陳邦蘭，龍 濤，高永峰，黃仁華,2，劉繼愷, 2, 3

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 四川 綿陽(yáng) 621010; 2. 西南科技大學(xué)核廢物與環(huán)境安全國(guó)防重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 綿陽(yáng) 621010；3. 核廢物與環(huán)境安全省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心, 四川 綿陽(yáng) 621010)

【研究意義】鎘(Cd)位于元素周期表第五周期ⅡB族，價(jià)電子構(gòu)型4d105S2，主要為+2價(jià)和0價(jià)。單質(zhì)Cd本身無(wú)毒，但其化合物存在毒性及腐蝕性，在植物中會(huì)產(chǎn)生累積性毒害[1-2]。煙草屬于Cd易富集植物，其吸收的Cd主要積累于根、葉中[3]。Cd不僅會(huì)抑制煙草的生長(zhǎng)發(fā)育、影響煙葉品質(zhì)，還對(duì)吸煙者的健康構(gòu)成潛在的威脅[4]。因此，對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行克隆和功能鑒定對(duì)于闡明煙草Cd吸收積累的分子機(jī)制，以及利用基因工程手段提高煙葉品質(zhì)顯得十分必要。雖然NRAMP基因已在多個(gè)植物物種中被鑒定，但有關(guān)煙草NRAMP基因的研究還很缺乏。NtNRAMP5是目前唯一被克隆的煙草NRAMP基因，其編碼的蛋白定位于質(zhì)膜，具轉(zhuǎn)運(yùn)有Mn和Cd的能力[5]。【前人研究進(jìn)展】過(guò)量的Cd會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育，多數(shù)表現(xiàn)為植株矮小、葉片失綠、生長(zhǎng)緩慢、生物量下降等。且隨著Cd濃度的升高，植物葉片內(nèi)的葉綠素含量和葉綠素a/b的比值均呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)[6]。同時(shí)，Cd可使線(xiàn)粒體的膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，內(nèi)部結(jié)構(gòu)喪失，影響內(nèi)膜上的氧化磷酸化，從而抑制小麥的呼吸作用[7]。此外，Cd還會(huì)影響植物根部細(xì)胞水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，干擾鈣(Ca)、鎂(Mg)、鉀(K)和磷(P)的吸附[8]。丙二醛(MDA)是植物在逆境條件下發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，隨著Cd2+處理濃度的升高，桉樹(shù)[9]、火炬樹(shù)[10]中MDA的含量也逐漸上升，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化加劇，說(shuō)明Cd會(huì)使植物產(chǎn)生氧化逆境。Cd進(jìn)入植物的途徑很多，主要經(jīng)皮層組織進(jìn)入植物根部，再通過(guò)質(zhì)外體或共質(zhì)體到達(dá)木質(zhì)部，進(jìn)而運(yùn)輸?shù)街参锲渌课籟11]。金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類(lèi)膜定位蛋白，在金屬離子吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中扮演著重要角色。目前人們已鑒定到多個(gè)參與Cd運(yùn)輸?shù)慕饘俎D(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如P1B-ATPase家族的TaHMA2[12]，CDF家族的MTP1[10]和ZIP家族的AtIRT1、OsIRT1、OsIRT2和Tcirt1-G等[13-16]。自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白(Natural resistance associated macrophage proteins，NRAMPs)是一類(lèi)參與金屬離子運(yùn)輸?shù)目缒まD(zhuǎn)運(yùn)蛋白，首先在動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)且廣泛存在于植物中。NRAMP蛋白不僅在Mn、Zn和Fe等微量元素的吸收分配中發(fā)揮作用，還參與了植物對(duì)Cd等毒性重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[17]。例如，在擬南芥中，AtNRAMP6定位于側(cè)根和幼嫩葉片細(xì)胞的高爾基體或反面高爾基網(wǎng)絡(luò)上，是Cd和Fe的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[18-19]。在水稻NRAMP基因家族中，OsNRAMP1定位于質(zhì)膜，負(fù)責(zé)Cd和Mn等金屬離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[20-21]。OsNRAMP5定位于質(zhì)膜，是Mn和Cd的主效轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[22]。OsNRAMP6定位于質(zhì)膜，在酵母實(shí)驗(yàn)中被證明具有Cd轉(zhuǎn)運(yùn)功能[23]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究前期通過(guò)生物信息學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)煙草基因組中存在9個(gè)NtNRAMP基因，本研究對(duì)其中一個(gè)成員NtNRAMP3.1基因進(jìn)行了克隆并分析了其組織表達(dá)和對(duì)不同重金屬的應(yīng)答模式，同時(shí)通過(guò)將其在酵母細(xì)胞中異源表達(dá)，對(duì)其Cd轉(zhuǎn)運(yùn)能力進(jìn)行了鑒定?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究結(jié)果將為深入了解煙草NtNRAMP基因家族在植物金屬離子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中的功能，以及利用現(xiàn)代生物技術(shù)培育Cd低積累的煙草品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與脅迫處理

