張淑艷，康林，張秀智，徐明堂，馬曉麗

蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法是石蠟切片技術(shù)中較常用的染色法之一，蘇木精（H）染液主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)以及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍(lán)色，伊紅（E）主要使細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色［1］。及時(shí)、準(zhǔn)確地固定、透明、脫蠟處理是HE 染色過程中的關(guān)鍵步驟，目前病理學(xué)界中主要采用甲醛和二甲苯來處理標(biāo)本切片，但有研究指出甲醛和二甲苯具有刺激性，病理工作者又需要長期接觸這兩種試劑，長此以往容易對(duì)病理工作者的身體健康造成嚴(yán)重影響［2-3］。因此，尋找環(huán)保、安全性高的固定液和透明脫蠟液就顯得尤為重要。本研究運(yùn)用環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸和Vanclear共同代替甲醛和二甲苯處理切片，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集河北省人民醫(yī)院2018 年1 月至2019 年1 月期間送檢的腦組織（12 例顳葉癲癇病人病變組織）、脾組織（18 例脾功能亢進(jìn)病人病變組織）、骨髓瘤組織（22 例）、淋巴結(jié)組織（50 例肺癌/胃癌手術(shù)中切除的淋巴結(jié)標(biāo)本）、淋巴瘤組織（10 例）、乳腺纖維腺瘤組織（62 例）、宮頸腺癌組織（26 例）、子宮平滑肌瘤組織（74 例）、慢性宮頸炎組織（102例）、胎盤組織（35 例子癇前期病人）、脂肪瘤組織（57 例），病人年齡范圍18.7～70.5 歲，年齡（41.8±5.2）歲。同一部位標(biāo)本各取材兩塊，采用抽簽法隨機(jī)分為A 組和B 組。A 組采用環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸和Van-clear 制作HE 切片468 張，B 組采用傳統(tǒng)甲醛和二甲苯制作HE切片468張，病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 試劑與設(shè)備聚羥基丙烯酸固定液購自于廣州艾發(fā)生物醫(yī)學(xué)技術(shù)工程有限公司，Van-clear 環(huán)保透明脫蠟劑購自于上海創(chuàng)訊醫(yī)療器械有限公司，甲醛溶液購自于上海一基實(shí)業(yè)有限公司，二甲苯購自于上海一基實(shí)業(yè)有限公司，蘇木精染液、伊紅染液購自于上海謹(jǐn)生生物科技有限公司。SAKURA Tissue Tek VIP-5全自動(dòng)密閉式組織脫水機(jī)、DRS-2000J-D2全自動(dòng)染色機(jī)產(chǎn)自于日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會(huì)社，Thermo HM325 輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)產(chǎn)自于德國Thermo公司，切片厚度為2～3μm，BJ43-PAS8000病理圖像分析儀產(chǎn)自于北京市中西集團(tuán)公司，OLYMPUSB×51熒光顯微鏡產(chǎn)自于日本奧林巴斯株式會(huì)社。

1.3 組織處理和制作切片A 組采用4%的中性緩沖甲醛液固定，經(jīng)全自動(dòng)組織脫水機(jī)脫水、二甲苯透明、浸蠟等處理，B 組采用聚羥基丙烯酸固定液固定，經(jīng)全自動(dòng)組織脫水機(jī)脫水、Van-clear 透明、浸蠟等處理。過程中注意固定液的量需達(dá)到標(biāo)本體積的10倍，標(biāo)本固定12 h后取材。

1.4 HE 染色A、B 組標(biāo)本分別經(jīng)過二甲苯或Vanclear 脫蠟處理之后，采用100%乙醇×2 各3 min，流水沖洗；蘇木精染色12 min，流水沖洗；1%的鹽酸乙醇分化數(shù)秒，水洗；1%氨水返藍(lán)，水洗；1%醇溶性伊紅染色1 min，70%乙醇各30 s，95%乙醇×2 各30 s，100%乙醇×2 各2 min，Van-clear 或二甲苯×2 各2 min，最后中性樹膠封固。操作過程中相關(guān)病理組織處理流程和時(shí)間均嚴(yán)格按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)會(huì)病理技術(shù)的相關(guān)規(guī)定和流程進(jìn)行［4］，兩組組織切片的HE 染色均在相同的條件中進(jìn)行，以減少研究結(jié)果的誤差，提高可信度。

1.5 HE 結(jié)果判斷和評(píng)分根據(jù)中國常規(guī)病理切片質(zhì)控中心推薦的質(zhì)控評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［5］判斷兩組切片HE染色情況，判斷的內(nèi)容主要包括切片的脫蠟度、透明度、著色度、顏色鮮亮度等，采用優(yōu)、良、中、差對(duì)切片的染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)定：優(yōu)，切片的脫蠟度好、透明度好、著色度適中、顏色鮮亮度好；良，切片中組織染色程度較好，存在少量背景；中，切片中組織染色程度一般，存在大量背景；差，切片中組織染色程度差甚至未染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 21.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以率和百分比描述切片HE 染色結(jié)果的優(yōu)良率，采用χ2檢驗(yàn)比較，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將A組的HE染色結(jié)果作為實(shí)驗(yàn)參照，判斷B組的HE染色結(jié)果與A組的符合率。

