

近年來(lái)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的迅速發(fā)展為中醫(yī)藥的研究帶來(lái)了契機(jī)，給中藥復(fù)雜成分研究提供了簡(jiǎn)便方法。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過(guò)整體性研究藥物、靶點(diǎn)、基因、疾病相互之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，綜合觀察和揭示藥物協(xié)同干預(yù)與影響疾病的作用機(jī)制，與中醫(yī)整體觀念相似［5］，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)探討穿心蓮內(nèi)酯抗呼吸道感染的分子作用機(jī)制。

1 方法與思路

1.1 穿心蓮內(nèi)酯相關(guān)信息及作用靶標(biāo)預(yù)測(cè)穿心蓮是一種傳統(tǒng)用作抗炎和抗菌的藥用植物，穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮的主要活性成分，具有多種藥理活性，包括抗炎、抗癌、抗肥胖、抗糖尿病和其他活性［6］。穿心蓮內(nèi)酯屬于二萜內(nèi)酯類成分，這些化合物含有γ-丁內(nèi)酯部分，該部分由含有四個(gè)碳原子和一個(gè)氧原子的脂肪族五元環(huán)組成，并在氧原子附近的碳上帶有酮基，其化學(xué)結(jié)構(gòu)2D 平面結(jié)構(gòu)和3D 分子結(jié)構(gòu)模型見(jiàn)圖1。本研究從Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù) 據(jù)庫(kù)下載穿心蓮內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過(guò)PubMed（http：//kns. cnki. net）、DrugBank（https：//www.drugbank.ca）、Swiss Target Prediction（http：//www. swisstargetprediction. ch/）和BATMAN（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php）數(shù)據(jù)庫(kù)查找穿心蓮內(nèi)酯的作用靶標(biāo)，再經(jīng)過(guò)Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)逐一核查是否為人源性靶點(diǎn)并更正基因名。

圖1 穿心蓮內(nèi)酯化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2 呼吸道感染相關(guān)信息及作用靶標(biāo)預(yù)測(cè)呼吸系統(tǒng)感染是人體常見(jiàn)病和多發(fā)病，主要以細(xì)菌和病毒感染為主。在一些情況下，病毒感染導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解，數(shù)百萬(wàn)拷貝的病毒被釋放，這影響了細(xì)胞存活所需的能量平衡，不平衡的能量產(chǎn)生與消耗導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。一些慢性感染可導(dǎo)致管家基因和細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)改變，從而將其轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞或使免疫系統(tǒng)過(guò)度活化［7］，在該過(guò)程中會(huì)引起機(jī)體的一系列復(fù)雜的生物過(guò)程。

CTD 是一個(gè)強(qiáng)大的公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)，它提供關(guān)于化學(xué)-基因/蛋白質(zhì)相互作用、化學(xué)-疾病和基因-疾病關(guān)系的人工精選信息。這些數(shù)據(jù)與功能和途徑數(shù)據(jù)相結(jié)合，有助于發(fā)展關(guān)于環(huán)境影響疾病潛在機(jī)制的假設(shè)，旨在促進(jìn)對(duì)環(huán)境暴露如何影響人類健康的理解。

本研究從CTD、Genecards和DIGSEE數(shù)據(jù)庫(kù)中查找關(guān)于呼吸道感染的基因靶點(diǎn)，以“Respiratory Tract Infection”為檢索式，下載數(shù)據(jù)庫(kù)中與呼吸道感染有關(guān)的基因靶點(diǎn)，合并去重，并核查是否為人源性靶點(diǎn)，并校對(duì)基因名。

1.3 穿心蓮內(nèi)酯作用于呼吸道感染的靶點(diǎn)蛋白相互作用分析將穿心蓮內(nèi)酯作用靶標(biāo)與呼吸道感染有關(guān)的基因靶點(diǎn)進(jìn)行交集，得到重疊靶點(diǎn)，認(rèn)為這些重疊靶點(diǎn)是穿心蓮內(nèi)酯對(duì)呼吸道感染的潛在作用靶點(diǎn)。將潛在作用靶點(diǎn)信息提交至STRING（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白互作（Protein-Protein Interaction，PPI）分析，選擇“Homo sapiens”人類為研究機(jī)體，設(shè)置中度交互分?jǐn)?shù)為0.4，得到潛在作用靶蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)。借助Cytoscape 軟件插件“Network Analyzer”進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，綜合預(yù)測(cè)相關(guān)性較大的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

