梁 峰，張 瑋，李 飛，王勝杰，杜宇晶，張迎春

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科，河北 張家口 075000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是中國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢(shì)[1]。盡管結(jié)直腸癌的診斷與治療已經(jīng)取得了顯著進(jìn)步，但其療效及預(yù)后仍不容樂(lè)觀[2]。因此，結(jié)直腸癌的早期診療依然是本領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是指長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA，廣泛參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等多種生物學(xué)過(guò)程[3-4]。lncRNA在細(xì)胞周期、表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，尤其是參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[5-7]。癌癥易感性候選基因9(cancer susceptibility candidate 9，CASC9)是具有致癌作用的lncRNA，在肝癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)[8-9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CASC9在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)升高，CASC9可作為miR-195-5p吸附海綿靶向調(diào)控細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡[10]。然而，目前關(guān)于lncRNA CASC9在結(jié)直腸癌中的臨床意義報(bào)道較少。因此，本研究擬收集結(jié)直腸癌患者癌組織和癌旁組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)法檢測(cè)lncRNA CASC9的表達(dá)情況，探討lncRNA CASC9在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2013年7月—2017年1月于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院接受手術(shù)切除后液氮保存的87例新鮮冰凍結(jié)直腸癌組織及配對(duì)癌旁組織，同時(shí)獲取臨床資料。所有患者通過(guò)電話或門診隨訪3年，隨訪截至2020年1月30日。87例結(jié)直腸癌患者中，男48例，女39例；年齡35～75歲，平均(57.46±12.63)歲；根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)TNM分期，其中Ⅰ期18例，Ⅱ期45例，Ⅲ期24例；根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)病理分化標(biāo)準(zhǔn)，低分化33例，中分化41例，高分化13例。最終納入研究的患者均經(jīng)病理切片證實(shí)為結(jié)腸癌或直腸癌。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)為：①患者臨床資料完整；②術(shù)前從未接受過(guò)介入、射頻消融術(shù)、放化療及免疫治療；③經(jīng)病理切片證實(shí)為結(jié)腸癌或直腸癌。排除標(biāo)準(zhǔn)為：①合并其他類型腫瘤；②術(shù)前曾接受過(guò)放、化療或中醫(yī)治療；③腫瘤以外其他原因?qū)е碌幕颊咚劳觥?/p>

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)lnc RNA CASC9在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)

使用TRIzol試劑(Invitrogen)提取總RNA，超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度。每組樣本取1 μg RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[RNA PCR Kit(AMV)，TaKaRa]說(shuō)明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存。以1μL cDNA為模板，按照qPCR試劑盒(Prime ScriptTMRT Reagent Kit，TaKaRa)說(shuō)明書，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，PCR上、下游引物各0.4μL，ROX Reference Dye 0.4μL，cDNA模板1μL，ddH2O 7.8μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，68℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂電泳，以Labworks 4.5圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：CASC9上游5′-TTGGTCAGCCACATTC ATGGT-3′，下 游5′-AGTGCCAATGACTCTCCAGC-3′；GAPDH上游5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布且方差齊性的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制不同lncRNA CASC9表達(dá)水平患者組間的生存曲線，并應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)比較兩組間生存率的差異，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 lnc RNA CASC9在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)情況

qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，lncRNA CASC9在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)(6.395±0.164)較癌旁組織(2.387±0.098)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 lncRNA CASC9在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.2 lncRNA CASC9與結(jié)直腸癌組織病理指標(biāo)的關(guān)系

以lncRNA CASC9在87例結(jié)直腸癌組織中相對(duì)表達(dá)量的中位值(6.61)為界，將患者分為高lncRNA CASC9表達(dá)組(n=52)和低lncRNA CASC9表達(dá)組(n=35)，并分析其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中l(wèi)ncRNA CASC9的表達(dá)水平與癌組織的不同分化程度(χ2=6.877，P=0.032)、TNM分期(χ2=7.660，P=0.022)、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=9.901，P=0.002)明顯相關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤位置無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系(均為P＞0.05，表1)。

