龐 瑞 蔣玙姝 張杰文

河南省人民醫(yī)院（鄭州大學人民醫(yī)院），河南 鄭州 450003

抗N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）腦炎是針對NMDAR 的GluN1 亞單位的抗體介導的一種罕見的自身免疫性疾病，是成人中最常見的自身免疫性腦炎（autoimmune encephalitis，AE）的類型，約占AE 患者的80%［1］?？筃MDAR 抗體通過與NMDAR交聯(lián)內(nèi)化、介導電流減少、阻斷腎上腺素-B2受體相互作用等機制介導AE的發(fā)生［2］。在抗NMDAR腦炎發(fā)病的急性期，免疫炎癥反應的快速發(fā)展可能導致嚴重的神經(jīng)功能障礙、癲癇持續(xù)狀態(tài)、昏迷和呼吸衰竭等，約70%的患者因氣道保護、運動障礙、持續(xù)性自主功能障礙、意識水平波動或呼吸功能障礙而被收治到重癥監(jiān)護病房［3］?？筃MDAR 腦炎的重癥患者比例較高，ICU治療周期較長，對重癥患者的救治是該病的重要難題［4］。

目前在抗NMDAR 腦炎臨床實踐中廣泛使用的唯一生物標志物是識別腦脊液（CSF）中針對NMDAR 的GluN1 亞單位的IgG 抗體，這是明確診斷所必需的［5］?？贵w滴度在一定程度上被認為反映病情嚴重程度，但該方法具有一定局限性［6］。HANSEN等［7］曾于2013年報道了1例抗NMDAR腦炎病例，患者在康復15 年后隨訪時，腦脊液中抗NMDAR 抗體仍為陽性，寡克隆區(qū)帶提示仍有鞘內(nèi)合成。這些研究提示，在抗NMDAR腦炎中抗體的持續(xù)鞘內(nèi)合成并不能一定意味著腦炎處于活動期，腦脊液抗體滴度、寡克隆帶與病情嚴重程度不一定完全匹配。因此探索重癥抗NMDAR 腦炎的新的生物學標志物至關重要，尤其是為了改善目前的治療管理，促進開發(fā)可能加速康復的新治療方法。

細胞因子影響了B 細胞招募與分化、漿細胞的成熟與抗體分泌等體液免疫過程，T 細胞分化、細胞毒細胞功能等細胞免疫過程［8］。作為可定量測量的客觀指標，細胞因子在某些疾病的診斷和治療方面發(fā)揮著獨特作用并取得較為明顯的效果。重癥肌無力合并胸腺瘤患者Th17 細胞數(shù)量和血清IL-17 水平升高，Th17 細胞百分比與抗乙酰膽堿受體抗體滴度存在相關性，一些研究也報道了NMO患者的血清和腦脊液IL-6 水平升高，腦脊液IL-6 水平與臨床表現(xiàn)之間有相關性［9］。因此，通過檢測細胞因子濃度可判斷疾病的發(fā)展情況。多項研究表明抗NMDAR 腦炎急性期的腦脊液中IFN-γ、TNF-α、CXCL-10、CCL-22、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-10和IL-17A等多種細胞因子水平升高，血漿中IL-2水平升高［10］。

細胞因子作為一類重要的免疫調(diào)節(jié)因子，在復雜的炎癥反應中起著關鍵作用，可能成為重癥抗NMDAR 腦炎病情評估的新標志物。因此我們測量了一些選定的輕、重癥抗NMDAR腦炎患者血和腦脊液的細胞因子水平，包括IL-2、IL-6、IL-4、IL-8、IL-10、IL-5、IL-17、IL-1β、IFN-γ、IFN-α和TNF-α等。通過治療前后多次檢測，評估細胞因子與抗NMDAR腦炎疾病嚴重程度的相關性，以尋找重癥抗NMDAR腦炎新的生物標志物，并為治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 受試者和樣本納入于2020-08—2022-09 在河南省人民醫(yī)院就診的51 例抗NMDAR 腦炎患者，患者在治療前和啟動一線免疫治療2個月后分別收集血漿和腦脊液。一線免疫治療括糖皮質(zhì)激素和靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）或血漿置換。抗NMDAR患者的納入標準為：（1）診斷符合Graus和Dalmau標準［11］；（2）腦脊液中抗NMDAR 抗體的滴度在1：10～1：320。此外，排除標準：（1）明確或疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染；（2）明確或疑似視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病或多發(fā)性硬化；（3）明確或疑似全身性免疫疾病；（4）有惡性腫瘤病史；（5）妊娠；（6）入院前已在外院接受高劑量糖皮質(zhì)激素沖擊、靜脈注射免疫球蛋白或血漿置換治療。51例抗NMDAR腦炎患者包括17例重癥抗NMDAR 腦炎和34 例非重癥抗NMDAR 腦炎。參考國外需要重癥監(jiān)護的抗NMDAR 腦炎標準等［12］重癥抗NMDAR腦炎診斷方法，達到下列條件之一者即可診斷為重癥抗NMDAR 腦炎：（1）因昏迷或癲癇持續(xù)狀態(tài)等在ICU治療；（2）嚴重的精神癥狀；（3）伴呼吸衰竭需要呼吸機輔助治療；（4）嚴重自主神經(jīng)功能障礙（中樞性低通氣、心律失常等）；（5）合并其他并發(fā)癥（感染性休克、器官衰竭等）。同時招募10名提供血漿和腦脊液的患者為對照組，對照組主要診斷為正常顱壓性腦積水，急性腦梗死，帕金森疊加綜合征等，對照組腦脊液及血中的自身免疫性腦炎抗體均為陰性。本研究由河南省人民醫(yī)院倫理委員會審查和批準，患者或其法定監(jiān)護人提供了參與本研究的書面知情同意書，所有實驗均按照相關的指南和規(guī)定進行。

