程維麗，陳曉攀，齊媛媛，文璐，王曉陽

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種累及多器官的自身免疫性疾病，狼瘡性腎炎（LN）是SLE 最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一［1］。糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑為主的傳統(tǒng)誘導(dǎo)方案對大多數(shù)LN患者有效，但仍有部分患者對其不敏感或不能耐受［2］。因此，研究LN的發(fā)病機制并尋找新的治療靶點尤為重要。細(xì)胞焦亡是一種釋放炎性因子的程序化細(xì)胞死亡過程，參與LN的發(fā)?。?］。NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎性小體是介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的多蛋白復(fù)合體［4］，在LN患者足細(xì)胞中表達上調(diào)［5］。絲氨酸∕蘇氨酸激酶1（pim-1）可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及凋亡，在LN 患者腎臟組織中表達上調(diào)，pim-1 抑制劑可抑制小鼠足細(xì)胞上的NLRP3 炎性小體的激活［6］。CCAAT 增強子結(jié)合蛋白β（C∕EBPβ）屬于轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分化［7］。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)pim-1 的啟動子上可能有（C∕EBPβ）的結(jié)合位點，且研究證明C∕EBPβ 在SLE 患者外周血單核細(xì)胞中表達上調(diào)［8］。因此，筆者推測C∕EBPβ可能通過pim-1引起足細(xì)胞上的NLRP3炎性小體激活，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。本研究旨在探討C∕EBPβ 通過pim-1 介導(dǎo)足細(xì)胞損傷的作用機制，為LN的治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠腎小球足細(xì)胞購自上海賽百慷公司，在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院重點實驗室-80 ℃凍存后保存于液氮罐中。腺苷三磷酸（ATP）、脂多糖（LPS）、RPMI-1640 培養(yǎng)基（北京索萊寶生物科技有限公司），胎牛血清（四季青），胰酶（美國Sigma公司），雙抗（博士德），脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen 生命技術(shù)公司），重組小鼠干擾素-γ（北京義翹神州科技股份有限公司），siRNA-NC、siC∕EBPβ慢病毒、pim-1過表達慢病毒（吉凱基因），TRIpure、Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNase inhibitor（北京Bio Teke 公司），2×Taq PCR Master Mix、SYBR Green（北京Solarbio公司），引物（上海生工生物公司），RIPA 裂解液、蛋白上樣緩沖液、5%牛血清白蛋白、BCA蛋白定量試劑盒、凝膠制備試劑盒（鼎國昌盛公司），兔抗NLRP3 抗體、p17 白細(xì)胞介素（IL）-1β 抗體、pim-1 抗體（ABclonal 公司），兔抗p20 半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-1 抗體、C∕EBPβ 抗體（中國Affinity 公司），兔抗Gasdermin D（GSDMD）抗體（中國CST），內(nèi)參β-actin 抗體（美國Santa Cruz），HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 及小鼠IL-1β、IL-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（中國聯(lián)科生物），細(xì)胞染色質(zhì)免疫共沉淀（chip）試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒（wanleibio），優(yōu)化液、質(zhì)粒、pRL-TK vector、pGL3-Basic-pim-1-promotor、熒光素酶檢測試劑盒（中國凱基生物公司）；顯微鏡拍照系統(tǒng)、倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司），紫外分光光度計（美國Thermo 公司），熒光定量PCR 儀（韓國Bioneer 公司），化學(xué)發(fā)光儀（BioRad），電泳儀、凝膠成像分析儀（北京六一公司），酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司），多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）。

