周娟，楊寶艷，張政梅

子宮肌瘤是常見的發(fā)生于女性生殖系統(tǒng)的腫瘤，其發(fā)病原因尚不明確，可能與雌激素、孕激素等有關(guān)［1］。子宮肌瘤病人可能出現(xiàn)不孕、子宮出血、下腹疼痛等癥狀，研究子宮肌瘤分子發(fā)生機(jī)制是子宮肌瘤基因治療的途徑之一［2］。miRNA是生命體內(nèi)的小分子非編碼RNA，其表達(dá)具有保守性、時(shí)序性以及組織特異性，miRNA 在不同組織中的表達(dá)量不同，這與可能與miRNA 的功能有關(guān)［3］。研究顯示，miRNA 在人體不同類型細(xì)胞生長、分化、凋亡等生物學(xué)特性中發(fā)揮作用，參與能量代謝、血糖維持等生理過程［4］。miRNA 在腫瘤中作用廣泛，已知多種miRNA 在腫瘤中表達(dá)改變與腫瘤病人的臨床病理特征有關(guān)，這些miRNA 還參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡，miRNA 也逐漸成為基因靶向治療的研究熱點(diǎn)［5］。miR-18a 是一個(gè)腫瘤進(jìn)展調(diào)控因子，miR-18a 在前列腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長［6-7］。研究報(bào)道顯示，miR-18a 在子宮肌瘤中表達(dá)水平下降［8］?，F(xiàn)階段對于miR-18a 在子宮肌瘤細(xì)胞增殖和凋亡中作用還不明確。本研究探討miR-18a 對子宮肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響和靶向調(diào)控機(jī)制，為子宮肌瘤治療提供可能分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018 年3 月至2019 年10 月延安市人民醫(yī)院子宮肌瘤病人手術(shù)切除的肌瘤組織和正常子宮肌組織（病人在手術(shù)切除以前均沒有經(jīng)過藥物治療），納入標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)過臨床以及相關(guān)檢查確診為子宮肌瘤。保存在4 ℃、含有青鏈霉素的PBS 溶液中，標(biāo)本采集已經(jīng)得到病人和近親屬的知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。miR-18a mimics、mimics control 購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司；B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）抗體購自北京百奧萊博科技有限公司；Bcl-2相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體購自上海澤葉生物科技有限公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司；Lipofectamine 3000 購自美國Invitrogen；WNT 家族成員2B（WNT family member 2B，WNT2B）抗體購自上海博研生物科技有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）單染細(xì)胞周期檢測試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司；miRVana miRNA Isolation Kit 購自上海索寶生物科技有限公司；細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體、細(xì)胞周期數(shù)依賴性蛋白激酶4（cell cycle number dependent protein kinase4，CDK4）抗體購自上海信裕生物工程有限公司。

1.2 子宮肌瘤組織和正常子宮肌組織分離培養(yǎng)［9］取子宮肌瘤組織和正常子宮肌組織，用PBS 反復(fù)沖洗，剪碎成＜1 mm3的組織塊，添加800 U/mL 的Ⅰ型膠原酶，置于37 ℃孵育6 h，中間每1 小時(shí)用移液槍吹打1 次。1 000 g 離心10 min，收集的細(xì)胞接種到24孔板中，接種密度為5×105個(gè)/毫升，添加含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于95%空氣、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃，濕度為飽和濕度。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組取子宮肌瘤細(xì)胞，細(xì)胞融合度為70%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將miR-18a mimics、mimics control 轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染步驟同轉(zhuǎn)染試劑說明。將轉(zhuǎn)染miR-18a mimics、mimics control 后 的 細(xì) 胞 命 名 為miR-18a、miR-NC 組，把沒有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞命名為Control組。

