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        環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸和Van-clear用于HE染色效果分析

        2022-04-04 07:09:26張淑艷康林張秀智徐明堂馬曉麗
        安徽醫(yī)藥 2022年4期

        張淑艷,康林,張秀智,徐明堂,馬曉麗

        蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色法是石蠟切片技術(shù)中較常用的染色法之一,蘇木精(H)染液主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)以及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍(lán)色,伊紅(E)主要使細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色[1]。及時(shí)、準(zhǔn)確地固定、透明、脫蠟處理是HE 染色過程中的關(guān)鍵步驟,目前病理學(xué)界中主要采用甲醛和二甲苯來處理標(biāo)本切片,但有研究指出甲醛和二甲苯具有刺激性,病理工作者又需要長期接觸這兩種試劑,長此以往容易對(duì)病理工作者的身體健康造成嚴(yán)重影響[2-3]。因此,尋找環(huán)保、安全性高的固定液和透明脫蠟液就顯得尤為重要。本研究運(yùn)用環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸和Vanclear共同代替甲醛和二甲苯處理切片,結(jié)果如下。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料收集河北省人民醫(yī)院2018 年1 月至2019 年1 月期間送檢的腦組織(12 例顳葉癲癇病人病變組織)、脾組織(18 例脾功能亢進(jìn)病人病變組織)、骨髓瘤組織(22 例)、淋巴結(jié)組織(50 例肺癌/胃癌手術(shù)中切除的淋巴結(jié)標(biāo)本)、淋巴瘤組織(10 例)、乳腺纖維腺瘤組織(62 例)、宮頸腺癌組織(26 例)、子宮平滑肌瘤組織(74 例)、慢性宮頸炎組織(102例)、胎盤組織(35 例子癇前期病人)、脂肪瘤組織(57 例),病人年齡范圍18.7~70.5 歲,年齡(41.8±5.2)歲。同一部位標(biāo)本各取材兩塊,采用抽簽法隨機(jī)分為A 組和B 組。A 組采用環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸和Van-clear 制作HE 切片468 張,B 組采用傳統(tǒng)甲醛和二甲苯制作HE切片468張,病人或其近親屬知情同意,本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

        1.2 試劑與設(shè)備聚羥基丙烯酸固定液購自于廣州艾發(fā)生物醫(yī)學(xué)技術(shù)工程有限公司,Van-clear 環(huán)保透明脫蠟劑購自于上海創(chuàng)訊醫(yī)療器械有限公司,甲醛溶液購自于上海一基實(shí)業(yè)有限公司,二甲苯購自于上海一基實(shí)業(yè)有限公司,蘇木精染液、伊紅染液購自于上海謹(jǐn)生生物科技有限公司。SAKURA Tissue Tek VIP-5全自動(dòng)密閉式組織脫水機(jī)、DRS-2000J-D2全自動(dòng)染色機(jī)產(chǎn)自于日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會(huì)社,Thermo HM325 輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)產(chǎn)自于德國Thermo公司,切片厚度為2~3μm,BJ43-PAS8000病理圖像分析儀產(chǎn)自于北京市中西集團(tuán)公司,OLYMPUSB×51熒光顯微鏡產(chǎn)自于日本奧林巴斯株式會(huì)社。

        1.3 組織處理和制作切片A 組采用4%的中性緩沖甲醛液固定,經(jīng)全自動(dòng)組織脫水機(jī)脫水、二甲苯透明、浸蠟等處理,B 組采用聚羥基丙烯酸固定液固定,經(jīng)全自動(dòng)組織脫水機(jī)脫水、Van-clear 透明、浸蠟等處理。過程中注意固定液的量需達(dá)到標(biāo)本體積的10倍,標(biāo)本固定12 h后取材。

        1.4 HE 染色A、B 組標(biāo)本分別經(jīng)過二甲苯或Vanclear 脫蠟處理之后,采用100%乙醇×2 各3 min,流水沖洗;蘇木精染色12 min,流水沖洗;1%的鹽酸乙醇分化數(shù)秒,水洗;1%氨水返藍(lán),水洗;1%醇溶性伊紅染色1 min,70%乙醇各30 s,95%乙醇×2 各30 s,100%乙醇×2 各2 min,Van-clear 或二甲苯×2 各2 min,最后中性樹膠封固。操作過程中相關(guān)病理組織處理流程和時(shí)間均嚴(yán)格按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)會(huì)病理技術(shù)的相關(guān)規(guī)定和流程進(jìn)行[4],兩組組織切片的HE 染色均在相同的條件中進(jìn)行,以減少研究結(jié)果的誤差,提高可信度。

        1.5 HE 結(jié)果判斷和評(píng)分根據(jù)中國常規(guī)病理切片質(zhì)控中心推薦的質(zhì)控評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]判斷兩組切片HE染色情況,判斷的內(nèi)容主要包括切片的脫蠟度、透明度、著色度、顏色鮮亮度等,采用優(yōu)、良、中、差對(duì)切片的染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)定:優(yōu),切片的脫蠟度好、透明度好、著色度適中、顏色鮮亮度好;良,切片中組織染色程度較好,存在少量背景;中,切片中組織染色程度一般,存在大量背景;差,切片中組織染色程度差甚至未染色。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 21.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以率和百分比描述切片HE 染色結(jié)果的優(yōu)良率,采用χ2檢驗(yàn)比較,P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將A組的HE染色結(jié)果作為實(shí)驗(yàn)參照,判斷B組的HE染色結(jié)果與A組的符合率。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組切片HE 染色情況兩組切片均取材完整、厚度適宜、未見褶皺或刀痕、HE 染色核漿清晰、紅藍(lán)適度、透明潔凈、封裱美觀,具體可見圖1,2。