1.4 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)呼吸道感染的潛在作用靶點(diǎn)的生物信息學(xué)分析利用Cytoscape 軟件中的插件“Clue GO”對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程（Biological Process）分析和KEGG 信號(hào)通路富集分析。將靶點(diǎn)信息提交至Clue GO，選擇分析基因本體GO-生物學(xué)過(guò)程，研究條件選擇數(shù)據(jù)來(lái)源于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)［All_Experimental_（EXP，IDA，IPl，IMP，IGI，IEP）］，限定P值＜0.01，得到生物學(xué)過(guò)程數(shù)據(jù)。勾選KEGG分析，校正P值＜0.05，得到富集的信號(hào)通路。

1.5 分子對(duì)接反向驗(yàn)證穿心蓮內(nèi)酯與潛在作用靶點(diǎn)的結(jié)合性采用IGEMDOCK 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，IGEMDOCK 軟件分子對(duì)接原理是基于對(duì)接位點(diǎn)（即蛋白質(zhì)-配體相互作用）和化合物性質(zhì)（即原子組成）使用k-均值和分層聚類方法提供后分析工具［8］，軟件提供交互式界面，以制備靶蛋白結(jié)合位點(diǎn)和篩選復(fù)合物庫(kù)［9］。從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取受體信息即作用靶蛋白信息，下載并保存為PDB 格式；從Pubchem 下載配體即穿心蓮內(nèi)酯3D 構(gòu)象的SDF 格式，同時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)镸OL 格式，將受體蛋白和化合物分子信息輸入軟件后選擇標(biāo)準(zhǔn)對(duì)接，其他默認(rèn)設(shè)置，得到分子對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯的作用靶點(diǎn)根據(jù)PubMed、DrugBank、Swiss Target Prediction 和BATMAN數(shù)據(jù)庫(kù)，以及文獻(xiàn)檢索查找到穿心蓮內(nèi)酯的作用靶標(biāo)122 個(gè)，包括腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、缺氧誘導(dǎo)因子1 亞單位α（HIF1α）等，穿心蓮內(nèi)酯作用靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖2，根據(jù)作用靶點(diǎn)的度值進(jìn)行排序，由藍(lán)色向紫色漸變，顏色越深表示靶點(diǎn)度值越大，兩個(gè)靶點(diǎn)之間的連線粗細(xì)體現(xiàn)兩個(gè)靶點(diǎn)間交互值大小，線條越粗交互值越大。由網(wǎng)絡(luò)圖可見(jiàn)TP53、IL-6、CASP3、MAPK3和TNF是度值較大的靶點(diǎn)。

圖2 穿心蓮內(nèi)酯作用靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 穿心蓮內(nèi)酯作用于呼吸道感染的潛在作用靶點(diǎn)以呼吸道感染“Respiratory Tract Infection”為檢索式在CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)、Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)和DIGSEE 數(shù)據(jù)庫(kù)中查找關(guān)于呼吸道感染的基因靶點(diǎn)，其中在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)和Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的靶點(diǎn)中，僅根據(jù)作用靶點(diǎn)與呼吸道感染的相關(guān)度評(píng)分函數(shù)各取前300個(gè)代表性靶點(diǎn)，3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)搜集到的靶點(diǎn)合并去重后獲得677 個(gè)與呼吸道感染相關(guān)的靶點(diǎn)。通過(guò)VENNY 2.1 在線分析服務(wù)器將穿心蓮內(nèi)酯作用靶標(biāo)與呼吸道感染相關(guān)的靶點(diǎn)交集，得到35 個(gè)交集靶點(diǎn)，包含BCL2 凋亡調(diào)節(jié)劑（BCL2）、血紅素氧合酶1（HMOX1）、腫瘤蛋白p53（TP53）、基質(zhì)金屬肽酶9（MMP9）等。

2.3 潛在作用靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)鋵傩苑治鰧?5 個(gè)交集靶點(diǎn)信息導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白互作分析，利用Cytoscape 軟件將結(jié)果進(jìn)行可視化分析，交集靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖3，并對(duì)交集靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，?jiàn)表1。通過(guò)計(jì)算分析，發(fā)現(xiàn)該網(wǎng)絡(luò)平均度值約15.1，平均介數(shù)中心性約22.5，平均中心接近度約0.02，如果某個(gè)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中具有較高的度數(shù)和介數(shù)中心性可能意味這個(gè)節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)圖及拓?fù)鋵傩员戆l(fā)現(xiàn)度值和介數(shù)中心性均大于均值的節(jié)點(diǎn)有8 個(gè)，分別是IL6、TP53、TNF、CASP3、SRC、MAPK3、MMP9 和IL1B，說(shuō)明這8 個(gè)靶蛋白可能是穿心蓮內(nèi)酯作用于呼吸道感染的重要作用靶點(diǎn)。