1.2 足細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 取小鼠腎小球足細(xì)胞，消化離心后加完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液、20 U∕mL重組小鼠干擾素-γ、RPMI-1640 培養(yǎng)基），調(diào)整細(xì)胞密度至1×105∕mL，將其接種于25 cm2的用Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)瓶中，“8”字混勻后于33 ℃培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)增殖。在37 ℃培養(yǎng)箱中用無干擾素-γ的完全培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)分化。分化成熟的足細(xì)胞按1×105∕mL 的密度接種于6 孔板，分為：（1）Control 組。（2）siRNA-NC 組（用siRNA-NC 轉(zhuǎn)染足細(xì)胞）。（3）siC∕EBPβ組（用siC∕EBPβ 慢病毒轉(zhuǎn)染足細(xì)胞）。（4）Vector-NC 組（空載體轉(zhuǎn)染足細(xì)胞）。（5）pim-1-OE 組（pim-1 過表達慢病毒轉(zhuǎn)染足細(xì)胞）。培養(yǎng)基中加入慢病毒（感染復(fù)數(shù)=10）和轉(zhuǎn)染試劑Lipo3000，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后3 d將細(xì)胞置于含嘌呤霉素的培養(yǎng)基中篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株并凍存，備用。分化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后用LPS 及ATP 進行刺激。分為：（1）LPS+ATP 組。（2）LPS+ATP+siRNA-NC 組。（3）LPS+ATP+siC∕EBPβ組。（4）LPS+ATP+siC∕EBPβ+Vector-NC 組。（5）LPS+ATP+siC∕EBPβ+pim-1-OE組。

1.3 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測C∕EBPβ和pim-1 mRNA水平 提取各組細(xì)胞總RNA，并測定RNA濃度。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA作為模板進行qPCR反應(yīng)，根據(jù)試劑盒要求進行定量分析。反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10μL，上下游引物（10μmol∕L）各0.8μL，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ（50×）0.4μL，cDNA 溶液2μL，滅菌水6μL。反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃34 s，共40個循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。以β-actin 為內(nèi)參，引物序列見表1，采用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA相對表達量。

Tab.1 Primers for qPCR表1 qPCR引物序列

1.4 Western blot 檢測C∕EBPβ、pim-1、NLRP3、p20Caspase-1、GSDMD、p17IL-1β蛋白表達水平 在細(xì)胞中加入RIPA裂解液，冰上靜置30 min 后離心取上清液，用BCA 法測蛋白濃度，并將剩余蛋白溶解于蛋白上樣緩沖液中，每組取20μg上樣蛋白，等量蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠分離后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。用5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h。TBST清洗后，加入兔抗C∕EBPβ 抗體、pim-1 抗體、NLRP3 抗體、p20Caspase-1抗體、p17IL-1β抗體及GSDMD抗體（1∶1 000），于4 ℃搖床上孵育過夜，經(jīng)TBST漂洗后，與HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體（1∶5 000）室溫孵育1 h。以β-actin 為內(nèi)參。將ECL 試劑滴加到PVDF 膜上，用化學(xué)發(fā)光儀進行曝光，用Image J軟件對條帶灰度進行分析。

1.5 ELISA 檢測炎性因子IL-1β 和IL-6 水平 足細(xì)胞在4 ℃，300×g條件下離心10 min，取足細(xì)胞上清液，ELISA檢測細(xì)胞中的IL-1β和IL-6水平，用酶標(biāo)儀檢測450 nm和570 nm處吸光度值，計算IL-1β和IL-6水平。

1.6 chip檢測C∕EBPβ與pim-1基因啟動子的結(jié)合 實驗分為：（1）Input 組（加入RNA 聚合酶Ⅱ）。（2）IgG 組（加入IgG）。（3）anti-C∕EBPβ組（加入C∕EBPβ抗體）。細(xì)胞培養(yǎng)基中加入1%甲醛進行交聯(lián)，并用甘氨酸終止交聯(lián)，超聲破碎染色質(zhì)。各組加入相應(yīng)的抗體、磁珠，洗滌蛋白-DNA復(fù)合物，解聯(lián)后純化收集DNA進行PCR檢測。反應(yīng)體系如下：DNA模板2μL，上下游引物各1μL，2×Taq PCR Master-mix 10μL，ddH2O 補至20μL。反應(yīng)條件：95 ℃5 min，95 ℃20 s，55 ℃20 s，72 ℃30 s，共35個循環(huán)；72 ℃2 min，25 ℃5 min。引物序列見表1。

