莫周美，張秀芬，李恒銳，劉連軍，吳玲玲，賀 鵬，韋婉羚

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西 龍州 532415)

【研究意義】葛根[Puerarialobata(Willd.) Ohwi]為豆科蝶形花亞科的蔓生性多年生藥食兩用植物，在我國大部分省(區(qū))均有分布，享有“亞洲人參”佳譽(yù)[1-2]，可研制加工成各種功能性保健食品和藥膳食品，市場(chǎng)前景十分廣闊[3-5]。目前我國已選育出“湘葛系列”“贛葛系列”“宋葛系列”“橫峰系列”‘恩葛-08’‘桂葛1號(hào)’和‘桂粉葛1號(hào)’等多個(gè)葛根優(yōu)良品種[2]，葛根產(chǎn)業(yè)得到了快速發(fā)展。雜交育種是品種更新的重要手段，而花粉活力直接影響葛根雜交育種成功率。但至今關(guān)于葛根雜交育種及開花習(xí)性方面的研究報(bào)道不多。因此，觀察了解葛根的開花習(xí)性，分析其花粉活力，確定其花粉的最適宜利用時(shí)期，對(duì)葛根的有性繁育、雜交育種及葛根產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】孫奇[6]研究表明，花性器官的發(fā)生與分化由植物內(nèi)在的遺傳物質(zhì)、內(nèi)源激素及其外在環(huán)境條件共同決定。李海賢等[7]研究認(rèn)為，選擇最佳雜交授粉時(shí)間有利于提高植物育種成功率。方貫?zāi)鹊萚8]研究影響豇豆雜交結(jié)莢率發(fā)現(xiàn)，選擇最佳去雄時(shí)間和授粉時(shí)間可明顯提高豇豆結(jié)莢率。張玉梅等[9]研究菜用大豆雜交授粉方法，發(fā)現(xiàn)上午去雄后立即授粉不利于花粉雜交成活，而在前一天下午先去雄次日上午再授粉，有利于提高花粉的雜交成活率。陳忠文等[10]研究豆薯開花習(xí)性發(fā)現(xiàn)，豆薯在花的旗瓣未開展前已經(jīng)完成授粉過程。王月異等[11]的研究結(jié)果顯示，在苜蓿單花旗瓣展開而翼瓣未伸出花萼時(shí)雄蕊未散粉，此時(shí)進(jìn)行授粉效率較高，可以增加授粉的可信度。楊小丹等[12]研究表明，蘭花花粉活力越高其雜交授粉成功率越高，反之則越低。國內(nèi)外對(duì)葛花的研究主要集中在化學(xué)成分和藥用機(jī)理方面。戴雨霖等[13]研究發(fā)現(xiàn)，葛花中有30多種黃酮類化合物，黃酮類物質(zhì)是葛花的重要成分且含量較高。裴妙榮和丁海琪[14]從葛花中分離出7-甲氧基香豆素。張杰等[15]從葛花中分離出黃豆黃苷等多種化合物。葛花因具有解酒護(hù)肝作用而備受青睞，市場(chǎng)上已有以葛花為主藥的葛根飲料和葛根口服液等多種解酒產(chǎn)品出售[16]。杜鵬等[17]以葛根、葛花為主要原料研究出解酒酸乳飲料并經(jīng)動(dòng)物驗(yàn)證具有解酒功效。郭志芳等[18]研究出主要原料為葛花、具有醒酒功效的葛根咀嚼片。裴香萍等[19]、馬奮剛等[20]對(duì)葛花的藥材性狀、顯微特征和理化性質(zhì)進(jìn)行了研究。郭坤元等[21]開展恩施地區(qū)葛根花粉活力研究，發(fā)現(xiàn)低溫儲(chǔ)藏條件有利于延長葛根花粉活力的保持時(shí)間；花粉萌發(fā)率受蔗糖濃度、硼酸濃度和氯化鈣濃度影響，在自然光和黑暗條件下，葛根花粉萌發(fā)率和花粉管的生長一致性無明顯差異?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，針對(duì)葛根化學(xué)成分分析及藥用機(jī)理的研究較多，但關(guān)于葛花開花習(xí)性和花粉活力方面的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在廣西龍州縣觀察葛根開花習(xí)性，檢測(cè)其不同開花期的花粉活力，了解葛花的生理特性，以期為葛根的雜交育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020年4—12月在廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所葛根種植基地(東經(jīng)106°49′，北緯22°33′)進(jìn)行，供試葛根品種為移栽的野生粉葛(扦插苗)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 2020年4月15日種植，正常大田水肥管理。每個(gè)品種種植80株，行距1.5 m，株距0.6 m，面積為72.0 m2。