1.4 細(xì)胞miR-18a 表達(dá)水平檢測用qRT-PCR 方法檢測miR-18a 表達(dá)，步驟：取培養(yǎng)48 h 以后的Control、miR-NC、miR-18a 組細(xì)胞，用miRVana miRNA Isolation Kit 提取細(xì)胞RNA，用紫外風(fēng)光光度計(jì)檢測濃度和純度。取1 μg 的RNA，添加1 μL 的miScript Reverse Transcriptase Mix、5 μL的5×miScript RT Buffer，加無RNA 酶水至20 μL，按照37 ℃孵育60 min、95 ℃孵育5 min條件合成cDNA。取cDNA，進(jìn)行qRTPCR，PCR體系為：5 μL的引物、5 μL的miScript Primer Assay、25 μL的Quanti Tect SYBR Green PCR Master mix、2 μL的cDNA，加無RNA酶水至50 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃、15 min；94 ℃、15 s；55 ℃、30 s；70 ℃、34 s。內(nèi)參為U6，按照2-ΔΔCt法計(jì)算miR-18a 表達(dá)變化。miR-18a 引 物：正 向 引 物5’-AAGTGCAGGGCCTGCTGATGTTGA-3’，反向引物5’-GCTTGGCTTGAATTATTGGATG-3’。

1.5 細(xì)胞增殖檢測用四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）方法檢測增殖變化，步驟為：取子宮肌瘤細(xì)胞按照Control、miR-NC、miR-18a組分組方法將細(xì)胞接種到96孔板內(nèi)，細(xì)胞接種密度調(diào)整為1×105個(gè)/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)48 h以后，取出培養(yǎng)板，添加20 μL 的MTT 溶液，放在37 ℃孵育4 h，把上清吸掉，加200 μL 的DMSO 溶液，振蕩反應(yīng)10 min，在酶標(biāo)儀上檢測490 nm的A值。A值代表增殖能力。

1.6 細(xì)胞周期檢測用PI 單染法檢測細(xì)胞周期變化，步驟為：取培養(yǎng)48 h 以后的Control、miR-NC、miR-18a 組細(xì)胞，添加提前預(yù)冷的PBS 溶液洗滌2次，加入冰預(yù)冷的70%乙醇溶液，小心吹打混合，在4 ℃過夜。2 000 g 離心15 min，將上清棄掉，以PBS溶液重新懸浮細(xì)胞沉淀，2 000 g 離心10 min。在細(xì)胞中加RNaseA 溶液，在37 ℃孵育30 min，然后加入400 μL的PI染液，在4 ℃避光反應(yīng)30 min，用流式細(xì)胞儀檢測周期變化。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測用Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測凋亡變化，步驟為：取培養(yǎng)48 h 以后的Control、miR-NC、miR-18a 組細(xì)胞，添加提前預(yù)冷的PBS 溶液洗滌2 次，最后將細(xì)胞懸浮在400 μL 的結(jié)合緩沖液中，添加5 μL 的Annexin V-FICT 溶液，置于室溫避光條件反應(yīng)15 min，然后再添加10 μL 的PI染色液，避光孵育10 min 后，立即用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡變化。

