曹放,孫志偉,史幼梧,孫婧,杜豐,肖艷潔,余靖,賈軍,楊穎△
食管癌是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病。最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,2015 年我國新發(fā)食管癌47.79 萬例,死亡37.5 萬例,位列癌癥發(fā)病第3 位,死亡第4位[1]。鱗狀細(xì)胞癌是食管癌主要的病理組織學(xué)類型,約占全部食管癌的90%[2]。食管鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后較差,5年生存率不足20%[1-2]。目前多采用手術(shù)、放療、系統(tǒng)治療(如化療及免疫治療等)、介入治療以及射頻消融等多種治療手段,以期改善患者的生活質(zhì)量,延長生存期。盡管外科技術(shù)不斷進(jìn)步,且新輔助化療、輔助化療及圍手術(shù)期放化療等圍手術(shù)期治療方式日益完善,術(shù)后仍有28%~74%的患者復(fù)發(fā)[3]。探索術(shù)后患者復(fù)發(fā)的相關(guān)因素,可以為患者個體化治療,改善預(yù)后提供一定的依據(jù)。
一直以來,基因突變和基因多態(tài)性都是探索個體化治療和精準(zhǔn)醫(yī)療的熱點。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是常見的基因變異形式,可能與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān),是個體罹患疾病及生存差異的基礎(chǔ)。食管鱗癌患者的圍手術(shù)期治療多以紫杉醇為主。結(jié)合臨床實踐需要,參考已發(fā)表的研究結(jié)果,本研究以紫杉醇藥代動力學(xué)通路為基礎(chǔ)[4],探討ATP 結(jié)合盒亞家族(ATP binding cassette subfamily,ABC)B 成員1(ABCB1)、ABCG2、ABCC1 及ABCC2 這4 個基因的SNP 對食管鱗癌患者術(shù)后無病生存期的影響,旨在為手術(shù)患者提供新的生物標(biāo)志物以評估預(yù)后,并根據(jù)不同的復(fù)發(fā)風(fēng)險進(jìn)行個體化管理與治療。
1.1 研究對象 收集2010年9月—2018年12月北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科VIP2 病區(qū)收治的227例食管鱗癌患者。排除晚期、未接受手術(shù)、未接受圍手術(shù)期治療或圍手術(shù)期未接受紫杉醇治療的患者,最終納入77例圍手術(shù)期接受紫杉醇治療的食管鱗癌根治術(shù)患者作為研究對象。鱗癌的診斷以術(shù)后的病理診斷為準(zhǔn)。所有患者均簽署書面知情同意書,同意出于科學(xué)研究的目的,對其生物學(xué)樣本進(jìn)行檢測并采集其醫(yī)療記錄進(jìn)行分析。本研究得到了北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(倫理批件號2016KT91)。
1.2 研究方法
1.2.1 研究設(shè)計及SNP選擇 本研究為預(yù)后研究,研究設(shè)計為回顧性隊列研究。采集患者靜脈血并保存在-92 ℃冰箱中。研究選擇的SNP 均來自美國國家生物技術(shù)信息中心SNP 數(shù)據(jù)庫(National Center for Biotechnology Information SNP database),符合以下條件的SNP最終被納入研究:(1)中國人群中次要等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)≥20%。(2)基因分型檢出率(genotying call rate)≥95%。(3)基因連鎖不平衡系數(shù)r2<0.8。(4)優(yōu)先選擇位于基因轉(zhuǎn)錄區(qū)域的錯義SNP,即基因外顯子區(qū)域,其次選擇同義SNP,最后是內(nèi)含子SNP。最終7個SNP被確定為研究對象,即ABCB1 rs1045642、rs2032582、rs3213619,ABCG2 rs2231137、rs2231142,ABCC1 rs246221和ABCC2 rs3740066,見表1。
根據(jù)人群中基因分布頻率的不同,等位基因分為主要型(A)和次要型(a);基因型分為主要等位基因純合型(AA)、雜合型(Aa)和次要等位基因純合型(aa)。Aa、aa 分別與AA 比較的方法,稱為基因加性模型;將雜合型及次要等位基因純合型之和(Aa+aa)與AA 比較的方法,稱為基因顯性模型;將aa與AA+Aa比較的方法,稱為基因隱性模型。