表1 結(jié)直腸癌組織中l(wèi)nc RNA CASC9的表達(dá)水平與病理指標(biāo)的關(guān)系(n=87)

2.3 lncRNA CASC9在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與患者術(shù)后生存率的關(guān)系

術(shù)后隨訪3年，根據(jù)隨訪資料，繪制lncRNA CASC9低表達(dá)組和高表達(dá)組的生存曲線并進(jìn)行Logrank檢驗(yàn)分析。結(jié)果顯示，lncRNA CASC9高表達(dá)組患者的總生存期(overall survival，OS)和無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)均明顯短于低表達(dá)組(χ2=17.91，P＜0.01；χ2=11.23，P=0.001)。見(jiàn)圖2。

圖2 lnc RNA CASC9表達(dá)與結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存曲線的關(guān)系

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNA表達(dá)失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后不良有關(guān)，可作為腫瘤早期診斷的新型生物標(biāo)志物[11]。值得注意的是，有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA CASC9的表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[12-14]。Yang等[15]研究表明lncRNA CASC9在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中顯著高表達(dá)，且與患者腫瘤大小、臨床分期、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和總生存期相關(guān)。Wu等[16]發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細(xì)胞癌組織芯片顯示lncRNA CASC9在該研究中l(wèi)ncRNA表達(dá)上調(diào)最多，且高表達(dá)lncRNA CASC9的患者預(yù)后較差；體內(nèi)外研究表明lncRNA CASC9表達(dá)下調(diào)可顯著抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)和裸鼠腫瘤發(fā)生。Zhan等[17]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA CASC9在膀胱癌中的表達(dá)明顯上調(diào)，并與組織學(xué)分級(jí)、TNM分期和預(yù)后有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)lncRNA CASC9充當(dāng)miR-497-5p分子海綿，上調(diào)卷曲同源物6(FZD6)表達(dá)，隨后激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生與發(fā)展。Zhao等[18]研究表明lncRNA CASC9在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，并且lncRNA CASC9的表達(dá)水平也被證實(shí)是非小細(xì)胞肺癌獨(dú)立的預(yù)后因素。上述研究表明，lncRNA CASC9影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

然而，關(guān)于lncRNA CASC9評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌臨床預(yù)后價(jià)值的相關(guān)研究卻鮮有報(bào)道。因此，本研究著重探討lncRNA CASC9的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理指標(biāo)以及預(yù)后之間的關(guān)系。本研究應(yīng)用qPCR技術(shù)檢測(cè)87例結(jié)直腸癌和相應(yīng)癌旁組織中l(wèi)ncRNA CASC9的表達(dá)水平，結(jié)果顯示lncRNA CASC9在結(jié)直腸癌組織較癌旁組織中呈明顯高表達(dá)，且其表達(dá)水平高低與結(jié)直腸癌發(fā)展的多個(gè)臨床因素密切相關(guān)。本研究進(jìn)一步分析了不同病理指標(biāo)結(jié)直腸癌組織中l(wèi)ncRNA CASC9的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分化程度越低、TNM分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者lncRNA CASC9陽(yáng)性表達(dá)率越高，其中分化程度、TNM分期是腫瘤惡性生物學(xué)行為的表現(xiàn)，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的重要指標(biāo)，提示lncRNA CASC9的異常高表達(dá)可能預(yù)示著結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良。接下來(lái)，我們分析了lncRNA CASC9表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，lncRNA CASC9高表達(dá)組患者的術(shù)后總生存期和無(wú)病生存期明顯短于lncRNA CASC9低表達(dá)組。

綜上所述，lncRNA CASC9在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯升高，與結(jié)直腸癌的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，其有可能成為判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。本研究在今后也將擴(kuò)大樣本收集量，以進(jìn)一步確認(rèn)lncRNA CASC9表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系，并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行深入研究。