2 結(jié)果

2.1 兩組切片HE 染色情況兩組切片均取材完整、厚度適宜、未見褶皺或刀痕、HE 染色核漿清晰、紅藍(lán)適度、透明潔凈、封裱美觀，具體可見圖1，2。

2.2 兩組切片HE 染色切片優(yōu)良率比較A 組與B組優(yōu)良率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組切片HE染色切片優(yōu)良率比較/例

2.3 B 組與A 組HE 染色結(jié)果符合率將A 組HE染色結(jié)果作為參照，B 組切片的優(yōu)、良、中、差染色結(jié)果與A 組染色結(jié)果的符合率分別為97.4%（456/468）、98.2%（459/468）、99.4%（465/468）、100%（468/468），符合率最小為97.4%，將A 組HE 染色結(jié)果作為參照，B組HE染色結(jié)果預(yù)期符合率較高。

3 討論

病理診斷是臨床醫(yī)學(xué)疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，而優(yōu)質(zhì)的HE切片一直是病理診斷的重要依據(jù)［6］。HE染色法可以將各種組織或細(xì)胞成分與病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)清晰分明地顯示出來，是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)以及科研中最基本和使用最廣泛的染色方法［7-8］。事實(shí)上，在近些年中，國內(nèi)外學(xué)者一直嘗試著使用各種環(huán)保試劑來替代甲醛和二甲苯在HE染色中的作用且成績(jī)斐然［9］。

聚羥基丙烯酸是由多個(gè)羥基丙烯酸聚合而成，性質(zhì)穩(wěn)定的環(huán)保固定液，其固定組織的主要作用機(jī)制可能是羥基和羧基基團(tuán)發(fā)生可逆的酯化反應(yīng)，羧基和氨基集團(tuán)中和反應(yīng)，前者生成穩(wěn)定的酯化物、硬化組織，后者維系穩(wěn)定的反應(yīng)條件，從而使聚羥基丙烯酸和蛋白質(zhì)發(fā)生廣泛的交聯(lián)［10］。Van-clear是一種從桔皮或其他植物中提取的、不含芳香族化合物，性質(zhì)穩(wěn)定［11］。本研究采用環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸和Van-clear 代替?zhèn)鹘y(tǒng)試劑甲醛和二甲苯來處理切片，研究結(jié)果顯示，A、B兩組的切片處理優(yōu)良率相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；將A組HE染色結(jié)果作為參照，則B 組HE 染色結(jié)果預(yù)期符合率較高。研究結(jié)果說明環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸和Van-clear處理切片與傳統(tǒng)試劑甲醛和二甲苯處理切片HE 染色效果相當(dāng)，該結(jié)果與陳志強(qiáng)等［12］研究結(jié)果一致。

4%的中性甲醛水溶液一直是病理學(xué)界的權(quán)威固定溶液，通過與蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生作用，其滲透性強(qiáng)，固定均勻，對(duì)組織收縮的影響較?。?3］。但有研究指出甲醛暴露可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)生理和病理功能的修改，干擾基因正常表達(dá)，且甲醛對(duì)環(huán)境具有污染性，可致癌和促癌［14］，在馬德里召開的第二次國際會(huì)議也肯定了甲醛的毒性影響［15］。而環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸同樣可以和蛋白質(zhì)發(fā)生廣泛的交聯(lián)，但其安全性高、無揮發(fā)性、固定的效率與甲醛相當(dāng)，環(huán)保程度較甲醛高［16］。

100%的乙醇不能與石蠟相溶。進(jìn)行HE 染色前需要脫去切片中的石蠟以利于染色劑更容易進(jìn)入細(xì)胞和組織內(nèi)，該過程稱為脫蠟。透明脫蠟處理的作用機(jī)制主要是由于“相似相溶規(guī)律”，即溶質(zhì)溶劑的結(jié)構(gòu)相似而彼此相容［17］。常用的透明劑為二甲苯，二甲苯是由苯環(huán)組成的芳香烴化合物，而石蠟中80%～95%的成分為直鏈烷烴，相關(guān)資料指出［18-19］，Van-clear 主要由C8～C12 的飽和直鏈烷烴組合而成，與二甲苯的苯環(huán)結(jié)構(gòu)相比更相似于石蠟［11］，因此可以推測(cè)Van-clear 與石蠟更加互溶，脫蠟效果更好，更利于HE染料著色。

綜上所述，聚羥基丙烯酸和Van-clear 處理切片相較于甲醛和二甲苯更加環(huán)保、對(duì)病理工作人員的刺激性小、安全性高，在不改變?nèi)魏翁幚沓绦虻那闆r下效果相當(dāng)，對(duì)于病理實(shí)驗(yàn)室而言具有運(yùn)用、推廣的意義。

（本文圖1，2見封三）

圖1 甲醛、二甲苯處理結(jié)果（HE×100）：1A為慢性宮頸炎組織；1B為宮頸腺癌組織；1C為脂肪組織；1D為骨髓組織圖2 聚羥基丙烯酸、Van-clear處理結(jié)果（HE×100）：2A為慢性宮頸炎組織；2B為宮頸腺癌組織；2C為脂肪組織；2D為骨髓組織