供試植物材料煙草‘K326’由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。酵母菌株BY4741購(gòu)自Euroscarf網(wǎng)站(http://www.euroscarf.de)。

將經(jīng)10% NaClO清洗的無(wú)菌煙草種子分別播種于以下幾種固體培養(yǎng)基上垂直培養(yǎng)：1/2 MS(對(duì)照)；不含MnSO4的1/2 MS(缺Mn)；1/2 MS + 500 μmol/L MnSO4(過(guò)量Mn)；不含ZnSO4的1/2 MS(缺Zn)；1/2 MS + 100 μmol/L ZnSO4(過(guò)量Zn)；不含F(xiàn)eSO4的1/2 MS(缺Fe)；1/2 MS + 500 μmol/L FeSO4(過(guò)量Fe)；1/2 MS + 50 μmol/L CdCl2(Cd處理)。培養(yǎng)1個(gè)月后分別對(duì)煙草幼苗的葉和根進(jìn)行取樣，樣品經(jīng)液氮速凍后置于-70 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生物信息學(xué)分析

利用ClustalW軟件對(duì)擬南芥和水稻的自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白(Natural resistance associated macrophage protein，NRAMP)與NtNRAMP3.1的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。使用MEGA 6.0軟件中的最大釋然法并基于1000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)構(gòu)建NtNRAMP3.1和其他NRAMP蛋白的進(jìn)化樹(shù)[24]。

利用TMHMM Server V.2.0預(yù)測(cè)NtNRAMP3.1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane domians，TMs)，并使用TMRPres2D展現(xiàn)其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[25]。

1.3 煙草NtNRAMP3.1基因的表達(dá)模式分析

總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄參見(jiàn)Liu等[26]的方法。以NtL25(基因編號(hào)：L18908.1) 和Ntubc2(基因編號(hào)：AB026056.1)作為內(nèi)參基因，采用TransStart Green qPCR SuperMix在Bio-Rad公司的CFX96 Real-time System進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR),使用的基因特異引物見(jiàn)表1。

表1 使用的引物及其序列

1.4 煙草NtNRAMP3.1基因的克隆及其酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)SGN網(wǎng)站(https://solgenomics.net/)的NtNRAMP3.1基因(基因編號(hào)：nitab4.5_0002568g0010.1)序列，設(shè)計(jì)帶有KpnI和EcoR I雙酶切位點(diǎn)的特異性引物NtNRAMP3.1-F和NtNRAMP3.1-R(引物序列見(jiàn)表1)。以煙草幼苗cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用TIANGEN公司的通用型DNA純化回收試劑盒對(duì)目的條帶進(jìn)行回收。通過(guò)酶切連接的方法將目的片段插入到pYES2載體的KpnI和EcoR I位點(diǎn)，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆送華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.5 酵母轉(zhuǎn)化及表型分析

1.5.1 酵母轉(zhuǎn)化 利用PEG/LiAC酵母轉(zhuǎn)化法分別將pYES2和pYES2+NtNRAMP3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌株BY4741中[27]。將轉(zhuǎn)化后的酵母涂布于SD/-ura(Dex)固體培養(yǎng)基上，置于30 ℃培養(yǎng)3～4 d。

1.5.2 點(diǎn)板分析 挑取酵母單克隆到SD/-ura (Dex)液體培養(yǎng)基，于30 ℃，200 r/min培養(yǎng)2 d。酵母菌經(jīng)4000 r/min，離心5 min后，倒掉上層培養(yǎng)基，用無(wú)菌去離子水重懸菌體使菌液的OD600=0.2。依次將酵母菌液稀釋成5個(gè)梯度，每個(gè)梯度稀釋10倍。最后各取2 μL點(diǎn)板，置于30 ℃，培養(yǎng)2～4 d并拍照記錄。使用的對(duì)照組培養(yǎng)基為SD/-ura(Dex)，實(shí)驗(yàn)組為SD/-ura(Gal+Raff)+ 40/60 μmol/L CdCl2。