1.8 細(xì)胞中cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)檢測用Western blotting 方法檢測細(xì)胞中cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)，步驟為：取培養(yǎng)48 h以后的Control、miR-NC、miR-18a 組細(xì)胞，將上層培養(yǎng)液棄掉以后，加PBS 洗滌細(xì)胞2 次，然后在細(xì)胞中添加PMSF∶RIPA 比例為100∶1 的裂解試劑，放在冰上裂解30 min。4 ℃，12 000g 離心10 min，取上清，以BCA 方法測定濃度。SDS-PAGE 凝膠蛋白上樣量按照每孔30 μg 計(jì)算，將蛋白樣品與1×Loading Buffer 混合煮沸5 min。把電壓設(shè)置為60 V，溴酚藍(lán)前端進(jìn)入分離膠以后，電壓調(diào)整到120 V，觀察溴酚藍(lán)遷移到凝膠的底部以后，取出凝膠。將凝膠浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中10 min，PVDF 膜放在甲醇中平衡5 min，以200 mA 的恒流轉(zhuǎn)膜1 h。電轉(zhuǎn)結(jié)束后取出PVDF 膜，用TBST 洗滌3 次后，放在封閉液中，室溫封閉2 h；取出PVDF 膜，TBST 洗滌3 次，再置于一抗溶液中，在4 ℃過夜反應(yīng)；PVDF 膜再放在二抗孵育液中，室溫結(jié)合2 h。ECL 顯色。目的蛋白水平=目的條帶灰度值÷內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.9 miR-18a與WNT2B 靶向關(guān)系預(yù)測和鑒定靶基因預(yù)測軟件targetscan 預(yù)測miR-18a 與WNT2B 可能互為靶向關(guān)系。分別將含有WNT2B 的3，UTR 端結(jié)合位點(diǎn)（wt-WNT2）和突變后、不含WNT2B 的3，UTR 端結(jié)合位點(diǎn)（mut-WNT2）的熒光素酶報(bào)告載體與miR-18a mimics、mimics control 共轉(zhuǎn)染到子宮肌瘤細(xì)胞中，48 h 后用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性變化。熒光素酶報(bào)告載體由武漢金開瑞生物工程有限公司構(gòu)建合成。收集培養(yǎng)48 h以后的Control、miR-NC、miR-18a 組細(xì)胞，用Western blotting檢測WNT2B蛋白表達(dá)，步驟同“1.8”。

1.10 上調(diào)WNT2B 對miR-18a 調(diào)控作用影響檢測分別將miR-18a mimics、pcDNA3.1 和miR-18a mimics、pcDNA3.1-WNT2B 共轉(zhuǎn)染到子宮肌瘤細(xì)胞中，記為miR-18a+NC、miR-18a+WNT2B 組，利用上述方法測定細(xì)胞增殖（MTT）、周期（PI 單染）、凋亡（Annexin V-FITC/PI 雙染法）和cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2、WNT2B 蛋 白 表 達(dá)（Western blotting）。pcDNA3.1-WNT2B由和元生物技術(shù)（上海）股份有限公司構(gòu)建。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 23.0 軟件分析，滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，兩組數(shù)據(jù)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組差異比較用單因素方差，兩兩比較用turkey test，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-18a mimics 上調(diào)子宮肌瘤細(xì)胞中miR-18a 表達(dá)子宮肌瘤細(xì)胞中miR-18a 表達(dá)水平（0.52±0.06）低于正常子宮肌細(xì)胞（1.00±0.10）（t=7.13，P＜0.05）。與miR-NC 組（0.97±0.13）比較，轉(zhuǎn)染miR-18a mimics 后子宮肌瘤細(xì)胞中miR-18a 表達(dá)水平（3.21±0.25）升高，Control 組（1.00±0.12）與miRNC 組的miR-18a 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=158.36，P＜0.05）。miR-18a mimics 上調(diào)子宮肌瘤細(xì)胞中miR-18a表達(dá)水平。

2.2 miR-18a 抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)凋亡轉(zhuǎn)染miR-18a mimics 后子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力降低，G1 期細(xì)胞比例升高，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中cyclin D1、CDK4、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平下降，Bax 蛋白表達(dá)水平升高。miR-18a 抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)凋亡。見圖1、表1。

表1 miR-18a mimics轉(zhuǎn)染后的子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力（A值）、周期分布比例、凋亡率和cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)/

表1 miR-18a mimics轉(zhuǎn)染后的子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力（A值）、周期分布比例、凋亡率和cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)/

注：cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1，CDK4為細(xì)胞周期數(shù)依賴性蛋白激酶4，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白，Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因。①與miR-NC組比較，P＜0.05。