1.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測C∕EBPβ與pim-1基因啟動子的結(jié)合 實驗分為：（1）Control組。（2）C∕EBPβ-OE組（加入C∕EBPβ 過表達載體）。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至密度達70%的足細(xì)胞用質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑（溶液1：150μL優(yōu)化液+9μL脂質(zhì)體3000；溶 液2：150 μL 優(yōu) 化 液+1 μg pGL3-Basic-pim-1-promotor+1 μg 質(zhì)粒+1 μg pRL-TK vector +6 μL P3000）進行轉(zhuǎn)染，裂解細(xì)胞后，依次加入螢火蟲熒光素酶檢測試劑和Renilla 熒光素酶檢測試劑，用酶標(biāo)儀進行檢測，將螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性比值作為最終的細(xì)胞熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析或welch 檢驗，組間多重比較行LSD-t或Dunnett T3檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沉默C∕EBPβ 表達后足細(xì)胞C∕EBPβ 水平的變化 Control 組、siRNA-NC 組及siC∕EBPβ 組C∕EBPβ mRNA 水 平 分 別 為1.00±0.03、1.04±0.01 和0.25±0.03，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1 298.073，P＜0.01）；3組C∕EBPβ 蛋白水平分別為1.00±0.00、1.01±0.01、0.31±0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=16 886.645，P＜0.01）；與Control 組和siRNA-NC 組相比，siC∕EBPβ組C∕EBPβ mRNA 和蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），Control組與siRNA-NC組C∕EBPβ mRNA和蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。

Fig.1 C∕EBPβ protein level in glomerular podocytes圖1 Western blot檢測C∕EBPβ蛋白表達

2.2 沉 默C∕EBPβ 表 達 后 足 細(xì) 胞NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β 蛋白及炎性因子水平比較 Western blot 顯示，與Control 組相比，LPS+ATP組NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與LPS+ATP+siRNA-NC 組相比，LPS+ATP+siC∕EBPβ 組 NLRP3、 p20Caspase-1、p17IL-1β 蛋白表達水平降低（P＜0.01），見圖2，表2、3。ELISA 結(jié)果顯示，與Control 組相比，LPS+ATP組IL-1β、IL-6 水平明顯升高；與LPS+ATP+siRNANC 組相比，LPS+ATP+siC∕EBPβ 組IL-1β、IL-6 水平明顯下降（P＜0.01），見表2、3。

Fig.2 NLRP3,p20Caspase-1 and p17IL-1β detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β蛋白印跡圖

2.3 沉默C∕EBPβ 表達后足細(xì)胞pim-1 水平的變化 qPCR 結(jié)果顯示，Control 組、siRNA-NC 組及siC∕EBPβ 組pim-1 mRNA 水平分別為1.00±0.08、0.95±0.03、0.36±0.03，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=137.063，P＜0.01）。與Control 組和siRNA-NC 組相比，siC∕EBPβ組的pim-1 mRNA 水平明顯下降（P＜0.05）；與Control組相比，siRNA-NC組pim-1 mRNA水平未見明顯變化。

2.4 C∕EBPβ 與pim-1 基因啟動子結(jié)合 chip 結(jié)果顯示，與IgG 組相比，anti-C∕EBPβ 組有明顯的條帶，見圖3。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示C∕EBPβ-OE組熒光素酶活性較Control組明顯升高（2.27±0.03vs.1.00±0.11，t=6.805，P＜0.01）。

Fig.3 Detection of the relationship between C∕EBPβ and pim-1圖3 chip實驗檢測C∕EBPβ與pim-1結(jié)合

2.5 上調(diào)pim-1后足細(xì)胞pim-1水平的變化 Control、Vector-NC 和pim-1-OE 組pim-1 mRNA 水 平 為1.00±0.05、1.05±0.11、6.99±0.73，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=82.880，P＜0.01）。與Control 組和Vector-NC 組比較，pim-1-OE組pim-1 mRNA水平明顯升高（P＜0.05）；與Control 組比較，Vector-NC 組pim-1 mRNA水平無明顯變化。

Tab.2 Comparison of expression levels of NLRP3,p20Caspase-1,p17IL-1β and inflammatory factors between the Control group and the LPS+ATP group表2 Control組和LPS+ATP組NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β蛋白及炎性因子表達水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of NLRP3,p20Caspase-1,p17IL-1β and inflammatory factors between the Control group and the LPS+ATP group表2 Control組和LPS+ATP組NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β蛋白及炎性因子表達水平比較（n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別Control組LPS+ATP組t NLRP3 1.00±0.00 3.82±0.01 488.438＊＊p20Caspase-1 1.00±0.00 4.90±0.03 237.005＊＊p17IL-1β 1.00±0.00 4.32±0.56 10.322＊IL-1β（ng∕L）38.93±6.45 155.62±20.35 9.468＊＊IL-6（ng∕L）15.82±1.97 64.83±7.35 11.147＊＊