1.5.3 生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定 分別將含有pYES2和pYES2+NtNRAMP3.1的酵母菌加入20 mL液體培養(yǎng)基中，使其OD600在0.05左右。將酵母菌置于30 ℃，200 r/min培養(yǎng)，分別在0、2、5、10、12、24、28、32、36、48、54、60 h測(cè)定菌液的OD600。使用的對(duì)照組培養(yǎng)基為SD/-ura(Dex)，實(shí)驗(yàn)組為SD/-ura(Gal+Raff)+ 60 μmol/L CdCl2。

1.5.4 Cd含量的測(cè)定 首先將轉(zhuǎn)基因酵母菌接種于SD/-ura(Gal+Raff)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)9 h左右，使其OD600在0.1左右。然后向培養(yǎng)液中加入CdCl2使Cd2+的終濃度為20 μmol/L。酵母菌在30 ℃，200 r/min培養(yǎng)24 h后離心收集菌體。收集的菌體先用100 μmol/L 的EDTA洗1遍，再用無(wú)菌去離子水洗3遍，最后置于70 ℃烘干至恒重。

將干燥后的菌體稱(chēng)重后，分別加入4 mL的HNO3并置于180 ℃消解。利用原子吸收光譜儀(AA700, 美國(guó)PE公司)測(cè)定樣品中Cd含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草NtNRAMP3.1基因的克隆及序列分析

以煙草cDNA為模板，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期條帶大小一致的擴(kuò)增條帶(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到的核酸片段序列與預(yù)期序列(nitab4.5_0002568g0010.1)一致，由此NtNRAMP3.1基因克隆成功。序列分析表明，NtNRAMP3.1基因全長(zhǎng)1542 bp，編碼一個(gè)大小為513個(gè)氨基酸，具有11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白，該蛋白的N端和C端分別位于胞外和胞質(zhì)內(nèi)(圖2)。通過(guò)構(gòu)建煙草NtNRAMP3.1與擬南芥和水稻NRAMP蛋白的進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，煙草NtNRAMP3.1屬于NRAMP家族的第一亞組，與擬南芥AtNRAMP3和AtNRAMP4的親緣關(guān)系最近(圖3)。氨基酸序列比對(duì)(圖4)顯示，除了OsNRAMP8，其余第一亞組成員均含有NRAMP家族的保守結(jié)構(gòu)域CTM(Consensus Transport Motif)，但在個(gè)別位點(diǎn)存在差異，其中NtNRAMP3.1在CTM最后一位的氨基酸為組氨酸(H)，其余成員的為天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)。

M: Trans2K Plus II DNA maker; 1: NtNRAMP3.1圖1 煙草NtNRAMP3.1基因PCR擴(kuò)增電泳Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification product of NtNRAMP3.1 gene from tobacco

圖2 NtNRAMP3.1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)Fig.2 Transmembrane structure of NtNRAMP3.1

圖3 煙草NtNRAMP3.1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of NtNRAMP3.1 gene

黑色直線(xiàn)表示CTM結(jié)構(gòu)域；相應(yīng)基因的登錄號(hào)：OsNramp1 (Os07g15460), OsNramp2 (Os03g11010), OsNramp3 (Os06g46310), OsNramp4 (Os02g03900), OsNramp5 (Os07g15370), OsNramp6 (Os01g31870), OsNramp7 (Os12g39180), OsNramp8 (Os03g41070), AtNramp1 (At1g80830), AtNramp2 (At1g47240), AtNramp3 (At2g23150), AtNramp4 (At5g67330), AtNramp5 (At4g18790), AtNramp6 (Atlg15960)Black line denotes the CTM motif；Accession numbers for the corresponding genes are OsNramp1 (Os07g15460), OsNramp2 (Os03g11010), OsNramp3 (Os06g46310), OsNramp4 (Os02g03900), OsNramp5 (Os07g15370), OsNramp6 (Os01g31870), OsNramp7 (Os12g39180), OsNramp8 (Os03g41070), AtNramp1 (At1g80830), AtNramp2 (At1g47240), AtNramp3 (At2g23150), AtNramp4 (At5g67330), AtNramp5 (At4g18790), AtNramp6 (Atlg15960)續(xù)圖4Continued fig.4