Tab.1 Characteristics of selected single nucleotide polymorphisms表1 納入研究的單核苷酸多態(tài)性的特征
1.2.2 基因測序分型 采用MassARRAYTMMaldi-tof 系統(tǒng)(Sequenom,Inc.)進(jìn)行SNP基因測序分型。采用MassARRAYTMAssay Design 軟件設(shè)計聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增的引物和單堿基延伸引物(表2),采用MassARRAYTMCompac 分析儀進(jìn)行質(zhì)譜檢測。約5%的樣本行重復(fù)檢測用于質(zhì)量控制。
Tab.2 Primer sequence of selected single nucleotide polymorphisms表2 單核苷酸多態(tài)性基因測序的引物序列
1.2.3 收集指標(biāo) 收集患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、食管病變位置以及是否為多原發(fā)病變等信息。無病生存期(disease-free survival,DFS)是指從根治術(shù)后到第一次復(fù)發(fā)或因任何原因?qū)е滤劳鲋g的時間。復(fù)發(fā)的確認(rèn)以影像學(xué)診斷結(jié)合臨床實際為準(zhǔn)。對復(fù)發(fā)患者的隨訪以門診訪視為主,同時結(jié)合電話及微信隨訪,所有復(fù)發(fā)的影像學(xué)報告均以紙質(zhì)版形式存檔。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有統(tǒng)計分析均采用SAS v9.4 軟件(SAS Institute Inc.,Cary,NC)進(jìn)行。分別以遺傳加性模型、顯性模型和隱性模型進(jìn)行SNP分析。首先應(yīng)用比例風(fēng)險回歸模型,即Cox回歸模型評估遺傳變異對無病生存的影響,然后校正年齡和性別行進(jìn)一步分析。研究結(jié)果以粗風(fēng)險比(crude hazard ratio,cHR)、校正風(fēng)險比(adjusted HR,aHR)及其95%置信區(qū)間(CI)表示。多次檢驗和小樣本量可能導(dǎo)致研究結(jié)果假陽性,本研究采用半貝葉斯收縮方法(semi-Bayesian Shrinkage)進(jìn)行調(diào)整和驗證[5]。由于缺乏生物機(jī)制研究,且流行病學(xué)證據(jù)有限,因此先驗系數(shù)選擇均值0、方差1.92的正態(tài)分布,即指數(shù)化后先驗HR=1.000,先驗95%CI為0.250~4.000。
2.1 一般臨床特征 在本研究中,77例食管鱗癌術(shù)后患者年齡59(54,62)歲,男62例(80.5%)。52例(67.5%)有吸煙史,51例(66.2%)有飲酒史。10例(13.0%)為多原發(fā)病變,其余67例單發(fā)病灶患者中,3例(4.5%)位于食管胸上段,13例(19.4%)位于胸中段,51例(76.1%)位于胸下段。所有患者均接受了一種甚至多種圍手術(shù)期治療,包括新輔助治療38例(49.4%),輔助化療31例(40.3%),輔助放化療22例(28.6%)。術(shù)后64例(83.1%)患者復(fù)發(fā),13例患者無復(fù)發(fā)(16.9%),中位DFS為368(194,776)d。
2.2 臨床特征對DFS的影響 將患者年齡(連續(xù)變量)、性別(男=0,女=1)、吸煙史(無=0,有=1)、飲酒史(無=0,有=1)、食管病變位置(胸下段=0,胸上中段=1)以及是否為多原發(fā)病變(否=0,是=1)等信息與SNP(加性模型:野生型=0,雜合型=1,純合型=2;顯性模型:野生型=0,其他=1;隱性模型:純合型=1,其他=0)作為自變量納入研究,以是否復(fù)發(fā)(無復(fù)發(fā)=0,復(fù)發(fā)或因任何原因?qū)е滤劳?1)為因變量,進(jìn)行Cox 回歸分析。結(jié)果顯示,未發(fā)現(xiàn)性別、年齡、腫瘤位置及吸煙、飲酒史等與DFS有關(guān),見表3。
2.3 SNP 對DFS 的影響分析 在顯性基因模型下,ABCC2 rs3740066的次要等位基因與DFS縮短有關(guān)。在校正性別和年齡后,該關(guān)聯(lián)仍有統(tǒng)計學(xué)意義[cHR(95%CI)=4.623(1.111~19.241),P=0.035;aHR(95%CI)=4.290(1.010~18.215),P=0.048],即 含ABCC2 rs3740066 的次要等位基因T 的患者復(fù)發(fā)危險較野生型提高3倍以上。其他基因的SNP在各個基因模型下,以及ABCC2 rs3740066 在其他基因模型下,均未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的關(guān)聯(lián)性。見表4。