1.2.2 開花習(xí)性觀察 葛根花序形成后每天系統(tǒng)觀察花蕾發(fā)育進(jìn)程。參考陳忠文等[10]的方法劃分花蕾發(fā)育時(shí)期(閉萼期、露瓣期、半伸期、始開期、半開期和盛開期)。參考張靜等[22]的方法將葛根花期劃分為初花期、盛花期和末花期，其中，約5%花序花朵開放記為初花期，約50%花序花朵開放時(shí)記為盛花期，約95%花序花朵凋謝記為末花期。參考李海賢等[7]、林立等[23]的方法，在葛根盛花期標(biāo)記10個(gè)即將開放的花序，連續(xù)觀察并記錄開花進(jìn)程。

1.2.3 花粉活力測(cè)定 在葛花盛花期，分別采集半伸期、始開期、半開期和盛開期的花朵，置于裝有少量清潔水的自封袋，快速帶回實(shí)驗(yàn)室，參考陳忠文等[24]、郝麗紅等[25]的TTC染色法和I2-KI染色法測(cè)定花粉活力。其中，TTC染色法染色的花粉粒呈紅色表示具有較強(qiáng)生活力，花粉粒呈淡紅色表示活力微弱，無色為無活力；I2-KI染色法染色的花粉粒呈藍(lán)黑色表示具有較強(qiáng)生活力，花粉粒呈淡藍(lán)色表示活力微弱，花粉粒呈黃褐色和無色為無活力。

TTC染色法的花粉活力(%)= (染紅花粉數(shù)/視野中花粉數(shù)) ×100

I2-KI染色法的花粉活力(%)= (染藍(lán)花粉數(shù)/視野中花粉數(shù)) ×100

1.2.4 花粉萌發(fā)試驗(yàn) 參考郭坤元等[21]的方法開展花粉萌發(fā)試驗(yàn)。根據(jù)1.2.3中的花粉活力測(cè)定結(jié)果，選用盛花期中花粉活力最強(qiáng)一期的花粉開展花粉萌發(fā)試驗(yàn)?；ǚ勖劝l(fā)培養(yǎng)基為0.1%硼酸+0.1%氯化鈣+不同濃度蔗糖。在雙孔凹型玻片孔內(nèi)分別滴入蔗糖濃度為5%、10%、15%和20%的培養(yǎng)基溶液，采集中午11：00—13：00的花粉，將適量花粉輕緩抖落至培養(yǎng)基上，將載玻片水平置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，室溫(約28 ℃)培養(yǎng)45 min，重復(fù)3次。用NiKon-SMZ1270顯微鏡觀察花粉的萌發(fā)情況，每個(gè)載玻片隨機(jī)選取3個(gè)不重復(fù)的視野，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率(以花粉管長度大于花粉直徑視為花粉萌發(fā))?；ǚ勖劝l(fā)率(%)=萌發(fā)的花粉數(shù)/檢測(cè)的花粉總數(shù)×100。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以SPSS 20.0進(jìn)行差異顯著性分析和相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根的開花習(xí)性

觀察發(fā)現(xiàn)，供試野生粉葛花期在10月16日至11月5日，其中，10月16—19日為初花期，10月20日至11月1日為盛花期，11月2—5日為末花期，整個(gè)花期約21 d；花序?yàn)榭偁罨ㄐ?，長度在9.6～42.4 cm，每個(gè)花序有小花9～72朵，自下向上開放，每朵小花開放2～3 d，每個(gè)花序開放5～9 d；花序開花高峰期在初花后2～3 d，其中盛開期在15：00—15：40；開花的起止時(shí)間和開花數(shù)量受天氣狀況影響，天氣晴朗、溫度較高時(shí)開花早，而陰雨天、溫度較低時(shí)開花推遲(表1)。