圖1 miR-18a mimics轉(zhuǎn)染后的子宮肌瘤細(xì)胞凋亡和cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)變化：A為流式細(xì)胞術(shù)檢測子宮肌瘤細(xì)胞凋亡；B為蛋白質(zhì)印跡法檢測子宮肌瘤細(xì)胞中cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

2.3 miR-18a 和WNT2B互為靶向關(guān)系miR-18a 與WNT2B 的3，UTR 端有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，并且wt-WNT2B 熒光素酶報(bào)告載體和miR-18a mimics 共轉(zhuǎn)染后的子宮肌瘤細(xì)胞熒光素酶活性下降。miR-18a和WNT2B互為靶向關(guān)系。見圖2、表2。

表2 細(xì)胞熒光素酶活性變化/

表2 細(xì)胞熒光素酶活性變化/

注：mut為mut-WNT2B 熒光素酶報(bào)告載體，wt為wt-WNT2B 熒光素酶報(bào)告載體

圖2 miR-18a靶基因預(yù)測結(jié)果

2.4 miR-18a 抑制子宮肌瘤細(xì)胞中WNT2B 表達(dá)與miR-NC 組（0.43±0.06）比較，轉(zhuǎn)染miR-18a mimics后子宮肌瘤細(xì)胞中WNT2B 蛋白表達(dá)水平（0.22±0.03）下降，Control 組（0.42±0.04）與miR-NC 組的WNT2B 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.71，P＜0.05）。miR-18a 抑制子宮肌瘤細(xì)胞WNT2B 蛋白表達(dá)。見圖3。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測miR-18a mimics轉(zhuǎn)染后的子宮肌瘤細(xì)胞中WNT2B蛋白表達(dá)

2.5 上調(diào)WNT2B 逆轉(zhuǎn)miR-18a 對子宮肌瘤細(xì)胞增殖、周期和凋亡作用與共轉(zhuǎn)染miR-18a mimics、pcDNA3.1 相比，共轉(zhuǎn)染miR-18a mimics、pcDNA3.1-WNT2B 后的子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力增加，G1 期細(xì)胞比例降低，細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞中cyclin D1、CDK4、Bcl-2、WNT2B 蛋白表達(dá)水平升高，Bax 蛋白表達(dá)水平降低。上調(diào)WNT2B 逆轉(zhuǎn)miR-18a 對子宮肌瘤細(xì)胞增殖、周期和凋亡作用。見圖4、表3。

表3 miR-18a mimics、pcDNA3.1-WNT2B共轉(zhuǎn)染后的子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力（A值）、周期分布比例、凋亡率和cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2、WNT2B蛋白表達(dá)水平/

表3 miR-18a mimics、pcDNA3.1-WNT2B共轉(zhuǎn)染后的子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力（A值）、周期分布比例、凋亡率和cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2、WNT2B蛋白表達(dá)水平/

注：cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1，CDK4為細(xì)胞周期數(shù)依賴性蛋白激酶4，Bax為Bcl-2相關(guān)X 蛋白，Bcl-2為B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因，WNT2B為WNT家族成員2B。①與miR-18a+NC組比較，P＜0.05。

圖4 miR-18a mimics、pcDNA3.1-WNT2B共轉(zhuǎn)染后子宮肌瘤細(xì)胞凋亡和cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2、WNT2B蛋白表達(dá)：A為流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；B為蛋白質(zhì)印跡法檢測cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2、WNT2B蛋白表達(dá)

