巫燕慧，林海丹，陳英男，張 忠△，黃若蘭

1 深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院/南方科技大學(xué)鹽田醫(yī)院，深圳 518000；2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳市中醫(yī)院；3 深圳大學(xué)總醫(yī)院

動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾?。╝therosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）是全球范圍內(nèi)人類死亡的主要原因，世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2020年心血管疾病將成為全世界第一死因［1］。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是ASCVD 最基本的病理改變，是由大量脂質(zhì)沉積在動(dòng)脈管壁形成脂肪條紋而后逐漸發(fā)展成粥樣斑塊并引發(fā)多種并發(fā)癥的慢性動(dòng)脈疾?。?］。研究認(rèn)為AS既是一種慢性炎癥性疾病，又是一種脂質(zhì)代謝紊亂造成的疾?。?］。細(xì)胞脂質(zhì)代謝中膽固醇的代謝失衡可促進(jìn)AS 的發(fā)生及進(jìn)展［4］，而血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的凋亡則導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（覆蓋斑塊的纖維帽的主要成分）分泌減少，使斑塊纖維帽變薄、降解，加劇斑塊不穩(wěn)定，甚至發(fā)生破裂［5-6］，從而導(dǎo)致發(fā)生不良心血管事件（cardiovascular events，CVE）。

溫腎化痰方由廣東省名中醫(yī)羅陸一教授在二仙湯基礎(chǔ)上化裁而成，由仙茅、淫羊藿、石菖蒲、瓜蔞皮、乳香組成。前期研究發(fā)現(xiàn)該方具有降低小鼠低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）含量，下調(diào)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Orail、Caspase 3、Caspase 9、Bax 基因及蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2基因及蛋白表達(dá)作用［7］。本實(shí)驗(yàn)通過檢測不同濃度溫腎化痰方對(duì)氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量的影響，為溫腎化痰方防治AS提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只6 周齡健康雄性Wistar 大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量（250±10）g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心三水基地（批號(hào)：44411600003988），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（粵）2014-0035。本實(shí)驗(yàn)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。飼養(yǎng)條件為每日光照12 h、黑暗12 h，循環(huán)進(jìn)行，飲食、飲水不受限制。本實(shí)驗(yàn)通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 主要試劑與儀器平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基（smooth muscle cell medium，SMCM）培養(yǎng)液（美國Gibco，批號(hào)：1427263）；胎牛血清（美國Gibco，批號(hào)：1414426）；二甲基亞砜DMSO（德國默克SIGMA-ALDRICH，批號(hào)：Lot SHBB3758V）；Formazan溶解液DMSO（北京索萊寶M1020，批號(hào)：Lot NO20180312 SHBB3758V）；Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Beyotime C1062M，批號(hào)：111117180621）；總膽固醇檢測試劑盒（南京建成A111-1）；游離膽固醇檢測試劑盒（上海索萊寶BC1895）；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo HERAcell 150i）；倒置生物顯微鏡（OPTEC BDS200-PH）；解剖鏡（廣州明美光電技術(shù)有限公司）；熒光顯微鏡（廣州明美光電技術(shù)有限公司）；酶標(biāo)儀（Thermo Multiskan Mk3）；TDL-80-2B 型低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠飛鴿）；WD-9405B 型水平搖床（北京六一生物科技有限公司）；SW-CJ-1FD型無菌超凈臺(tái)（蘇潔凈化）；96孔板（美國Corning）；中藥煎煮機(jī)（北京東華原醫(yī)療設(shè)備廠YFY2020000mL）；LABOROTA4000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph 公司）；K2800 型微量分光光度計(jì)（北京凱奧科技有限公司）。

1.3 含藥血清制備

1.3.1 中藥制備 溫腎化痰方藥物組成：仙茅10 g，淫羊藿10 g，石菖蒲15 g，瓜蔞皮15 g，乳香15 g（由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供）。制備：煎藥前先將飲片制成粗粉，按比例取以上藥物加8 倍量水浸泡30 min，加熱煮沸后再煎煮30 min 取汁；第二煎加5 倍量水直接加熱，煮沸后煎煮30 min 取汁：合并2 次藥液，以4 層棉紗布過濾。將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（蒸發(fā)溫度≤60℃）濃縮成含生藥0.5265 g/mL 的藥液，常溫冷卻后，置于4℃冰箱內(nèi)保存使用。