表1 葛根開花習(xí)性調(diào)查

從圖1可看出，葛花花蕾發(fā)育各時(shí)期表現(xiàn)為：閉萼期花瓣全部包埋在花萼中，花萼緊閉(圖1-A)；露瓣期花瓣剛從萼裂中露出，但長度未超過萼片(圖1-B)；半伸期花瓣長度明顯超過花萼(圖1-C)；始開期旗瓣上部開始分開，龍骨瓣微露，花蕾長度達(dá)最大值(圖1-D)；半開期旗瓣平展張開，翼瓣微張開(圖1-E)；盛開期小花盛開，旗瓣大于90°向上翻轉(zhuǎn)，頂端裂開，翼瓣對(duì)稱張開，龍骨瓣露出(圖1-F)。其中，閉萼期發(fā)育較緩慢，從花蕾形成到閉萼后期約14 d，顏色從黃綠色到基部微紫色再到基部往上2/3以上呈深紫色；露瓣期至半伸期發(fā)育快速，約1 d；半伸期至始開期需16～18 h，到盛開期僅需18～20 h。

A：閉萼期；B：露瓣期；C：半伸期；D：始開期；E：半開期；F：盛開期A：Calyx closed period；B：Dew petals period；C：Half stretch period；D：Presentation period；E：Half period；F：Blooming period圖1 葛根花不同發(fā)育時(shí)期的外部形態(tài)Fig.1 External form at different developmental stages of P.lobata flowers

2.2 葛花花粉活力檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 不同檢測(cè)方法檢測(cè)的花粉活力 由表2可知，在葛根各開花期，TTC染色法測(cè)定的花粉活力均顯著低于I2-KI染色法(P<0.05，下同)，其中，TTC染色法測(cè)定的半伸期花粉活力僅18.8%，而I2-KI染色法的測(cè)定結(jié)果為82.1%；TTC染色法測(cè)定始開期、半開期和盛開期的花粉活力分別為26.1%、24.8%和22.9%，而I2-KI染色法的測(cè)定結(jié)果分別為95.3%、93.5%和92.7%。在顯微鏡下觀察染色情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TTC染色法的花粉粒著色較困難，且顏色較淡，不易辨別(圖2-A)，而I2-KI染色法染色迅速，著色明顯且容易區(qū)分(圖2-B)?？梢?，I2-KI染色法更適宜用于進(jìn)行葛根花粉活力檢測(cè)。

表2 葛根花蕾不同發(fā)育期的花粉活力檢測(cè)結(jié)果

T：TTC染色法染色效果；I：I2-KI染色法染色效果T：Effect of TTC staining；I：Effect of I2-KI staining method圖2 葛根花粉不同染色方法的染色效果比較Fig.2 Pollen dyeing effect of different methods on P.lobata

2.2.2 同一檢測(cè)方法不同花蕾發(fā)育期的花粉活力 從表2和圖3可看出，葛根花蕾不同發(fā)育期的花粉活力存在明顯差異。其中，花蕾處于半伸期時(shí)其花藥的花粉囊未散粉(圖3-A)，I2-KI染色法檢測(cè)的花粉活力為82.1%，顯著低于其他3個(gè)時(shí)期(表2)；始開期時(shí)大部分花藥已散粉，量大且將柱頭包裹(圖3-B)，此時(shí)花粉活力最強(qiáng)，I2-KI染色法檢測(cè)的花粉活力達(dá)95.3%，但與半開期和盛開期無顯著差異(表2)；半開期時(shí)花藥已全部散粉，花粉量仍然較大(圖3-C)，I2-KI染色法檢測(cè)的花粉活力為93.5%；盛開期時(shí)I2-KI染色法檢測(cè)的花粉活力為92.7%，低于半開期，但差異不顯著(表2)。可見，葛花在半開期至盛開期的花粉量及花粉活力均保持在較高水平，說明這些時(shí)期葛花的花粉較適宜用于開展雜交育種。