Tab.3 Analysis of the influence of clinical characteristics on disease-free survival表3 臨床特征對無病生存期的影響分析
2.4 潛在假陽性結(jié)果的校正 多次檢驗和小樣本量可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果,本研究采用半貝葉斯收縮對病例進(jìn)行校正,在采用先驗假設(shè)[先驗HR=1.000,95%CI:0.250~4.000)]的前提下,經(jīng)半貝葉斯收縮,在顯性模型下,與ABCC2 rs3740066野生基因型(CC型)比較,含次要等位基因T的基因型semi-BayesiancHR(95%CI)=2.171(0.828~5.692),P=0.115;semi-BayesianaHR(95%CI)=2.070(0.786~5.457),P=0.141。關(guān)聯(lián)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
本研究探索了藥代動力學(xué)相關(guān)基因多態(tài)性對食管鱗癌術(shù)后DFS的影響,結(jié)果顯示,在食管鱗癌根治術(shù)后的患者中,顯性基因模型下ABCC2 rs3740066含次要等位基因的基因型與DFS 縮短有關(guān),而未發(fā)現(xiàn)臨床因素,如性別、年齡、煙酒史以及食管原發(fā)腫瘤位置及數(shù)量等與DFS有關(guān)。
3.1 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族與惡性腫瘤 在藥物代謝中,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族起到重要的作用,作為主動外排泵,其成員主動地將各種物質(zhì),包括氨基酸、多糖、肽、脂質(zhì)、藥物和毒素轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外。根據(jù)ATP結(jié)合域氨基酸序列的不同,ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族可分為7個亞型,即ABCA~G,包括ABCB1(也稱為多藥耐藥-1,MDR1)、ABCG2(乳腺癌耐藥蛋白,BCRP)以及ABCC2(多藥耐藥相關(guān)蛋白-2,MRP2)等,均在多藥耐藥中發(fā)揮著重要的作用[6]。既往研究也多集中在這些基因與藥物不良反應(yīng)及療效的相關(guān)性上[7-8]。另一方面,除藥物代謝外,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體還可作為癌癥患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。研究證實,在腫瘤干細(xì)胞中有多種ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體,如ABCG2 和ABCC2,這些轉(zhuǎn)運(yùn)體通過主動外排缺氧條件下產(chǎn)生的細(xì)胞毒性代謝物,保護(hù)腫瘤干細(xì)胞免受缺氧相關(guān)細(xì)胞損傷,延長腫瘤干細(xì)胞的存活期[9]。有文獻(xiàn)報道ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白低表達(dá)與多種惡性腫瘤,如肝內(nèi)膽管癌、前列腺癌、頭頸鱗癌等患者預(yù)后差有關(guān)[10-12]。ABCC2 作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族的一員,在藥物分布、代謝和清除以及胞外運(yùn)輸中發(fā)揮著重要的作用,相較于分化好的腫瘤,ABCC2 在組織學(xué)分級高、分化差的腫瘤中表達(dá)更高。