Tab.3 Comparison of expression levels of NLRP3,p20Caspase-1,p17IL-1β and inflammatory factors between the LPS+ATP+siRNA-NC group and the LPS+ATP+siC/EBPβ group表3 LPS+ATP+siRNA-NC組和LPS+ATP+siC/EBPβ組NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β蛋白及炎性因子表達水平比較（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of expression levels of NLRP3,p20Caspase-1,p17IL-1β and inflammatory factors between the LPS+ATP+siRNA-NC group and the LPS+ATP+siC/EBPβ group表3 LPS+ATP+siRNA-NC組和LPS+ATP+siC/EBPβ組NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β蛋白及炎性因子表達水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

組別LPS+ATP+siRNA-NC組LPS+ATP+siC∕EBPβ組t NLRP3 3.90±0.01 2.73±0.01 176.000＊＊p20Caspase-1 5.06±0.05 2.44±0.10 40.448＊＊p17IL-1β 4.02±0.05 2.01±0.02 67.265＊＊IL-1β（ng∕L）151.08±16.67 73.28±12.13 6.534＊＊IL-6（ng∕L）66.32±11.73 31.73±5.29 4.656＊＊

2.6 沉默C∕EBPβ 表達且上調(diào)pim-1 表達后足細(xì)胞NLRP3 炎性小體及炎性因子水平的變化 Western blot 結(jié)果顯示，與LPS+ATP+siC∕EBPβ+Vector-NC 組相 比，LPS+ATP+siC∕EBPβ+pim-1-OE 組NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β、GSDMD 蛋白水平均明顯升高（P＜0.01），見圖4、表4。ELISA結(jié)果顯示，LPS+ATP+siC∕EBPβ+Vector-NC 組、LPS+ATP+siC∕EBPβ+pim-1-OE 組IL-1β 水平分別為（65.28±11.28）ng∕L、（99.21±10.71）ng∕L，IL-6水平分別為（35.53±5.16）ng∕L、（50.57±5.78）ng∕L，與LPS+ATP+siC∕EBPβ+Vector-NC組相比，LPS+ATP+siC∕EBPβ+pim-1-OE 組IL-1β 和IL-6水平升高（t分別為3.710和3.360，P＜0.05）。

Fig.4 NLRP3,p20Caspase-1,p17IL-1β and GSDMD protein levels in glomerular podocytes圖4 Western blot檢測NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β和GSDMD蛋白表達

Tab.4 Comparison of protein levels of NLRP3,p20Caspase-1,p17IL-1β and GSDMD between the two groups表4 2組NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β和GSDMD蛋白表達比較 （n=3，±s）

Tab.4 Comparison of protein levels of NLRP3,p20Caspase-1,p17IL-1β and GSDMD between the two groups表4 2組NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β和GSDMD蛋白表達比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

組別LPS+ATP+siC∕EBPβ+Vector-NC組LPS+ATP+siC∕EBPβ+pim-1-OE組t NLRP3 1.00+0.00 2.37±0.15 15.497＊＊p20Caspase-1 0.95±0.01 3.16±0.05 81.727＊＊p17IL-1β 0.94±0.02 2.08±0.02 66.679＊＊GSDMD 1.05±0.02 1.78±0.01 69.570＊＊