A：半伸期花蕊；B：始開期花蕊；C：半開期花蕊；D：盛開期花蕊A：Stamens of half stretch period；B：Stamens of presentation period；C：Stamens of half period；D：Stamens of blooming period圖3 葛根花蕾不同發(fā)育期的花蕊散粉情況Fig.3 Situation of stamen powder in different development stages of P.lobata

2.3 葛根花粉萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，葛根花粉在蔗糖濃度為15%的培養(yǎng)基中發(fā)芽率最高，為36.23%，顯著高于其他3個(gè)蔗糖濃度處理；在蔗糖濃度為10%的培養(yǎng)基中發(fā)芽率為12.49%，在蔗糖濃度為20%的培養(yǎng)基中發(fā)芽率為28.75%，二者差異顯著；而在蔗糖濃度為5%培養(yǎng)基中的發(fā)芽率最低，僅1.86%，且顯著低于其他3個(gè)蔗糖濃度處理?？梢?，葛根花粉在不同蔗糖濃度培養(yǎng)基中的發(fā)芽率雖然不高，但以含15%蔗糖的培養(yǎng)基最有利于葛根花粉萌發(fā)。

表3 不同蔗糖濃度對(duì)葛根花粉發(fā)芽的影響

2.4 不同花期花粉活力的相關(guān)分析

I2-KI染色法更適宜用于葛根花粉活力檢測(cè)，因此以I2-KI染色法測(cè)定的半伸期(X1)、始開期(X2)、半開期(X3)和盛開期(X4)4個(gè)花期的花粉活力值進(jìn)行相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)列于表4。由表4可知，葛根不同花期的花粉活力存在一定程度的相互影響，但4個(gè)花期花粉活力間的相關(guān)性均不顯著(P>0.05，下同)。其中，半伸期花粉活力與始開期和半開期花粉活力均呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.21和-0.11；半伸期花粉活力與盛開期花粉活力呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.97；始開期花粉活力與半開期花粉活力呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.95；始開期花粉活力與盛開期花粉活力呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.02；半開期花粉活力與盛開期花粉活力呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.33。

表4 不同花期花粉活力的相關(guān)分析結(jié)果

3 討 論

植物花的形態(tài)特征和傳粉模式是反映植物有性繁殖的重要依據(jù)[26-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，在廣西龍州縣，葛根的花期在10—11月，與紀(jì)寶玉等[30]觀察發(fā)現(xiàn)葛根花期在9月的結(jié)果不一致，可能與葛根品種(系)和地域環(huán)境等不同有關(guān)，但開花持續(xù)時(shí)間約21 d與紀(jì)寶玉等[30]觀察到的葛根開花持續(xù)時(shí)間一致；葛根的每朵小花持續(xù)開放2～3 d，一個(gè)花序持續(xù)開放5～9 d，花序開放的盛花期在初花后2～3 d，小花盛開時(shí)間在15：00—15：40，這些開花習(xí)性目前未見報(bào)道。

本研究參考陳忠文等[10]對(duì)豆薯、李海賢等[7]對(duì)扁蓿豆開花習(xí)性的研究方法，將葛根花蕾的發(fā)育時(shí)期劃分為閉萼期、露瓣期、半伸期、始開期、半開期和盛開期6個(gè)階段。其中，半伸期時(shí)花藥的花粉囊未散粉，到始開期時(shí)大部分花藥散粉將柱頭包裹；始開期至盛開期時(shí)花粉顏色發(fā)生變化，由金黃色變?yōu)榈S色再變?yōu)榛尹S色。本研究取樣時(shí)發(fā)現(xiàn)半伸期葛花的花粉囊雖未散粉，但部分花藥已與柱頭高度持平，且經(jīng)過檢測(cè)花粉活力已較強(qiáng)，雖然認(rèn)為進(jìn)行葛根雜交育種時(shí)在半伸期去雄較合適，但半伸期至始開期厲時(shí)16～18 h，具體在半伸期的哪個(gè)階段進(jìn)行去雄最佳還有待進(jìn)一步探究。

