常 偉，丁明翠，王 威，*

(1．平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院疾控中心，河南平頂山 467002；2．鄭州大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與職業(yè)病學教研室，河南 鄭州 450001)

細胞周期蛋白H(cyclin H，CCNH)是細胞周期蛋白大家族的一名成員，普遍存在于真核細胞中，其基因位于染色體5q14.3。CCNH可以催化周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinases 2，CDK2)等多種CDK活化，并與周期蛋白依賴性激酶7(cyclindependent kinases 7，CDK7)共同對細胞周期和基因轉錄進行合理調(diào)控，從而影響細胞的增殖。CCNH可以與CDK7、輔助蛋白(menage a trois 1，MAT1)組成CDK7/CCNH/MAT1三聚體復合物[1]，即人類的細胞周期素依賴性蛋白激酶(CAK)。CAK可以使P53、RNA聚合酶2(RNA polymerase 2，RNA2)、甾體激素受體等磷酸化，從而調(diào)節(jié)轉錄和DNA的損傷修復，促使細胞分裂增殖，最終調(diào)控惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。從功能而言，CCNH是CAK的調(diào)節(jié)亞基，也是細胞周期調(diào)控蛋白的關鍵蛋白之一。細胞周期調(diào)控的異常與腫瘤的發(fā)生密切相關，有研究表明，CCNH基因rs3093816位點與口腔癌的發(fā)病密切相關[2]；也有研究發(fā)現(xiàn)，CCNHVal270Ala(rs2230641)與高分化甲狀腺癌發(fā)病風險相關，雜合型和突變型基因型頻率越高，發(fā)病風險越高[3]。越來越多的研究表明，CCNH基因多態(tài)性與非小細胞肺癌[4]、骨惡性腫瘤[5]等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關。

目前對于單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)的檢測有很多方法，包括動態(tài)等位基因特異性雜交(dynamic allele-specific hybridization，DASH)[6]、熒光標記探針(fluorescently labeled probes)技術[7]、和聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性技術(polymerase chain reaction-restrition fragment length polymorphism，PCR-RFLP)[8]等。盡管上述方法各有其自身的優(yōu)勢，但是由于實驗方法復雜，儀器設備比較昂貴，使它們的應用受到了限制。其中，PCR-RFLP技術因其高靈敏度和可靠性而廣泛應用于人類基因多態(tài)的檢測。然而，PCR-RFLP技術不適合高通量篩選，目前仍面臨著實用性的挑戰(zhàn)。通過查詢NEB網(wǎng)站(http://www.neb-china.com/)可知，CCNH基因rs3093816位點沒有相應的內(nèi)切酶可以識別，在本研究中，我們采用一種改進的PCR-RFLP法檢測CCNH基因rs3093816位點。應用創(chuàng)造酶切位點(creat restriction site，CRS)原理[9]，再結合PCR-RFLP方法設計引物，選擇廉價的內(nèi)切酶CviQ I，對CCNH基因rs3093816位點進行了檢測。同時，本研究設計了堿基錯配PCR長引物和堿基錯配相對短的PCR引物，比較分析堿基錯配長PCR引物是否更快速經(jīng)濟。

1 材料與方法

1.1 研究對象

采集某企業(yè)160名職工體檢的健康人群外周血，采用DNA提取試劑盒提取基因組DNA后進行CCNH基因型的檢測。參與本研究的研究對象均簽署了知情同意書。本研究已獲得鄭州大學公共衛(wèi)生學院倫理委員會審批(ZZUIRB2021-80)。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 試劑DNA提取試劑盒，購于北京百泰克生物技術有限公司；1×PCR mix購于南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶CviQI購于Thermo Scientific公司；引物和瓊脂糖購于生工生物工程上海股份有限公司。

1.2.2 儀器9600型PCR儀購于PE公司；微型電泳槽購于Phamacia Biotech，EPS1000；GelDoc2000凝膠成像儀購于Bio-Rad公司。

1.3 方法原理

創(chuàng)造性酶切位點PCR-RFLP(creat restriction site-PCR-RFLP，CRS-PCR-RFLP)是根據(jù)引物堿基錯配技術設計的檢測堿基突變的方法。其原理是根據(jù)單堿基突變位點的堿基替代情況設計引物，其中一條引物根據(jù)突變位點臨近序列設計，人為引入錯配堿基，使得引物3′端和單堿基突變的一種突變型在PCR擴增后形成一個酶切位點，然后應用相應的內(nèi)切酶進行酶切鑒定。