3 討論

miRNA 在真核生物體內(nèi)廣泛存在，是一類單鏈RNA，其被認(rèn)為是基因調(diào)控領(lǐng)域中的巨大突破。miRNA 是在線蟲中發(fā)現(xiàn)的，其在不同的物種之間具有高度保守性，人體內(nèi)有約30%的基因受到miRNA的調(diào)控作用［10］。研究證實(shí)，免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等均受到miRNA的影響，miRNA通過影響細(xì)胞生長、凋亡等細(xì)胞生理過程而發(fā)揮重要作用［11］。子宮肌瘤進(jìn)展與miRNA 表達(dá)有關(guān)，miRNA 調(diào)控子宮肌瘤細(xì)胞的生長和凋亡［12］。miR-18a 作為一個(gè)多功能調(diào)控因子，其不僅參與子癇前期、心梗等疾病發(fā)生，還與腫瘤進(jìn)展有關(guān)［13-14］。miR-18a 在前列腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-18a 降低腫瘤細(xì)胞增殖能力［6-7］。既往研究已經(jīng)證實(shí)，miR-18a在子宮肌瘤組織中表達(dá)下調(diào)［8］。本研究顯示，上調(diào)miR-18a 后的子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力降低，這與上述研究結(jié)果一致，提示miR-18a 在子宮肌瘤中可能發(fā)揮抑制作用。

細(xì)胞增殖、周期以及細(xì)胞凋亡是細(xì)胞重要的生物學(xué)特性，細(xì)胞周期有序進(jìn)展是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，細(xì)胞增殖和凋亡平衡是機(jī)體內(nèi)環(huán)境維持的重要途徑［15］。細(xì)胞周期分成分裂間期和分裂期，分裂間期是分裂期的準(zhǔn)備階段，也是細(xì)胞周期的關(guān)鍵。研究顯示，細(xì)胞分裂間期有兩個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)換點(diǎn)，其中G1期向S 期進(jìn)展是關(guān)鍵轉(zhuǎn)換點(diǎn)之一，這一過程受到細(xì)胞內(nèi)多種調(diào)控因子的復(fù)雜作用［16］。cyclin D1、CDK4是細(xì)胞從G1期向S期進(jìn)展的促進(jìn)因子，二者在G1期表達(dá)上調(diào)，cyclin D1、CDK4 也是目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤促進(jìn)因子［17］。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞受到外界刺激以后引起的多基因調(diào)控的結(jié)果，Bcl-2是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白家族［18］。Bcl-2蛋白家族含有多個(gè)成員，根據(jù)其在細(xì)胞凋亡過程中的作用可以分成促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白［19］。Bax、Bcl-2 分別為Bcl-2 蛋白家族中的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白［20］。本研究表明，miR-18a具有將細(xì)胞周期阻滯在G1期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，miR-18a還可以減少細(xì)胞中cyclin D1、CDK4、Bcl-2蛋白并促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)，這充分證實(shí)miR-18a有阻滯子宮肌瘤細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。

miRNA 通過堿基互補(bǔ)的方式與靶基因的mRNA 的3’UTR 端結(jié)合，從而影響靶基因的翻譯。miRNA 與靶基因是以不完全匹配的方式結(jié)合，因此miRNA 通過作用多個(gè)靶基因發(fā)揮作用［21］。本研究表明，miR-18a 可以靶向抑制子宮肌瘤細(xì)胞中WNT2B 表達(dá)。WNT2B 是WNT 信號通路的組成部分，其在腫瘤中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)其表達(dá)具有抗腫瘤細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用［22-23］。本研究顯示，WNT2B 能夠逆轉(zhuǎn)miR-18a 對子宮肌瘤細(xì)胞增殖抑制、周期阻滯和細(xì)胞凋亡作用，說明miR-18a 作用機(jī)制與靶向調(diào)控WNT2B 有關(guān)。目前對miR-18a 調(diào)控WNT2B 的下游機(jī)制還不明確，在以后實(shí)驗(yàn)中會進(jìn)行詳細(xì)探討。

以上表明，miR-18a 靶向抑制子宮肌瘤細(xì)胞中WNT2B表達(dá)發(fā)揮增殖抑制、周期阻滯和凋亡促進(jìn)作用，miR-18a 可能是子宮肌瘤進(jìn)展中的抑制因子，靶向miR-18a可能是子宮肌瘤治療的途徑之一。