染色法是快速檢測(cè)花粉活力的常用方法[31]。周英等[32]、王剛等[33]研究認(rèn)為，染色法僅能檢驗(yàn)花粉的活力，實(shí)踐上還需開展花粉萌發(fā)試驗(yàn)和授粉試驗(yàn)，在三者的試驗(yàn)結(jié)果一致或呈正相關(guān)時(shí)，染色法才能在葛根育種中發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，TTC染色法對(duì)葛根花粉的染色效果不佳，花粉著色較困難，且顏色深淺差異不明顯，不易辨別，可能與材料選擇有關(guān)；I2-KI染色法檢測(cè)的葛根花粉活力較強(qiáng)，且染色時(shí)間短、效果明顯，因此認(rèn)為I2-KI染色法更適合用于葛根花粉活力檢測(cè)，與陳忠文等[24]對(duì)豆薯花粉活力的檢測(cè)結(jié)果一致，表明葛根花粉中的淀粉含量可能較高，I2-KI更容易使其花粉粒染色[34]；對(duì)不同花期的花粉活力及相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明4個(gè)花期的花粉活力間無顯著相關(guān)性，可能與這幾個(gè)時(shí)期的花粉活力均保持在較高水平且葛花的花粉量均較多有關(guān)。

蔗糖在花粉離體培養(yǎng)中主要發(fā)揮提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓的作用[35]，硼元素是植物體內(nèi)的微量營養(yǎng)生長調(diào)節(jié)劑，對(duì)糖分的吸收具有促進(jìn)作用，且可促進(jìn)花粉管壁形成進(jìn)而加快花粉萌發(fā)生長[36]，Ca2+的動(dòng)態(tài)變化對(duì)啟動(dòng)花粉萌發(fā)、調(diào)節(jié)花粉管伸長等環(huán)節(jié)也具有重要作用[37]。本研究在固定硼酸濃度和Ca2+(氯化鈣)濃度基礎(chǔ)上僅開展不同蔗糖濃度對(duì)葛根花粉萌發(fā)影響試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在含15%蔗糖培養(yǎng)基中的葛根花粉萌發(fā)率顯著高于其他蔗糖濃度培養(yǎng)基，說明適宜蔗糖濃度的培養(yǎng)基對(duì)葛根花粉離體萌發(fā)具有一定促進(jìn)作用；選擇始開期時(shí)的花粉(I2-KI染色法檢測(cè)結(jié)果此時(shí)花粉活力最強(qiáng))進(jìn)行花粉萌發(fā)試驗(yàn)，但葛根花粉在含不同濃度蔗糖培養(yǎng)基中的萌發(fā)率均較低，最高只有36.23%，與郭坤元等[21]對(duì)葛根花粉的萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果差異明顯，是否因葛根品種不同或環(huán)境氣候等因素不同而引起，還需進(jìn)一步探究。

坐果率是制約植物雜交制種產(chǎn)量和授粉效率的重要因素。陳衛(wèi)國等[38]研究辣椒雜交授粉時(shí)發(fā)現(xiàn)，坐果率易受多個(gè)因素如種苗質(zhì)量和授粉植株的營養(yǎng)狀況影響，采取培育壯苗、增施基肥、協(xié)調(diào)植株?duì)I養(yǎng)與生殖生長平衡、科學(xué)栽培管理等措施可提高坐果率。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，葛根在謝花時(shí)花朵全部掉落，無一坐果，直接導(dǎo)致授粉試驗(yàn)失敗。因此，葛根坐果率低是品種問題還是受環(huán)境氣候、栽培管理?xiàng)l件影響，有待在下一步工作中深入探討。

4 結(jié) 論

I2-KI染色法可快速檢測(cè)葛根花粉活力。葛根花粉活力在花蕾始開期至盛開期均維持在較高水平，可根據(jù)天氣狀況選取其中合適時(shí)期的花粉進(jìn)行雜交授粉，從而提高葛根雜交成功率。