1.3.2 取血清時(shí)間篩選 以中劑量溫腎化痰方提取液（10.053 g/kg，相當(dāng)于70 kg 成人等效劑量2 倍［8］）灌胃給藥，灌胃容量為每次0.5 mL，每日2次，連續(xù)5天。第5天灌胃結(jié)束后0.5、1、2、3、4 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取2 只大鼠麻醉并固定，腹主動(dòng)脈取血，4℃，離心半徑13.5 cm，13000 r/min 離心10 min，分離出上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后用高效液相色譜法測定溫腎化痰方有效成分揮發(fā)油類、三萜類、黃酮類含量，比較不同時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果差異，篩選出溫腎化痰方含藥血清的最佳取材時(shí)間為3 h。

1.3.3 含藥血清制備及分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將32 只Wistar 大鼠分為空白組及低、中、高劑量中藥組，每組8 只。低、中、高劑量中藥組分別按照5.256、10.053、20.106 g/（kg·d）溫腎化痰方提取液（給藥量相當(dāng)于70 kg 成人等效劑量1、2、4倍［8］）灌胃給藥，每次0.5 mL，每日2 次，空白組灌胃等劑量生理鹽水，連續(xù)5天。第5天灌胃結(jié)束3 h后麻醉大鼠并固定，腹主動(dòng)脈取血，分離上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后，儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離 處死Wistar大鼠，分離、沖洗、裁剪備用。將小組織塊種于25 cm2培養(yǎng)瓶底，加入SMCM 培養(yǎng)基（含雙抗、FBS、平滑肌細(xì)胞生長補(bǔ)充物）1 mL，置于5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育約3～5 h，當(dāng)組織塊自然黏附于瓶壁后把培養(yǎng)瓶放平，使組織塊完全浸入到培養(yǎng)液中，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔3 天更換培養(yǎng)基，組織塊周圍的細(xì)胞生長至70%時(shí)（16～20天）即可傳代。吸去舊培養(yǎng)基，0.01 mol/L PBS 清洗，加入2.5 g/L 胰蛋白酶消化液，室溫下消化約2 min，加入SMCM 培養(yǎng)基終止消化，離心、去上清、重懸細(xì)胞，處理后置光學(xué)顯微鏡下觀察：藍(lán)色細(xì)胞為異?；蛩劳黾?xì)胞，活細(xì)胞不著色，并行計(jì)數(shù)后傳代培養(yǎng)，每隔2 天換液1 次，待細(xì)胞融合成致密單層后可再次傳代。取培養(yǎng)的P2 代細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于內(nèi)置有蓋玻片的24孔板中培養(yǎng)，24 h 后待細(xì)胞自然貼壁、生長良好時(shí)，取出蓋玻片，沖洗、孵化，復(fù)染核10 min，在熒光顯微鏡下觀察并進(jìn)行血管平滑肌細(xì)胞鑒定。將鑒定合格的血管平滑肌細(xì)胞接種到6 孔培養(yǎng)板中，置5%CO2、37℃孵箱培養(yǎng)2 h 后去上清液，洗去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)3天后隨機(jī)分組。