1.4 序列查找及引物設計

在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)查找CCNH基因及其SNP信息，結合有關文獻確定CCNH基因rs3093816位點堿基變異信息，利用Primer Premier 5.0軟件分析內(nèi)切酶識別情況，通過創(chuàng)造性酶切位點的方法引入新的酶切位點來識別變異。

1.4.1 序列搜索與多態(tài)位點確定結合網(wǎng)站信息及有關文獻可確定CCNH基因rs3093816位點為C/T多態(tài)，位于第5號染色體，在基因組中的位置為87401570。

1.4.2 序列分析與引物設計經(jīng)序列分析可知C/T多態(tài)沒有相應的內(nèi)切酶可以識別，如通過堿基錯配PCR將多態(tài)位點前第3位堿基T替換為G，則該多態(tài)可由內(nèi)切酶RsaI及其同工酶CviQ I識別，本研究選擇較便宜的CviQ I內(nèi)切酶，即C等位基因可被CviQ I內(nèi)切酶及其同工酶RsaI識別并切開，而T等位基因不能被切開。

本實驗根據(jù)上述分析應用CRS-PCR-RFLP原理設計引物。首先利用Primer Premier 5.0軟件分析內(nèi)切酶識別情況，根據(jù)序列情況確定上游引物的位置與長度，然后搜索合適的下游引物，選定引物見表1。

表1 長引物和短引物基本信息

1.5 PCR擴增及酶切鑒定

取50 ng的基因組DNA 1μL，上下游引物各0.3μL(均為0.2μmol/L)，1×PCRmix 7.5μL(包括4種dNTP混合物、Taq DNA聚合酶和鎂離子)，與雙蒸水組成15μL反應體系。PCR反應條件為首先94℃預變性5 min，然后94℃變性30 s，Tm(短引物取46℃，長引物取58℃)下退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，用凝膠成像儀觀察結果。取PCR產(chǎn)物10μL，加入10 U內(nèi)切酶和2.5μL 10×酶切緩沖液和ddH2O組成25μL反應體系，37℃水浴中酶切過夜，電泳35 min和55 min后，用凝膠成像儀觀察成像。

1.6 測序驗證

PCR產(chǎn)物測序采用sanger雙脫氧鏈終止法，委托生工生物工程上海股份有限公司完成。

2 結果

2.1 CCNH基因rs3093816位點多態(tài)分布與Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

經(jīng)知情同意后采集某企業(yè)160名職工體檢的健康人群外周血，提取基因組DNA后進行CCNH基因rs3093816位點基因型的檢測。CCNH基因rs3093816位點野生型TT 59例(36.88%)，雜合型CT 76例(47.50%)，突變型CC 25例(15.63%)。該基因多態(tài)分布經(jīng)Hardy-Weinberg檢驗，P=0.949，符合Hardy-Weinberg平衡，說明所選取的樣本具有代表性。

2.2 基因型的判斷

CCNH基因rs3093816位點長引物擴增后總長度為164 bp，經(jīng)CviQ I酶切后可出現(xiàn)164、126、38 bp等3種片段(其中38 bp由于分子量較小，條帶彌散，在電泳圖中未顯示)。酶切后基因型分別為：突變型CC為164、38 bp，雜合型CT為164、126、38 bp，野生型TT為164 bp。CCNH位點短引物擴增后總長度為259 bp，經(jīng)CviQ I酶切后可出現(xiàn)259、240、19 bp等3種片段(其中19 bp由于分子量較小，條帶彌散，在電泳圖中未顯示)。酶切后基因型分別為：突變型CC為240、19 bp，雜合型CT為259、240、19 bp，野生型TT為259 bp。酶切圖譜見圖1，表2。