表1 潛在作用靶點(diǎn)的拓?fù)鋵傩?/p>

圖3 穿心蓮內(nèi)酯潛在作用靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 穿心蓮內(nèi)酯潛在作用靶點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程分析經(jīng)Cytoscape 軟件插件—Clue GO 進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程分析，得到112 個(gè)條目，包括活性氧代謝過(guò)程、對(duì)白細(xì)胞介素1 的反應(yīng)、調(diào)節(jié)激素代謝過(guò)程、內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的負(fù)性調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)抗生素的反應(yīng)、調(diào)節(jié)環(huán)化酶活性、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等，見(jiàn)圖4—5，按照屬性可大致分為12個(gè)集群。

圖4 穿心蓮內(nèi)酯潛在作用靶點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程分析

圖5 穿心蓮內(nèi)酯潛在作用靶點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程分析

2.5 穿心蓮內(nèi)酯潛在作用靶點(diǎn)的信號(hào)通路分析經(jīng)Clue GO 對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，校正P值＜0.05 得到包括NF-κB 信號(hào)通路、炎癥性腸?。↖BD）、p53 信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路、TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)、甲狀腺激素信號(hào)通路、GnRH信號(hào)通路等95條信號(hào)通路，通路信息見(jiàn)表2。

表2 穿心蓮內(nèi)酯潛在作用靶點(diǎn)富集的信號(hào)通路

2.6 穿心蓮內(nèi)酯與潛在作用靶點(diǎn)的結(jié)合性通過(guò)IGEMDOCK 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，得到分子對(duì)接評(píng)分函數(shù)。由于IGEMDOCK 軟件采用的是經(jīng)驗(yàn)打分函數(shù)，其經(jīng)驗(yàn)評(píng)分函數(shù)估計(jì)是使用“結(jié)合能=范德華力+氫鍵”公式計(jì)算得到［10］，化合物分子與受體結(jié)合作用可能性越大，則兩者間結(jié)合能量越低，結(jié)合更穩(wěn)定。穿心蓮內(nèi)酯與潛在作用靶蛋白靶點(diǎn)結(jié)合能平均值在-93.0kcal/mol 以上，預(yù)測(cè)出結(jié)合最穩(wěn)定的是TNF與穿心蓮內(nèi)酯的結(jié)合。見(jiàn)表3。