1.4.2 分組 分離的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞繼續(xù)在6 孔培養(yǎng)板培養(yǎng)第3 天后分為：1）正常組：10%Gibco 血 清；2）對(duì) 照 組：ox-LDL 70 mg/L［9］+10%Gibco 血清；3）低劑量中藥組：ox-LDL 70 mg/L+低劑量中藥含藥血清；4）中劑量中藥組：ox-LDL 70mg/L+中劑量中藥含藥血清；5）高劑量中藥組：ox-LDL 70 mg/L+高劑量中藥含藥血清。所有分組加入血清后均作用于細(xì)胞12 h。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率 細(xì)胞培養(yǎng)第3 天，藥物處理后96 孔板每孔加入10 μL MTT 溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。每孔加入100 μL Formanzan 溶解液，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formanzan 全部溶解。37℃孵育4 h左右，紫色結(jié)晶全部溶解。用酶標(biāo)儀在492 nm 處測定吸光度。計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次每組設(shè)4～5 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞存活率（%）=處理組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.5.2 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡水平 1）將貼壁細(xì)胞用0.25%的胰酶消化，于室溫離心半徑13.5 cm，2000 r/min離心5～10 min，收集細(xì)胞，用去離子水將10×Binding Buffer稀釋成1×Binding Buffer，用預(yù)冷1×PBS（4℃）重懸細(xì)胞1次，離心半徑13.5cm，2000 r/min 離心5～10 min，洗 滌 細(xì)胞；2）加入300 μL的1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL的Annexin V-FITC 混勻后避光，室溫孵育15 min進(jìn)行標(biāo)記；3）上機(jī)前5 min再加入5 μL PI染色，用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長Ex 為488 nm，發(fā)射波長Em 為530 nm，Annexin V 綠色熒光通過FITC 通道（FL1）檢測，PI 紅色熒光通過PI通道（FL2或FL3）檢測，進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)：使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對(duì)照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置；4）以FITC和PI熒光作雙參數(shù)點(diǎn)圖，以Annexin V FITC 為橫軸，PI 為縱軸，將細(xì)胞分為4 個(gè)區(qū)，1 區(qū)：機(jī)械損傷細(xì)胞（Annexin V FITC-/PI+）；2區(qū)：凋亡晚期或壞死細(xì)胞（Annexin V FITC+/PI+）；3區(qū)：存活細(xì)胞（Annexin V FITC-/PI-）；4 區(qū)：早期凋亡細(xì)胞（Annexin V FITC+/PI-）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.3 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯水平 收集各組細(xì)胞，PBS 洗滌3 次，重懸于0.5 mL 磷酸鈉緩沖液（pH 7.4，0.1 mol/L）中，超聲波裂解細(xì)胞取上清液，微量分光光度計(jì)檢測TC 和游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）濃度。以考馬斯亮藍(lán)G-250 法測定各組細(xì)胞樣品中蛋白質(zhì)含量，細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量用每毫克蛋白所含膽固醇含量表示，反應(yīng)液中省去膽固醇酯酶用以檢測游離膽固醇。細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯（cholesteryl ester，CE）=TC-FC。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率與正常組比較，對(duì)照組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率下降（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，低、中、高劑量中藥組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率增加（P＜0.01）。與低劑量中藥組比較，中、高劑量中藥組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率增加（P＜0.01）。與中劑量中藥組比較，高劑量中藥組細(xì)胞主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率增加（P＜0.01）。見表1。

表1 各組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率比較（±s） %

表1 各組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率比較（±s） %

注：*表示與正常組比較，P＜0.01；△表示與對(duì)照組比較，P＜0.01；▲表示與低劑量中藥組比較，P＜0.01；○表示與中劑量中藥組比較，P＜0.01

組別正常組對(duì)照組低劑量中藥組中劑量中藥組高劑量中藥組第1次實(shí)驗(yàn)107.45±0.55 44.87±0.38 60.27±0.43 84.33±0.44 91.79±0.44第2次實(shí)驗(yàn)108.05±0.51 45.04±0.46 60.70±0.50 83.88±0.34 92.49±0.51第3次實(shí)驗(yàn)108.45±0.51 45.63±0.44 61.08±0.29 85.39±0.43 93.33±0.53平均值107.98±0.69 45.18±0.56*60.68±0.55△84.53±0.78△▲92.54±0.83△▲○

2.2 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡水平正常組、對(duì)照組及低、中、高劑量中藥組主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞凋亡率分別為（5.42±0.05）%、（39.51±0.44）%、（29.67±0.18）%、（20.44±0.50）%、（8.01±0.20）%。與正常組比較，對(duì)照組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡水平升高（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，低、中、高劑量中藥組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡水平均下降（P＜0.01）。與低劑量中藥組比較，中、高劑量中藥組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡水平下降（P＜0.01）。與中劑量中藥組比較，高劑量中藥組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡水平下降（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞凋亡率比較

2.3 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯與正常組比較，對(duì)照組TC 及CE 水平升高（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，低、中、高劑量中藥組細(xì)胞內(nèi)TC及CE水平降低（P＜0.01）。與低劑量中藥組比較，中、高劑量中藥組細(xì)胞內(nèi)TC 及CE 水平降低（P＜0.01）。與中劑量中藥組比較，高劑量中藥組細(xì)胞內(nèi)TC 及CE水平降低（P＜0.01）。各給藥組FC比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯比較（±s）