1.2 方法

1.2.1 樣本的收集和保存：收集腦脊液樣本，并在1 000 g 離心10 min，然后將上清液轉移到聚丙烯管中試管中。收集外周血樣本至EDTA管。

1.2.2 細胞因子/趨化因子的定量檢測：細胞因子，包括IL-2、IL-6、IL-4、IL-8、IL-10、IL-5、白介素IL-17、IL-1β、IFN-γ、IFN-α、腫瘤壞死因子TNF-α等，采用多重微球流動免疫熒光法檢測。細胞因子檢測試劑盒由青島瑞斯凱爾生物科技有限公司提供。EDTA-K2抗凝全血離心30 min，取血漿。然后將25 μg實驗緩沖液、25 μg 離心血漿、25 mL 捕獲微球抗體和25 μg檢測抗體混合在流管中，并以500 r/min 的轉速放置在搖床上。在室溫下保存2 h。然后將25 μL的鏈霉親和素-藻紅蛋白（SA-PE）加入到流動管中。然后避光震蕩0.5 h，2 500 r/min 離心5 min，去除上清液，加入洗滌緩沖液，通過渦旋將微球重懸（30 s），離心（1 600 r/min，5 min）去除上清液。CSF 樣品未經(jīng)稀釋進行測量。根據(jù)流式細胞分析儀上樣需求，向管中加入洗滌緩沖液，通過渦旋將微球重懸，上機檢測，最后通過自動流式細胞儀獲得數(shù)據(jù)。

1.2.3 臨床和隨訪評估：采用改良的Rankin 量表（mRS）評分評估臨床神經(jīng)功能障礙。所有抗NMDAR腦炎患者在急性期和啟動一線免疫治療后2個月評估m(xù)RS評分。

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計使用SPSS 26.0 進行統(tǒng)計學分析。用中位數(shù)和范圍來描述定量數(shù)據(jù)。兩兩比較采用Mann-WhitneyU 檢驗。多組 樣 本 的 比 較 采 用Kruskal-Wallis 檢 驗，采 用Mann-WhitneyU 檢驗進行事后分析。P值<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料該研究招募了21 例男性和30 例女性的抗NMDAR腦炎患者?？筃MDAR腦炎患者中位年齡為27（17～40）歲，其中58%為女性。對照組的中位年齡為36（19～51歲），其中60%為女性?；颊吲c對照組在年齡（P=0.073）、性別（P=0.945）方面差異無統(tǒng)計學意義。疾病高峰時患者的臨床癥狀包括以下一種或多種：行為異常、癲癇發(fā)作、言語功能障礙、不自主運動、昏迷、自主神經(jīng)功能障礙、通氣不足、局灶性神經(jīng)病變和認知功能障礙。詳細的臨床表現(xiàn)及MRI、腦電圖和腦脊液表現(xiàn)見表1。所有患者均在發(fā)病后1 個月內(nèi)開始治療，包括糖皮質(zhì)激素和（或）IVIG。19 例使用環(huán)磷酰胺，11 例使用利妥昔單抗，8例使用嗎替麥考酚酯，2例使用奧法妥木單抗以防止復發(fā)。急性期僅接受一線治療（糖皮質(zhì)激素和/或IVIG）、一線治療加環(huán)磷酰胺、一線治療加利妥昔單抗、一線加嗎替麥考酚酯的患者的中位mRS分別為1（0-3）、2（0-5）、3（2-5）、2（1-3）。

