邵仕芳，何鵬飛，吳毅歆，何月秋

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學，昆明 650201；2.微生物菌種篩選與應用國家地方聯(lián)合工程研究中心，昆明 650217)

【研究意義】蠅類屬于雙翅目昆蟲，習性較為復雜，一般是晝間活動，適應力極強，陸生水生均有，且危害極為廣泛，對農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)產(chǎn)生極大的危害。例如：實蠅科及果蠅科的斑翅果蠅(Drosophilasuzukii)利用產(chǎn)卵棒插入瓜果蔬菜內(nèi)部將卵產(chǎn)在瓜果蔬菜內(nèi)，幼蟲以果肉為食，對水果和瓜類蔬菜危害大，經(jīng)濟損失嚴重[1-4]。除斑翅果蠅外，果蠅科、蠅科、麗蠅科等科的大部分物種以腐爛的水果或植物體為食，產(chǎn)卵于果實表面或者縫隙中，雌蟲繁殖能力強，幼蟲蛀食成熟的果實，對水果或蔬菜經(jīng)濟危害大；蠅類可機械性傳播傷寒、痢疾等多種疾病[5-14]；此外，嗜尸性蠅類還具有法醫(yī)學意義[5-9]。目前對蠅類害蟲的鑒定主要基于成蟲形態(tài)的鑒定，但對復雜的形態(tài)學特征和相似的種類鑒定有困難。麻蠅多數(shù)種類形態(tài)相近[5,12]，主要依賴雄蠅尾器鑒定，雌性麻蠅沒有統(tǒng)一的形態(tài)分類標準。在口岸日常檢疫截獲的蠅類多以幼蟲、卵、蛹等蟲態(tài)及大量殘缺不全的蟲體。傳統(tǒng)分類很難準確鑒定物種?；铙w的幼蟲、蛹和卵等飼養(yǎng)成成蟲的周期長，會大大提高鑒定成本，直接影響口岸檢疫部門的效率和質(zhì)量。【前人研究進展】DNA條形碼是分類學中輔助物種鑒定的新技術，是利用線粒體細胞色素C氧化酶I基因(COI)的特定區(qū)段進行物種分子鑒定的方法。2003年由加拿大動物學家Paul Hebert提出，該基因片段已經(jīng)在果實蠅屬[4]、嗜尸性麻蠅[5]、蠅類[6]、麗蠅科[10]、雙翅目[12]等類群中，證明了其鑒定物種的有效性。與傳統(tǒng)形態(tài)學的方法相比，DNA條形碼技術能對昆蟲各生命形態(tài)，以及對保存不完整的昆蟲標本進行準確的物種鑒定，具有明顯優(yōu)勢。對形態(tài)學特征差異性不明顯，或成蟲蟲體不完整，依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定物種受限較大，而對不完整的昆蟲標本或在幼蟲、卵、蛹等階段形態(tài)差異不大的，利用DNA條形碼進行鑒定就具有明顯優(yōu)勢?！颈狙芯壳腥朦c】對誘捕到的蠅類、先經(jīng)形態(tài)學物種分類，再利用COI基因片段進行基因鑒定，再依據(jù)進化樹遺傳距離等確定快速有效鑒定蠅類的方法?！緮M解決的關鍵問題】對來自云南省河口縣、大理市銀橋鎮(zhèn)、劍川縣、蒙自市和元江縣的蠅類標本，采用形態(tài)學和基因水平上的技術手段，能準確鑒定其蠅類科、屬、種的歸類，為后續(xù)快速鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2017年10月至2018年10月，在云南省的河口縣、大理市、劍川縣、蒙自市和元江縣，應用微生物菌株Y2、432、460發(fā)酵液誘捕得到雙翅目蠅類,昆蟲標本保存于微生物菌種篩選與應用國家地方聯(lián)合工程研究中心。

1.2 昆蟲總DNA提取

將誘捕到的雙翅目蠅類昆蟲依據(jù)形態(tài)進行歸類，利用平衡酚-Tris飽和酚法[8,10]，每1個類型提取2～3個個體的DNA。

1.3 PCR擴增與測序

選取通用DNA條形碼COI基因?qū)λ蓄愋蜆颖镜腄NA進行擴增。引物為：ffly-1:5′-TATGTACTACCATGAGGACAAATATC-3′，ffly-2：5′-ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT-3′(上海捷瑞生物技術有限公司合成)。PCR反應的總體積為40 μL，其中含有1.5 μL DNA模板，引物(10 pmol/L)各2 μL，4 μL 10×EasyTaqBuffer，4 μL Mg2+(25 mmol/L)，3.2 μL dNTP，0.4 μLTaqDNA 聚合酶(10 U/μL)。PCR擴增條件為94 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，40個熱循環(huán)；最后在72 ℃延伸10 min，空白對照為ddH2O代替模板。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段為mtDNACOI基因中650 bp序列。

1.4 序列處理與分析

將獲得的序列用DNAMAN軟件閱讀，利用MEGA 6.06進行比對，統(tǒng)計所有種類COI基因部分序列的長度、GC 含量、多態(tài)位點、簡約信息位點等參數(shù)。對不同蠅類之間COI序列遺傳差異進行分析。利用NJ 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用自展法重復檢測，自展參數(shù)設置為1000次，驗證結果。