表3 分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

穿心蓮內(nèi)酯具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗過(guò)敏、抗血小板聚集、抗艾滋病毒等［11］，臨床多用于治療感冒、咽喉痛、流感及呼吸系統(tǒng)感染。本研究通過(guò)大數(shù)據(jù)信息篩查穿心蓮內(nèi)酯的作用靶點(diǎn)與呼吸道感染相關(guān)的發(fā)病靶點(diǎn)，預(yù)測(cè)有35 個(gè)靶點(diǎn)是穿心蓮內(nèi)酯抗呼吸道感染的潛在靶點(diǎn)，包括MAPK3、MMP9、BCL2、HMOX1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A（CDKN2A）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）等；通過(guò)對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作分析，得到8 個(gè)靶點(diǎn)（IL6、TP53、TNF、CASP3、SRC、MAPK3、MMP9 和IL1B）是較重要的潛在作用靶點(diǎn)。MMPs（基質(zhì)金屬肽酶）是一類依賴Zn2+和Ca2+的超家族成員，可降解的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶在維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性方面有重要意義，而在炎癥性疾病中MMPs 發(fā)揮溶解細(xì)胞外基質(zhì)和破壞基膜的作用，MMP9 參與了炎癥、血管形成和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等病理生理過(guò)程［12］，有研究表明穿心蓮內(nèi)酯可通過(guò)NF-κB p65 亞基的核移位和iκb 磷酸化、降低MMP-9 的表達(dá)和活性發(fā)揮抗肺癌作用［13］。HMOX1（血紅素加氧酶1，HO-1）是參與血紅素降解的一種酶，在血紅素降解的發(fā)病機(jī)制中起重要作用［14］，具有抗炎和抗氧化作用，可調(diào)節(jié)宿主先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，以響應(yīng)敗血癥、移植和自身免疫反應(yīng)，并防止與炎癥相關(guān)的氧化損傷［15］，有體外數(shù)據(jù)表明HO-1 誘導(dǎo)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞，特別是氣道上皮細(xì)胞對(duì)hRSV（呼吸道合胞病毒）感染的易感性［16］，LU等［17］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯部分地通過(guò)抑制NADPH氧化酶活化，誘導(dǎo)HO-1 和GCLM（谷氨酸半胱氨酸連接酶修飾亞基）表達(dá)以減弱TNF-α誘導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)；SRC 蛋白酪氨酸激酶被認(rèn)為是許多細(xì)胞過(guò)程中的重要信號(hào)傳遞者，如生長(zhǎng)、基因轉(zhuǎn)錄、黏附和凋亡，SRC 在介導(dǎo)TNF-α誘導(dǎo)的ICAM-1 磷酸化中發(fā)揮重要作用，這對(duì)多核白細(xì)胞黏附至關(guān)重要，而穿心蓮內(nèi)酯可抑制TNF-α誘導(dǎo)的SRC 磷酸化。推測(cè)穿心蓮內(nèi)酯通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)與否，可進(jìn)一步干預(yù)疾病的發(fā)生發(fā)展，并且這些實(shí)驗(yàn)研究也反向證明預(yù)測(cè)的穿心蓮內(nèi)酯作用靶點(diǎn)具有一定準(zhǔn)確性。

對(duì)穿心蓮內(nèi)酯的作用靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程分析和信號(hào)通路富集分析，得出這些靶點(diǎn)參與112種生物學(xué)過(guò)程，涉及活性氧代謝過(guò)程、對(duì)IL-1 的反應(yīng)、調(diào)節(jié)激素代謝過(guò)程、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的負(fù)性調(diào)節(jié)等，富集出95 條信號(hào)通路，如NF-κB 信號(hào)通路、炎癥性腸?。↖BD）、p53 信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路、TRP 通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)等。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯治療呼吸道感染與NF-κB信號(hào)通路有密切關(guān)系，DING 等［18］在研究穿心蓮內(nèi)酯在流感病毒感染的小鼠體內(nèi)的抗流感活性，其機(jī)制研究表明穿心蓮內(nèi)酯的活性與NF-κB和jak-stat信號(hào)通路有關(guān)，穿心蓮內(nèi)酯可通過(guò)抑制NF-κB p65的磷酸化水平減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷［19］。LEE 等［20］探究了穿心蓮內(nèi)酯對(duì)小鼠過(guò)敏原誘導(dǎo)的氣道炎癥的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯可以抑制stat3 介導(dǎo)的NF-κB 通路，在lps（脂多糖）刺激的raw264.7 巨噬細(xì)胞中發(fā)揮抗炎作用，能降低氣道炎癥反應(yīng)。其他通路如p53 信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路、炎癥性腸?。↖BD）通路等也有相關(guān)性，但穿心蓮內(nèi)酯通過(guò)干預(yù)這些信號(hào)通路來(lái)調(diào)控呼吸道感染的文獻(xiàn)報(bào)道較少，因此后期有必要通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些信號(hào)通路。此外無(wú)論是生物學(xué)過(guò)程還是信號(hào)通路都是多個(gè)基因靶點(diǎn)共同參與或調(diào)控，映射了中醫(yī)藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)反向驗(yàn)證穿心蓮內(nèi)酯與預(yù)測(cè)到的作用靶點(diǎn)之間的結(jié)合性良好，表明基于大數(shù)據(jù)的篩選與預(yù)測(cè)具有一定準(zhǔn)確性。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)探究穿心蓮內(nèi)酯抗呼吸道感染的效應(yīng)機(jī)制，科學(xué)收集和預(yù)測(cè)穿心蓮內(nèi)酯的有效化學(xué)成分和作用靶點(diǎn)，從藥物、基因、靶點(diǎn)、疾病網(wǎng)狀關(guān)系探究四者之間的聯(lián)系，由于本研究是基于大數(shù)據(jù)的篩選和預(yù)測(cè)，具有一定局限性，后期仍需真實(shí)世界進(jìn)行驗(yàn)證。