2.2 抗NMDAR 腦炎患者與對照組之間的細胞因子/趨化因子水平的比較統(tǒng)計分析顯示，與對照組相比，抗NMDAR腦炎患者血漿中IL-6（P=0.01）、IL-8（P=0.041）、IL-1 β（P=0.018）及腦脊液中IL-6（P=0.021）、IL-8（P=0.026）、IL-1β（P=0.006）水平顯著上升（圖1）。

圖1 抗NMDAR腦炎患者與對照組之間的細胞因子/趨化因子水平比較Figure 1 Comparison of cytokine/chemokine levels between patients with anti-NMDAR encephalitis and controls

2.3 重癥抗NMDAR腦炎患者與非重癥抗NMDAR腦炎患者之間的細胞因子/趨化因子水平比較與非重癥抗NMDAR 腦炎患者相比，重癥抗NMDAR 腦炎患者血漿中IL-6（P=0.006）、IL-1β（P=0.005）和腦脊液中IL-6（P=0.033）、IL-8（P=0.008）水平顯著上升（圖2）。

圖2 重癥抗NMDAR腦炎患者與非重癥抗NMDAR腦炎患者之間的細胞因子/趨化因子水平比較Figure 2 Comparison of cytokine/chemokine levels between patients with severe anti-NMDAR encephalitis and those with non-severe anti-NMDAR encephalitis

2.4 抗NMDAR 腦炎不同階段細胞因子/趨化因子的變化102個樣本被分為2組。第1組為治療前的抗NMDAR 腦炎患者，第2 組為啟動一線免疫治療2個月后。與第1 組相比，第2 組mRS 水平逐漸下降（P=0.003）。第2 組的抗NMDAR 抗體陽性率與第1組差異無統(tǒng)計學意義。

統(tǒng)計學分析顯示，1 組與2 組間血漿IL-6（P＜0.001）、IL-8（P=0.004）、IL-1β（P=0.001）和腦脊液中IL-6（P＜0.001）、IL-8（P=0.002）水平差異有統(tǒng)計學意義。血漿IL-1β、血漿和腦脊液中IL-6及IL-8水平從治療前期至中期呈下降趨勢，2 組間其他細胞因子/趨化因子水平無顯著性差異（圖3）。

圖3 抗NMDAR腦炎不同階段細胞因子/趨化因子的變化Figure 3 Changes in cytokines/chemokines at different stages of anti-NMDAR encephalitis

2.5 抗NMDAR腦炎患者mRS評分與細胞因子/趨化因子水平的相關性分析mRS 與血漿IL-6（P＜0.001，r=0.344）、IL-1β（P＜0.001，r=0.356）和腦脊液IL-8（P＜0.001，r=0.360）的水平呈正相關（圖4）。

圖4 抗NMDAR腦炎患者mRS評分與細胞因子/趨化因子水平的相關性分析Figure 4 Correlation analysis of mRS scores and cytokine/chemokine levels in patients with anti-NMDAR encephalitis

2.6 抗NMDAR 腦炎不同抗體滴度水平細胞因子/趨化因子的變化將治療前后共102 份樣本按腦脊液抗NMDAR抗體滴度水平分為2組。C1包括93個樣品，滴度范圍為陰性～1：100。C2包括9個樣品，滴度范圍大于1：100～1：320。統(tǒng)計學分析顯示，與C1組相比，C2組血漿IL-1β（P=0.001）、IL-6（P=0.046）和腦脊液IL-6（P=0.014）水平顯著升高。2 組間剩余的細胞因子/趨化因子的水平無顯著性差異。

3 討論

本研究顯示，在抗NMDAR腦炎患者的腦脊液和血漿中發(fā)現(xiàn)了幾種與B 細胞和T 細胞活化有關的細胞因子。與對照組相比，抗NMDAR 腦炎患者Th17軸相關的細胞因子IL-6、IL-8和IL-1β水平升高，其中重型抗NMDAR 腦炎患者腦脊液IL-6、IL-8 和血漿IL-6、IL-1β升高更明顯。先前文獻中提到的IL-2、TNF-α、IFN-γ和IL-17A 水平?jīng)]有顯著增加，可能與所有患者都處于疾病的急性期，且抗體滴度較高有關。IL-6、IL-8 和IL-1β水平可能有助于確定疾病的嚴重程度。