表2 堿基錯配長PCR引物和堿基錯配相對短PCR引物法比較

圖1 CCNH基因rs3093816位點PCR產(chǎn)物經(jīng)Cvi Q I內(nèi)切酶酶切后的電泳圖

使用堿基錯配長PCR引物和堿基錯配相對短PCR引物法檢測CCNH基因rs3093816位點。使用3%的瓊脂糖凝膠電泳35 min后，長引物對應的擴增產(chǎn)物經(jīng)CviQ I酶切后，3種基因型條帶完全分開，清晰可分辨；短引物對應的擴增產(chǎn)物經(jīng)CviQ I酶切后，3種基因型條帶尚未完全區(qū)分開，特別是泳道4對應的雜合型基因型尚不能分辨。直到電泳時間達到55 min時，短引物對應的擴增產(chǎn)物經(jīng)CviQ I酶切后，3種基因型條帶才完全分開，清晰可分辨。

2.3 CCNH基因rs3093816位點結果鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結果發(fā)現(xiàn)CCNH基因rs3093816位點出現(xiàn)野生型TT、突變型CC和雜合型CT 3種基因型。對上述3種基因型的PCR產(chǎn)物進行測序鑒定，CCNH基因rs3093816位點3種類型的基因PCR產(chǎn)物測序結果跟預期結果完全一致。測序結果見圖2。其中，方框內(nèi)的字母對應多態(tài)堿基，單下劃線的堿基為錯配堿基，從而與前面的堿基共同形成酶切位點，與預期結果一致。

圖2 CCNH基因rs3093816位點測序分析結果

3 討論

經(jīng)序列分析可知CCNH基因rs3093816位點沒有相應的內(nèi)切酶可以識別，本研究通過創(chuàng)造性酶切位點PCR-RFLP方法在CCNH基因rs3093816位點擴增產(chǎn)物中引入新的酶切位點，成功建立了堿基錯配PCR引物法檢測CCNH基因rs3093816位點。常規(guī)設計引物長度為15～30 bp，本研究設計的長引物長度為40 bp，兩個片段長度差異約占總長引物長度的23%，所占比例高于短引物(8%)。據(jù)我們所知，PCR-RFLP方法中幾乎沒有使用過長PCR引物。本研究同時設計了堿基錯配長PCR引物和堿基錯配相對短PCR引物，比較分析堿基錯配長PCR引物是否更快速經(jīng)濟。與短引物法相比，長引物占擴增總片段的比例越大，酶切產(chǎn)物越容易區(qū)分，凝膠電泳需要的時間越短。此外，長引物法的Tm值較高，特異性較好。

通過查詢PubMed SNP數(shù)據(jù)庫顯示，本研究測得的正常人群的CCNH基因rs3093816位點多態(tài)性分布與在亞洲人群中分布一致。有研究顯示，CCNH基因rs3093816位點與口腔癌的發(fā)病風險升高有關，且GG基因型攜帶者的發(fā)病風險升高兩倍[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)CCNH基因rs3093816位點T等位基因攜帶者發(fā)生肺癌的風險升高[11]。我們可以通過檢測基因多態(tài)性位點篩選易感人群，因此，SNP的檢測也變得越來越重要。SNP常用的檢測方法有DNA測序[12]，TaqMan分析[12]，熒光標記探針技術[13]，PCR-RFLP[14]等。DNA測序是一種精確的基因分型方法，但成本較高。TaqMan探針技術最突出的優(yōu)點是它不需要PCR分離或洗脫等后處理過程，從而提高檢出率。但TaqMan探針熒光背景較高，且探針只有一個堿基的差異，結果容易出現(xiàn)假陽性；分子信標被標以不同顏色的熒光染料來實現(xiàn)多個SNP的同時檢測。然而，適合熒光標記的染料比較少，這大大限制了檢測通量[15]。

因為PCR-RFLP容易掌握，且具有較高的靈敏度和可靠性，所以在SNP檢測中得到廣泛的應用。本研究采用創(chuàng)造性酶切位點PCR-RFLP法成功建立了堿基錯配長引物法檢測CCNH基因rs3093816位點，PCR產(chǎn)物純度比較高，酶切結果也容易分辨，通過測序驗證進行驗證，結果準確可靠。更加拓寬了該方法的應用范圍，具有很大的靈活性和應用前景，特別適用于基層單位的檢測。

綜上所述，我們成功建立了堿基錯配長PCR引物法檢測CCNH基因rs3093816位點，此方法具備簡經(jīng)濟快速的特點，可廣泛用于大規(guī)模樣本分析。