2 結果與分析

2.1 雙翅目昆蟲種類

經(jīng)1年時間，在云南省河口縣、大理市、劍川縣、蒙自市和元江縣5地共誘捕到蠅類7科21屬43種(表1)，其中果蠅科3屬11種，實蠅科1屬6種，麗蠅科4屬7種，廁蠅科1屬5種，蠅科5屬6種，麻蠅科3屬3種，花蠅科5屬5種。

表1 誘捕到的雙翅目蠅類昆蟲種類

續(xù)表1 Continued table 1

2.2 COI序列特征

43種蠅的線粒體COI基因5’端長度為650 bp的條形碼序列分析(表2)表明：該序列編碼211個氨基酸。其中，果蠅科、實蠅科、麗蠅科、廁蠅科、蠅科、麻蠅科、花蠅科7個科COI基因片段的A+T平均含量分別為65.6%、64.1%、68.9%、67.7%、68.9%、67.0%、68.5%，表現(xiàn)出明顯的A+T堿基偏倚性。

表2 雙翅目蠅類不同科的昆蟲COI序列特征

2.3 蠅類遺傳關系分析

根據(jù)研究獲得的蠅類COI基因片段序列，對蠅類不同科進行種間遺傳距離計算(表3)。11種果蠅種間遺傳距離為0.013～0.190，平均0.151；種內(nèi)遺傳距離為0.002～0.012，平均0.006。種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的25.2倍。其中D.suzukii和D.subpulchrella遺傳距離為0.013，明顯小于其余果蠅之間的遺傳距離，根據(jù)形態(tài)學看，這2種果蠅極其接近，兩者為近源姐妹種。

表3 蠅類各科種間及種內(nèi)遺傳距離

對6種實蠅種間及種內(nèi)遺傳距離分析表明，它們種間遺傳距離為0.150～0.391，平均0.255；種內(nèi)遺傳距離為0.002～0.098，平均0.025。種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的10.2倍。研究結果與雙翅目其他類群的較為一致。

7種麗蠅種間遺傳距離為0.013～0.291，平均0.123；種內(nèi)遺傳距離為0.008～0.018，平均0.012。種內(nèi)遺傳距離是種間遺傳距離的10.2倍。綠蠅屬的銅綠蠅與絲光綠蠅的遺傳距離為0.013，小于其余麗蠅科的種間遺傳距離。

5種廁蠅種間遺傳距離為0.013～0.260，平均0.143；種內(nèi)遺傳距離為0.011～0.014，平均0.013。種內(nèi)遺傳距離是種間遺傳距離的11.0倍。夏廁蠅與元廁蠅遺傳距離為0.013，接近種內(nèi)平均遺傳距離。這一結果與其形態(tài)學分類一致，夏廁蠅與元廁蠅在形態(tài)學上極為相似。

對6種蠅種間及種內(nèi)遺傳距離分析表明，它們種間遺傳距離為0.092～0.198，平均0.158；種內(nèi)遺傳距離為0.002～0.016，平均0.011。種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的14.4倍。刺足齒股蠅與中華毛庶芒蠅、東方芒蠅遺傳距離分別為0.092和0.094；東方芒蠅與中華毛庶芒蠅遺傳距離為0.096。遺傳距離相較于其他蠅科的種間遺傳距離更小。

對麻蠅科的黑尾麻蠅、野亞麻蠅和白頭亞麻蠅研究顯示，其中白頭亞麻蠅和野亞麻蠅，黑尾麻蠅和野亞麻蠅、白頭亞麻蠅和黑尾麻蠅的遺傳距離分別為0.100、0.105、0.103，平均遺傳距離為0.103；野亞麻蠅、白頭亞麻蠅和黑尾麻蠅的種內(nèi)遺傳距離分別為0.011、0.006、0.013，種內(nèi)平均遺傳距離為0.010，種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的10.3倍。

5種花蠅種間遺傳距離為0.110～0.199，平均0.158，種內(nèi)遺傳距離為0.003～0.012，平均0.006，種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的27.3倍。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

由圖1可知，從科水平上看，并未像形態(tài)學一樣形成7個大的獨立分支，實蠅科、果蠅科、廁蠅科、蠅科和麗蠅科大部分物種聚集成一支，各科間分支上，部分物種存在一定的同源交叉，尤其是花蠅科、麗蠅科、蠅科3科物種同源交叉明顯。從屬水平上看，果蠅科3個屬各聚集成一簇，各屬均形成各自的單系，與形態(tài)學結果一致；廁蠅科的廁蠅屬單獨聚集成一簇；蠅科的芒蠅屬和腐蠅屬單獨聚集成一簇，符合形態(tài)學分類要求。從種的水平上看，同一種不同樣本大多聚集在一起，大多數(shù)置信度在90%以上，各種之間區(qū)別開來，絲光綠蠅與銅綠蠅聚成一簇，2種存在同源性交叉，印證了二者種間遺傳距離較小(0.013)的原因，斑翅果蠅與其姊妹種D.subpulchrella聚集在一起支持率達94%，印證2個種親緣關系極其相近，夏廁蠅和元廁蠅聚集在一起，聚集置信度為91%。