盡管抗NMDAR 腦炎主要由體液免疫驅動，但T細胞也可能通過協(xié)調(diào)隨后的炎癥級聯(lián)反應在抗NMDAR腦炎中發(fā)揮重要作用，并協(xié)助B細胞向記憶性B細胞和漿細胞轉化［13］。細胞免疫應答根據(jù)抗原的性質(zhì)和應答的階段招募不同的T細胞亞群［14］。如Th17/Treg 比值的增加被認為是自身免疫的標志，與銀屑病、炎癥性腸病、類風濕性關節(jié)炎和多發(fā)性硬化癥的疾病活動有關［15］。在TGF-β和IL-6的驅動下，幼稚CD4+T 細胞分化Th17 細胞，并產(chǎn)生IL-1β，6，7，8和17［16］。IL-1β可幫助Th1 和Th17 細胞遷移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。既往文獻顯示IL-6是一種多效性細胞因子，可調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，并刺激B細胞分化和促進抗體生成，并調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中漿母細胞的存活［17］。IL-8是CXC谷氨酸-亮氨酸-精氨酸基序攜帶家族的趨化因子，通過CXCR1和CXCR2化學吸引中性粒細胞和其他髓系白細胞遷移。抗NMDAR 腦炎患者IL-6、IL-8 和IL-1β水平的升高與可能與臨床狀況惡化有關［18］。

圖5 抗NMDAR腦炎不同抗體滴度水平細胞因子/趨化因子的變化Figure 5 Changes in cytokine/chemokine levels at different antibody titers against NMDAR encephalitis

在本研究中評估了抗NMDAR 腦炎患者免疫治療前后細胞因子水平變化。與治療前相比，治療2個月后腦脊液中IL-6 和IL-8 顯著降低，血漿中IL-6、IL-8和IL-1β顯著降低。所有患者均接受一線免疫治療（糖皮質(zhì)激素和/或IVIG），IVIG和大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊治療可抑制多種炎性細胞因子/趨化因子的產(chǎn)生。以上結果表明，治療過程中的IL-6、IL-8和IL-1β水平可用于評估患者的治療效果和觀察免疫反應的狀態(tài)。隨著mRS 在免疫治療過程中逐漸降低，抗NMDAR 抗體的陽性率與治療前相比無顯著性差異，且既往研究顯示抗體滴度不能完全反應疾病的狀態(tài)［19］。因此，我們探討了mRS與細胞因子/趨化因子之間的相關性，發(fā)現(xiàn)mRS與血漿IL-6、IL-1β和腦脊液IL-8水平呈正相關。

IL-6通過促進B細胞分化為漿細胞并產(chǎn)生抗體，促進Th2軸細胞因子IL-4和IL-13的產(chǎn)生以增強原始CD4+T細胞向Th2分化同時抑制Th1的分化，從而在適應性免疫中起到重要作用［20］。此外，IL-6 作為細胞因子合成信號在效應T 細胞（包括Th17 細胞和Th22細胞）增殖擴增過程中起到的作用，IL-6與IL-1 β、IL-21 和IL-23 等一起控制Th17 細胞編碼IL-17A、IL-17F、IL-22、RORγt等相關特征基因的表達［21］。并可阻斷Treg 細胞的形成和活性，因此IL-6 被認為是維持Treg 細胞和Th17 細胞功能平衡的調(diào)節(jié)因子［22］。IL-8由單核細胞、淋巴細胞、粒細胞等多種細胞產(chǎn)生，是大型“趨化因子超家族”的成員，人類中存在兩種IL-8受體，分別為CXCR1和CXCR2受體。既往研究確定了IL-8在招募中性粒細胞到炎癥部位過程中的關鍵作用，并提示IL-8 可能是防止中性粒細胞相關器官損傷的新靶點［23］?；趯L-8的臨床前研究，目前已開始開發(fā)人源化抗IL-8抗體和小拮抗劑，作為治療類風濕性關節(jié)炎、銀屑病等疾病的候選藥物。我們的結果表明，隨著抗NMDAR腦炎患者自身免疫反應加劇，臨床癥狀隨著IL-6、IL-8和IL-1β的增加而加重。這為IL-6抑制劑如妥珠單抗治療難治性抗NMDAR腦炎的有效性提供了證據(jù)，同時提示我們IL-8 可能作為抗NMDAR 腦炎治療的新靶點。隨著臨床狀況的改善及mRS 評分的下降，我們觀察到這些細胞因子/趨化因子的水平逐漸降低，表明免疫炎癥反應逐漸減弱。此外，隨著抗體滴度的升高，血漿IL-1β、IL-6 和腦脊液IL-6 水平顯著升高，可能與抗NMDAR抗體的合成有關。

本研究尚存在一定的局限性，為單一中心研究，可能存在地域、人口查因。樣本含量較少，可能導致一定程度的偏差。隨訪時間較短，不能完全反應疾病不同時期的細胞因子/趨化因子變化。只測量了部分選定的細胞因子/趨化因子，可能存在其他的潛在標記物。在未來研究中，可建立多地區(qū)、多中心的大樣本研究，以期減小偏倚，尋找更準確的臨床觀察標記物。