表2 各組大鼠細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯比較（±s）

注：*表示與正常組比較，P＜0.01；△表示與對(duì)照組比較，P＜0.01；▲表示與低劑量中藥組比較，P＜0.01；○表示與中劑量中藥組比較，P＜0.01

組別正常組對(duì)照組低劑量中藥組中劑量中藥組高劑量中藥組TC（mmol/L）0.25±0.02 0.89±0.04*0.68±0.08△0.51±0.07△▲0.40±0.07△▲○FC（μmol/L）56.32±0.38 60.83±0.26 59.32±0.14 58.35±0.34 57.49±0.23 CE（mg/L）22.05±2.13 107.87±5.82*75.75±10.07△51.89±7.69△▲42.51±9.03△▲○

3 討論

中醫(yī)學(xué)無ASCVD 病名，根據(jù)其癥狀屬“胸痹”“心痛”范疇?！端貑枴の宀厣善份d：“心之合脈也，其榮色也，其主腎也”，腎陽為一身陽氣之根本，心陽依賴于腎陽之溫煦。因腎陽虛衰，氣化失職，致水液輸布運(yùn)化失常，聚濕成痰，痰阻心胸；腎陽虛損，無力溫煦心陽，使心氣推動(dòng)血液運(yùn)行無力，血脈運(yùn)行緩慢，瘀阻于心脈［10］。中醫(yī)藥治療AS 療效較好，涉及調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗氧化、抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、穩(wěn)定斑塊等機(jī)制［11-12］。

溫腎化痰方由仙茅、淫羊藿、石菖蒲、瓜蔞皮、乳香組成。方中仙茅、淫羊藿為君藥，仙茅溫陽補(bǔ)腎，強(qiáng)筋骨，通經(jīng)脈；淫羊藿性辛、甘、溫，歸肝、腎經(jīng)；石菖蒲辛溫，開竅豁痰，配合瓜蔞皮寬胸理氣開痰結(jié)，消痰散結(jié)以治其標(biāo)；乳香性溫，味辛善行，能行血分瘀滯，開經(jīng)絡(luò)壅滯，并載諸藥直達(dá)病所，為引經(jīng)佐使藥。全方溫補(bǔ)、消痰并用，以溫腎助陽為主，活血化痰為輔。對(duì)胸痹心腎陽虛患者單純使用活血化瘀藥療效不足，而以溫腎為本、化痰散瘀藥為輔的溫腎化痰方，方中有補(bǔ)有瀉，用于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病，有一定依據(jù)［7，13］。

AS 是以血管內(nèi)皮損傷和血管平滑肌細(xì)胞移行增殖為基礎(chǔ)的病變，其中血管平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡對(duì)AS 的發(fā)生、發(fā)展起重要作用［14］。正常生理狀態(tài)下，血管平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡維持相對(duì)平衡狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激等條件下，沉積于大中動(dòng)脈內(nèi)膜下的LDL 容易發(fā)生氧化修飾，形成ox-LDL［15］，從而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞，促進(jìn)血栓形成，同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶，促進(jìn)AS斑塊的不穩(wěn)定性［16-17］，也可促進(jìn)LOX-1 的表達(dá)，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，加重斑塊不穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致斑塊破裂［18］。溫腎化痰方可減少血管平滑肌細(xì)胞凋亡，保持其穩(wěn)定的存活率，進(jìn)而使血管平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡維持在平衡狀態(tài)，延緩AS的進(jìn)展。

高脂血癥是AS 發(fā)病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素［19］。早期血液中單核細(xì)胞在血管平滑肌細(xì)胞功能受損時(shí)遷移至內(nèi)皮，分化成巨噬細(xì)胞，攝入大量脂質(zhì)，各種因素作用下大量膽固醇酯聚積至細(xì)胞轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞，而泡沫細(xì)胞是AS 斑塊形成脂質(zhì)條紋的特征性標(biāo)志，泡沫細(xì)胞內(nèi)的脂滴存在的主要脂質(zhì)是膽固醇，故膽固醇代謝平衡在AS 發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［20］。溫腎化痰方可降低主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)總膽固醇及膽固醇酯含量，減少細(xì)胞泡沫化，從而延緩AS 進(jìn)程，且在一定劑量范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，其作用效果也增加。

本研究用中藥血清藥理學(xué)方法，證明溫腎化痰方可有效減少ox-LDL 誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞凋亡，有效抑制血管平滑肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)血管平滑肌細(xì)胞，減輕主動(dòng)脈血管重構(gòu)，同時(shí)減少細(xì)胞內(nèi)總膽固醇及膽固醇酯含量，減少泡沫細(xì)胞形成，從而延緩AS 發(fā)生發(fā)展。課題組未來將通過檢測相關(guān)炎性因子及mRNA 表達(dá)進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。