2.2 煙草NtNRAMP3.1基因?qū)Σ煌亟饘倜{迫的應(yīng)答模式

用不同重金屬離子處理煙草植株，通過(guò)對(duì)NtNRAMP3.1基因在根、葉組織中的表達(dá)情況進(jìn)行qRT-PCR分析(圖5)發(fā)現(xiàn)，在正常生長(zhǎng)和重金屬脅迫處理的煙草幼苗中，NtNRAMP3.1基因在葉中的表達(dá)量均高于根，但是其對(duì)不同重金屬脅迫表現(xiàn)出不同的應(yīng)答模式。在煙草的根中，Cd、過(guò)量Mn和缺Fe處理組的NtNRAMP3.1基因相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，其中Cd處理的相對(duì)表達(dá)量最高，是對(duì)照組表達(dá)量的3.19倍，而其余處理(缺Mn、缺Zn、過(guò)量Zn和Fe)則顯著抑制NtNRAMP3.1基因的表達(dá)。在煙草的葉中，除Fe處理組(過(guò)量Fe和缺Fe)外，其余處理中NtNRAMP3.1基因的表達(dá)量均高于對(duì)照組，其中過(guò)量Mn處理中相對(duì)表達(dá)量最高，為對(duì)照組的2.05倍。統(tǒng)計(jì)分析表明，除Zn處理組(過(guò)量Zn和缺Zn)外，其余各處理組中NtNRAMP3.1基因的表達(dá)量與對(duì)照組均存在極顯著性差異。

用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，*表示同一組織處理組與對(duì)照的顯著性差異(P<0.05)，**表示同一組織處理組與對(duì)照的極顯著性差異(P<0.01)Independent sample t test is used for significance analysis. The mark * represents the significant difference (P<0.05) between heavy metal treatment groups and control on each tissue. The mark ** represents the highly significant difference (P < 0.01) between heavy metal treatment groups and control on each tissue圖5 NtNRAMP3.1基因在不同重金屬處理下的表達(dá)Fig.5 Expression pattern of NtNRAMP3.1 gene under different heavy metal treatments

2.3 煙草NtNRAMP3.1的表達(dá)增強(qiáng)了酵母對(duì)Cd的敏感性

利用酵母點(diǎn)板的方法研究了轉(zhuǎn)基因酵母菌在含有不同濃度CdCl2培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。結(jié)果(圖6)顯示，含有空載體和目的基因的酵母菌在不含CdCl2的培養(yǎng)基(對(duì)照)上的生長(zhǎng)情況基本一致，CdCl2處理均可以抑制酵母菌的生長(zhǎng)，但是對(duì)含有NtNRAMP3.1的酵母菌的抑制作用更為顯著，其在含有60 μmol/L CdCl2的培養(yǎng)基上幾乎不能生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步研究NtNRAMP3.1對(duì)酵母Cd敏感性的影響，在不同時(shí)間點(diǎn)分別測(cè)定了轉(zhuǎn)空載或NtNRAMP3.1的酵母菌在不含和含有60 μmol/L CdCl2的液體培養(yǎng)基中的OD600值，并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，得到的結(jié)果和點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)的一致。從第2小時(shí)開(kāi)始，CdCl2處理顯著抑制了酵母菌的生長(zhǎng)(圖7)，在第12小時(shí)，含有空載體和目的基因的酵母菌生長(zhǎng)情況出現(xiàn)差異，到第24小時(shí)，Cd對(duì)含有NtNRAMP3.1基因的酵母菌的抑制作用與含有空載的酵母相比變得極顯著。上述結(jié)果表明煙草NtNRAMP3.1基因的表達(dá)增強(qiáng)了酵母對(duì)Cd的敏感性。

圖6 轉(zhuǎn)基因酵母的生長(zhǎng)情況Fig.6 The growth of transgenic yeast

2.4 煙草NtNRAMP3.1對(duì)酵母Cd吸收的影響

為了探究NtNRAMP3.1基因增強(qiáng)酵母對(duì)Cd的敏感性的原因，分別測(cè)定了20 μmol/L Cd處理24 h后，轉(zhuǎn)空載和NtNRAMP3.1基因酵母中的Cd含量(圖8)，轉(zhuǎn)NtNRAMP3.1基因酵母中Cd的濃度明顯高于轉(zhuǎn)空載的酵母，t檢驗(yàn)顯示兩者的Cd濃度存在極顯著性差異，表明煙草NtNRAMP3.1基因增強(qiáng)了酵母對(duì)Cd的吸收能力。

圖7 生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.7 Growth curve

用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，**表示對(duì)照與轉(zhuǎn)NtNRAMP3.1基因酵母中Cd積累量的極顯著性差異(P<0.01)Independent sample t test is used for significance analysis.The mark ** represents the highly significant difference (P<0.01) of Cd accumulation between control and NtNRAMP3.1 transgenic yeast圖8 酵母對(duì)Cd的吸收Fig.8 Cd uptake in yeast