3.2 ABCC2 基因多態(tài)性與惡性腫瘤 ABCC2 基因的SNP 與腫瘤細(xì)胞的藥物抵抗、化療藥物清除和相關(guān)毒性以及患者預(yù)后有關(guān)[13]。目前,有關(guān)食管鱗癌中該基因多態(tài)性與患者復(fù)發(fā)關(guān)系的研究少見,但在胰腺癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤患者中ABCC2 與療效和預(yù)后相關(guān)。在胰腺導(dǎo)管腺癌中,ABCC2 基 因 多 態(tài) 性 包 括rs3740067、rs3740073、rs717620、rs2273697 等的次要等位基因與患者預(yù)后差顯著相關(guān)[14]。乳腺癌中,純合子野生型ABCC2 rs717620 可致外排蛋白表達(dá)增加,引起他莫昔芬活性代謝物在胞內(nèi)和血漿水平的有效濃度降低,導(dǎo)致治療失敗和患者術(shù)后復(fù)發(fā)[15]。肺癌中,ABCC2等位基因變異與化療藥物誘導(dǎo)的毒性和生存期有關(guān)[16-17]。而在結(jié)直腸癌中,ABCC2 的表達(dá)與DFS 延長有關(guān)[18]。由于人種及腫瘤類型的差異,對于ABCC2 基因多態(tài)性的影響,各研究結(jié)論不一,但均證實了其在腫瘤中起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。本研究中的ABCC2 rs3740066與胰腺癌研究中的rs3740067處于高度連鎖不平衡,rs3740066 為錯義變異,可能影響ABCC2 的表達(dá)與功能。與胰腺癌研究結(jié)論相似,本研究發(fā)現(xiàn)該SNP 的次要等位基因與預(yù)后不良相關(guān)。有研究認(rèn)為ABCC2 影響預(yù)后的機(jī)制之一是通過活性氧(ROS)的信號活動。ROS是腫瘤細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控因素,包括侵襲、黏附、血管生成和增殖[19]。手術(shù)誘發(fā)的炎癥反應(yīng)創(chuàng)造了富含ROS的環(huán)境,而ABCC2可能通過轉(zhuǎn)運(yùn)活性氧影響腫瘤細(xì)胞生存,但具體機(jī)制以及SNP 在其中發(fā)揮的作用仍需生物學(xué)實驗探索及驗證。
3.3 研究的局限性 由于筆者所在內(nèi)科病區(qū)的術(shù)后輔助治療患者較少,加之部分患者拒絕簽署知情同意提供血液學(xué)樣本,故本研究樣本量較小,導(dǎo)致檢驗效能較低,因此可能會遺漏有統(tǒng)計學(xué)意義的關(guān)聯(lián)。例如,本研究未發(fā)現(xiàn)選擇的臨床因素,如性別、年齡等與DFS 相關(guān),而既往對臨床因素的研究也缺乏統(tǒng)一的結(jié)論,因此可能由于臨床因素并不影響無病生存,但也可能是由檢驗效能低所導(dǎo)致。此外,作為回顧性研究,本研究可能會受到如回憶偏倚、混雜偏倚、測量偏倚等的影響,從而影響研究結(jié)果?;诙x,需要控制的混雜偏倚指的是“時間上發(fā)生在自變量和因變量之前,并能同時影響自變量和因變量的因素”,而SNP作為胚系突變,受混雜因素影響不大,因此本研究僅對性別和年齡做了校正,對圍手術(shù)期治療及分期等未行控制。而其他偏倚對作為胚系突變的SNP 及相關(guān)研究結(jié)論影響則更小。第三,出于對假陽性的顧慮,本研究采用了半貝葉斯收縮,收縮后并未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的關(guān)聯(lián)。由于缺乏生物機(jī)
制研究,且流行病學(xué)證據(jù)有限,因此本研究選擇了先驗系數(shù)均值0、方差1.92的正態(tài)分布,即指數(shù)化后先驗HR95%CI為1.000(0.250~4.000),該選擇是主觀的,可能影響研究結(jié)論的客觀性。綜上,雖然經(jīng)過半貝葉斯收縮,未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果,但并不能夠得出“基因多態(tài)性與無病生存期不存在關(guān)聯(lián)”的結(jié)論;相反,受小樣本量及多次檢驗的影響,以及半貝葉斯結(jié)果的提示,強(qiáng)烈建議未來更多的基礎(chǔ)研究和大樣本研究加以驗證。最后,由于缺乏相應(yīng)的生物學(xué)機(jī)制研究,因此該研究的結(jié)論難以在功能層面上進(jìn)行解釋,也對未來生物機(jī)制研究提出了更高的要求。
Tab.4 The effect of SNPs on disease free survival表4 SNP對無病生存期的影響分析
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)藥物代謝動力學(xué)基因ABCC2 rs3740066 與食管鱗癌術(shù)后患者無病生存相關(guān)。但由于缺乏生物學(xué)研究,ABCC2 rs3740066 在其中發(fā)揮作用的機(jī)制尚不清楚,因此在需要更大樣本量研究證實的同時,也需要更多的基礎(chǔ)實驗加以驗證。