3 討論

NLRP3 炎性小體在LN 發(fā)病機制中可發(fā)揮重要作用［4］，其通過識別多種病原體導(dǎo)致p20Caspase-1活化，一方面裂解GSDMD，誘導(dǎo)細(xì)胞破裂，另一方面切割p17IL-1β和IL-6的前體，轉(zhuǎn)化為活性的p17IL-1β 和IL-6，引起炎癥反應(yīng)［9-11］。研究發(fā)現(xiàn)Nlrp3-R258W突變小鼠會出現(xiàn)更嚴(yán)重的狼瘡樣綜合征，該小鼠NLRP3 炎性小體的過度激活可導(dǎo)致蛋白尿及腎臟免疫復(fù)合物沉積［12］。LN 患者中可見足細(xì)胞上的NLRP3炎性小體表達上調(diào)，NLRP3炎性小體的抑制劑可改善小鼠的蛋白尿［5］。另外，抑制MLR∕lpr小鼠NLRP3∕ASC∕p20Caspase-1 軸可減少炎性因子釋放，從而改善腎臟炎癥［13］。這些研究表明NLRP3炎性小體的激活可引起LN患者的足細(xì)胞損傷，但其上游調(diào)節(jié)因子尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)沉默C∕EBPβ 表達后足細(xì)胞上的pim-1、NLRP3 炎性小體（NLRP3、p20Caspase-1）、p17IL-1β、IL-6水平下降，進一步研究發(fā)現(xiàn)C∕EBPβ可與pim-1啟動子結(jié)合，另外當(dāng)沉默C∕EBPβ 表達且上調(diào)pim-1 表達后可使足細(xì)胞上的NLRP3 炎性小體及炎性因子水平升高，說明C∕EBPβ∕pim-1∕NLRP3 軸在足細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用，且C∕EBPβ是pim-1的上游調(diào)節(jié)因子。

C∕EBPβ 可 以 調(diào) 節(jié)p20Caspase-1 及IL-6 的 表達［14-15］。C∕EBPβ-∕-小鼠腹膜巨噬細(xì)胞中NLRP3炎性小體表達下調(diào)［16］。敲除C∕EBPβ 可以減少小鼠心肌成纖維細(xì)胞IL-8 及IL-6 的釋放［17］。在急性腎損傷小鼠中，C∕EBPβ 通過激活NLRP3∕p20Caspase-1 信號軸引起腎小管上皮細(xì)胞焦亡［18］。在局灶節(jié)段性腎小球硬化癥中，C∕EBPβ 可通過激活較長的非編碼RNALOC105374325 的表達引起足細(xì)胞凋亡［19］。另外SLE患者外周血單核細(xì)胞中C∕EBPβ的表達上調(diào)，且與SLE 的疾病活動性有關(guān)［8］。關(guān)于C∕EBPβ 在足細(xì)胞損傷中的作用尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS+ATP 刺激足細(xì)胞后NLRP3、p20Caspase-1、p17IL-1β及IL-6 水平明顯升高，但沉默C∕EBPβ 表達后可抑制LPS+ATP 誘導(dǎo)的NLRP3 炎性小體及炎性因子表達，表明LPS+ATP可引起足細(xì)胞上的NLRP3炎性小體激活，且C∕EBPβ 可通過NLRP3∕p20Caspase-1 信號軸參與足細(xì)胞損傷。

pim-1 屬于Ca2+∕鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶，最初研究表明其與惡性腫瘤及肺動脈高壓的發(fā)病有關(guān)［20-21］。Fu 等［6］發(fā)現(xiàn)pim-1 在SLE 小鼠腎臟組織和LN患者外周血單核細(xì)胞中表達上調(diào)，并可通過細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)NLRP3 炎性小體的激活，且pim-1 抑制劑可減輕LN患者的蛋白尿狀況。在本研究中，沉默C∕EBPβ 表達后pim-1 的mRNA 水平下降，提示C∕EBPβ 與pim-1 相互作用。chip 實驗和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C明C∕EBPβ 可與pim-1 基因啟動子結(jié)合，前者可調(diào)節(jié)后者的轉(zhuǎn)錄。進一步研究發(fā)現(xiàn)沉默C∕EBPβ 表達且上調(diào)pim-1 表達后，足細(xì)胞上的GSDMD、NLRP3 炎性小體、p17IL-1β 及IL-6 水平明顯升高，說明pim-1 可激活NLRP3∕p20Caspase-1 軸引起足細(xì)胞損傷，而且這種機制是通過C∕EBPβ介導(dǎo)pim-1來實現(xiàn)的。

綜上所述，C∕EBPβ∕pim-1∕NLRP3軸可能參與足細(xì)胞損傷。但本研究未探討上調(diào)足細(xì)胞C∕EBPβ 表達是否可引起NLRP3 炎性小體及炎性因子水平升高，且僅在細(xì)胞水平探討了C∕EBPβ∕pim-1∕NLRP3軸在足細(xì)胞損傷中的作用，尚待動物實驗和臨床研究進一步驗證。