3 討 論

雖然NRAMP基因家族已在多個(gè)植物物種里被鑒定和功能研究，但是關(guān)于煙草NRAMP基因的研究還很少，目前僅初步探究了NtNRAMP5的亞細(xì)胞定位和重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)底物。本研究通過(guò)對(duì)克隆到的NtNRAMP3.1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，雖然煙草NtNRAMP3.1基因具有NRAMP家族的典型特征[28]，但其編碼蛋白的CTM結(jié)構(gòu)域的最后一位氨基酸與其他擬南芥和水稻NRAMP第一亞家族成員的具有差異(NtNRAMP3.1是H，其余的為N或D)。之前的研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtNRAMP4第413位的苯丙氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?F413I)會(huì)影響其轉(zhuǎn)運(yùn)Cd的能力，序列分析發(fā)現(xiàn)這一位點(diǎn)正好在一個(gè)保守基序內(nèi)[29]。CTM是NRAMP蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域，可能參與了與ATP耦合亞基的相互作用[17]，因此，上述最后一個(gè)氨基酸的差異是否影響煙草NtNRAMP3.1蛋白的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)能力還有待進(jìn)一步研究。

進(jìn)化分析結(jié)果表明，煙草NtNRAMP3.1蛋白屬于NRAMP家族的第一亞家族，和擬南芥AtNRAMP3和AtNRAMP4的親緣關(guān)系最近。擬南芥AtNRAMP3和AtNRAMP4是定位于液泡膜的Cd、Fe和Mn的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[30]。在種子萌發(fā)過(guò)程中，這2個(gè)蛋白可將液泡中的Fe向外轉(zhuǎn)運(yùn)利用；在成年植株中，它們可將Mn從液泡中轉(zhuǎn)運(yùn)到光合組織參與光合作用[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)NtNRAMP3.1可以將胞外的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，但其是否具有轉(zhuǎn)運(yùn)Fe和Mn的功能還有待進(jìn)一步探究。另外，GUS活性分析顯示Fe缺乏可同時(shí)顯著提高地上和地下部中AtNRAMP3和AtNRAMP4基因啟動(dòng)子的活性[31, 33]。本研究發(fā)現(xiàn)缺Fe處理可顯著提高NtNRAMP3.1基因在根中的表達(dá)，但抑制了其在地上部分表達(dá)；過(guò)量的Fe處理可同時(shí)抑止NtNRAMP3.1基因在地上和地下部的表達(dá)?？梢?jiàn)，在轉(zhuǎn)錄水平上，NtNRAMP3.1基因?qū)e的響應(yīng)與AtNRAMP3和AtNRAMP4具有一定差異。此外，NtNRAMP3.1基因的表達(dá)還受到Mn處理的調(diào)控，雖然其內(nèi)在機(jī)制目前還不清楚。

將目的基因轉(zhuǎn)化到野生型或突變體酵母中并進(jìn)行表型觀察是快速鑒定重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白金屬底物的有效方法。本研究利用該方法發(fā)現(xiàn)煙草NtNRAMP3.1蛋白是Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，異源表達(dá)NtNRAMP3.1基因可增強(qiáng)酵母對(duì)Cd的敏感性。水稻OsNRAMP1被證明是Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，經(jīng)Cd處理的轉(zhuǎn)OsNRAMP1基因的酵母中的Cd含量是對(duì)照細(xì)胞中的1.4倍[34]。為了進(jìn)一步探究煙草NtNRAMP3.1蛋白增強(qiáng)酵母Cd敏感性的原因，我們檢測(cè)了酵母細(xì)胞中Cd的含量，發(fā)現(xiàn)含有煙草NtNRAMP3.1的酵母細(xì)胞中Cd積累量顯著高于對(duì)照組，暗示煙草NtNRAMP3.1是在Cd的流入(influx)而非流出(efflux)中發(fā)揮作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)Cd處理可顯著增加NtNRAMP3.1基因在煙草地上和地下部的表達(dá)。這些結(jié)果暗示煙草NtNRAMP3.1可能在煙草Cd吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中具有重要功能。

4 結(jié) 論

本研究從煙草中克隆到了NRAMP的同源基因NtNRAMP3.1，該基因具有NRAMP基因家族的典型結(jié)構(gòu)。NtNRAMP3.1基因的表達(dá)具有組織特異性，且受Cd誘導(dǎo)；在酵母中異源表達(dá)NtNRAMP3.1可增加酵母對(duì)Cd的敏感性，這些結(jié)果暗示NtNRAMP3.1是Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。此外，NtNRAMP3.1基因的表達(dá)還受到Mn、Zn和Fe的調(diào)控，但其中的分子機(jī)制目前還不清楚，有待進(jìn)一步探索。本研究結(jié)果可為深入了解煙草NtNRAMP基因家族在金屬離子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中的功能，以及利用現(xiàn)代生物技術(shù)培育Cd低積累的煙草品種提供理論依據(jù)。