分支上數(shù)值示自展檢驗置信度，標尺示遺傳距離The numbers at the nodes indicate the bootstrap value. Scale bar indicates the genetic distance圖1 依據(jù)COI基因序列采用鄰接法構建的云南省43種蠅類系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbor-joining tree for 43 species of flies from Yunnan province, China based on COI gene sequences

3 討 論

3.1 COI基因鑒定蠅類昆蟲的優(yōu)點

應用微生物發(fā)酵液能誘捕到7科21屬43種雙翅目蠅類昆蟲，表明該類誘捕劑具有廣泛誘蠅能力。利用DNA條形碼對雙翅目系統(tǒng)發(fā)育學的研究，主要集中在各科的水平上，如實蠅科[2,4]、果蠅科[3,15]、麗蠅科[7,9]等，而針對各科之間發(fā)育學研究并不多，為此利用DNA條形碼COI基因?qū)﹄p翅目的果蠅科、實蠅科、麗蠅科、廁蠅科、蠅科、花蠅科、麻蠅科43種蠅類的種間及科間系統(tǒng)發(fā)育進行了初步探討。采用DNA條形碼分析時，種內(nèi)、種間遺傳距離是進行物種鑒定的重要依據(jù)。種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離是利用DNA條形碼鑒別物種的條件之一，Hebert等[18]提出種間遺傳距離要達到種內(nèi)遺傳距離的10倍。研究顯示，7科21屬43種蠅類種內(nèi)遺傳距離都很小，而種間遺傳距離較大，果蠅科、實蠅科、麗蠅科、廁蠅科、蠅科、花蠅科和麻蠅科等各科的種間平均遺傳距離分別是種內(nèi)遺傳距離的25.2、10.2、10.2、11.0、14.4、27.3、10.3倍，科間鑒定結果符合要求和具有可行性。

結合建樹方法評估COI序列的鑒定能力，研究結果表明：果蠅科中的斑翅果蠅與其姊妹種D.subpulchrella種內(nèi)遺傳距離均為0.005，種間遺傳距離為0.013，且進化樹上兩者聚集在一起，Zhang等[13]和Conner等[14]的研究也有相同結果。蠅科中，紫綠蠅與亮綠蠅種間遺傳距離為0.089，2個物種在進化樹中聚集在一起，形成2個支系，種內(nèi)同源性為98.2%～100%，利用COI基因可以將2個物種準確鑒定。銅綠蠅與絲光綠蠅同源性高(種間遺傳距離為0.013)，在進化樹上不能完全分開，國內(nèi)外研究結果也相似[16-17]。廁蠅科中，元廁蠅與夏廁蠅種間遺傳距離為0.013，在進化樹上聚集在一起，均為夏廁蠅種團。說明對果蠅科、麗蠅科、廁蠅科中一些近緣種利用COI基因鑒別存在缺陷。

3.2 COI基因鑒定蠅類昆蟲的局限性

對于同源性較強的物種，利用COI基因序列鑒定會有一定的局限性，最大的難點是沒有統(tǒng)一的分子標簽來建立統(tǒng)一的鑒定標準。研究顯示部分物種的種間和種內(nèi)差異不明顯，在進化分支上存在重疊，在種間水平的鑒定分類上利用COI基因序列存在一定的限制，尤其是對于親緣關系較近，形態(tài)相似的物種。對此，可以采取擴大基因選取的范圍、嘗試多個分子標記相互印證，采取分子和形態(tài)學鑒定相結合是一個有效的方法。分類學家已將不同種形態(tài)學上給予足夠的分類標準，但是對形態(tài)相似或者殘體的物種，依靠形態(tài)學無法鑒定的，就要利用COI基因序列的差異性并與形態(tài)學相結合，可以達到對蠅類準確鑒別的目的。

利用COI基因片段，鑒定了云南省河口縣、蒙自市和元江縣應用微生物誘劑誘捕到的雙蠅目昆蟲7科22屬43種。然而在科水平上，7個科的各個物種樣本并未完全聚集成一支，部分物種存在同源交叉，尤其是親緣關系較近的物種，系統(tǒng)進化樹分支與形態(tài)學分類不完全一致，說明利用COI基因片段對蠅類科水平的鑒定存在一定的局限性。從種水平上看，除果蠅科、麗蠅科、廁蠅科部分種的鑒定不明確之外，其余物種均能較好區(qū)分，但種及種下水平或近緣物種鑒定存在同源交叉，鑒定仍然存在一定困難。因此，利用DNA條形碼針對不同種及種下水平之間的分子發(fā)育關系尚待研究。

4 結 論

采取COI基因序列的差異性與形態(tài)學相結合的方法，鑒定了云南省河口縣、大理市、劍川縣、蒙自市和元江縣5地應用微生物誘劑誘捕到的雙翅目蠅類昆蟲有7科22屬43種，基本明確了各蠅類間的遺傳關系，為利用COI基因鑒定雙翅目蠅類昆蟲奠定了科學依據(jù)。