        2.2 兩組切片HE 染色切片優(yōu)良率比較A 組與B組優(yōu)良率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

        表1 兩組切片HE染色切片優(yōu)良率比較/例

        2.3 B 組與A 組HE 染色結(jié)果符合率將A 組HE染色結(jié)果作為參照,B 組切片的優(yōu)、良、中、差染色結(jié)果與A 組染色結(jié)果的符合率分別為97.4%(456/468)、98.2%(459/468)、99.4%(465/468)、100%(468/468),符合率最小為97.4%,將A 組HE 染色結(jié)果作為參照,B組HE染色結(jié)果預(yù)期符合率較高。

        3 討論

        病理診斷是臨床醫(yī)學(xué)疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn),而優(yōu)質(zhì)的HE切片一直是病理診斷的重要依據(jù)[6]。HE染色法可以將各種組織或細(xì)胞成分與病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)清晰分明地顯示出來,是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)以及科研中最基本和使用最廣泛的染色方法[7-8]。事實(shí)上,在近些年中,國內(nèi)外學(xué)者一直嘗試著使用各種環(huán)保試劑來替代甲醛和二甲苯在HE染色中的作用且成績(jī)斐然[9]。

        聚羥基丙烯酸是由多個(gè)羥基丙烯酸聚合而成,性質(zhì)穩(wěn)定的環(huán)保固定液,其固定組織的主要作用機(jī)制可能是羥基和羧基基團(tuán)發(fā)生可逆的酯化反應(yīng),羧基和氨基集團(tuán)中和反應(yīng),前者生成穩(wěn)定的酯化物、硬化組織,后者維系穩(wěn)定的反應(yīng)條件,從而使聚羥基丙烯酸和蛋白質(zhì)發(fā)生廣泛的交聯(lián)[10]。Van-clear是一種從桔皮或其他植物中提取的、不含芳香族化合物,性質(zhì)穩(wěn)定[11]。本研究采用環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸和Van-clear 代替?zhèn)鹘y(tǒng)試劑甲醛和二甲苯來處理切片,研究結(jié)果顯示,A、B兩組的切片處理優(yōu)良率相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);將A組HE染色結(jié)果作為參照,則B 組HE 染色結(jié)果預(yù)期符合率較高。研究結(jié)果說明環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸和Van-clear處理切片與傳統(tǒng)試劑甲醛和二甲苯處理切片HE 染色效果相當(dāng),該結(jié)果與陳志強(qiáng)等[12]研究結(jié)果一致。

        4%的中性甲醛水溶液一直是病理學(xué)界的權(quán)威固定溶液,通過與蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生作用,其滲透性強(qiáng),固定均勻,對(duì)組織收縮的影響較?。?3]。但有研究指出甲醛暴露可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)生理和病理功能的修改,干擾基因正常表達(dá),且甲醛對(duì)環(huán)境具有污染性,可致癌和促癌[14],在馬德里召開的第二次國際會(huì)議也肯定了甲醛的毒性影響[15]。而環(huán)保試劑聚羥基丙烯酸同樣可以和蛋白質(zhì)發(fā)生廣泛的交聯(lián),但其安全性高、無揮發(fā)性、固定的效率與甲醛相當(dāng),環(huán)保程度較甲醛高[16]。

        100%的乙醇不能與石蠟相溶。進(jìn)行HE 染色前需要脫去切片中的石蠟以利于染色劑更容易進(jìn)入細(xì)胞和組織內(nèi),該過程稱為脫蠟。透明脫蠟處理的作用機(jī)制主要是由于“相似相溶規(guī)律”,即溶質(zhì)溶劑的結(jié)構(gòu)相似而彼此相容[17]。常用的透明劑為二甲苯,二甲苯是由苯環(huán)組成的芳香烴化合物,而石蠟中80%~95%的成分為直鏈烷烴,相關(guān)資料指出[18-19],Van-clear 主要由C8~C12 的飽和直鏈烷烴組合而成,與二甲苯的苯環(huán)結(jié)構(gòu)相比更相似于石蠟[11],因此可以推測(cè)Van-clear 與石蠟更加互溶,脫蠟效果更好,更利于HE染料著色。

        綜上所述,聚羥基丙烯酸和Van-clear 處理切片相較于甲醛和二甲苯更加環(huán)保、對(duì)病理工作人員的刺激性小、安全性高,在不改變?nèi)魏翁幚沓绦虻那闆r下效果相當(dāng),對(duì)于病理實(shí)驗(yàn)室而言具有運(yùn)用、推廣的意義。

        (本文圖1,2見封三)

        圖1 甲醛、二甲苯處理結(jié)果(HE×100):1A為慢性宮頸炎組織;1B為宮頸腺癌組織;1C為脂肪組織;1D為骨髓組織圖2 聚羥基丙烯酸、Van-clear處理結(jié)果(HE×100):2A為慢性宮頸炎組織;2B為宮頸腺癌組織;2C為脂肪組織;2D為骨髓組織

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