李 琳，朱 彪，田蕭羽，黨瑞杰，趙立升，楊 爍，孫 磊，溫 寧解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 0085； 首都醫(yī)科大學(xué)附屬復(fù)興醫(yī)院 口腔科，北京 0008； 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 口腔科，北京 0085； 中國人民解放軍戰(zhàn)略支援部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心 口腔科，北京000

老年性骨質(zhì)疏松是老年人常見的代謝性骨疾病，其造成骨質(zhì)量下降，增加骨折風(fēng)險(xiǎn)并導(dǎo)致骨折愈合延遲，嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量[1]。正常生理狀態(tài)下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的自我更新和成骨分化是維持骨組織穩(wěn)態(tài)及骨折修復(fù)的重要機(jī)制[2]。BMSCs與成骨細(xì)胞譜系間復(fù)雜的相互作用會受到年齡的影響[3]。研究表明衰老BMSCs的成骨分化能力逐漸降低，不利于骨組織的正常代謝和損傷重建[4]。因此，使用藥物改善年齡相關(guān)的骨質(zhì)疏松對維持骨代謝平衡具有重要意義。大麻二酚(cannabidiol，CBD)是一種具有廣泛生物學(xué)活性的大麻素類天然化合物[5]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CBD可促進(jìn)干細(xì)胞向成牙及成骨方向分化[6]。同時(shí)，CBD的干預(yù)可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，并決定了間充質(zhì)干細(xì)胞在應(yīng)激條件下的命運(yùn)[7]。自噬過程對BMSCs成骨分化至關(guān)重要[8]，但CBD能否促進(jìn)衰老狀態(tài)下BMSCs的成骨分化仍不清楚。因此，本研究利用D-半乳糖(D-galactose，D-gal)作用于小鼠BMSCs建立體外細(xì)胞衰老模型，研究CBD對衰老BMSCs成骨分化的影響，并探討自噬在其中的作用，為CBD的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

材料與方法

1 細(xì)胞、試劑與儀器 5 周齡 C57BL/6 小鼠BMSCs(解放軍總醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室)；CBD(CATO，美國)；D-gal(索萊寶，中國)；氯喹(chloroquine，CQ；Sigma，美國)；胰酶(Sigma，美國)；胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)；PBS(Hyclone，美國)；成骨誘導(dǎo)液(賽業(yè)，中國)；CD11b、CD29、CD44、CD45、CD31、CD34、CD73、CD90、CD105抗體(BD，美國)；CCK-8試劑盒、RIPA、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒(碧云天，中國)；P62抗體(#5114；CST，美國)；LC-3B 抗體(Ab192890；Abcam，英國)；β-actin 抗體(BM0627；博士德，中國)；BCA蛋白定量試劑盒(博士德，中國)；qRT-PCR試劑盒(Takara，日本)；細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀(Thermo，美國)；流式細(xì)胞儀(BD Celesta，美國)；蛋白電轉(zhuǎn)、電泳設(shè)備(Bio-Rad，美國)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(FTC-3000P，F(xiàn)unglyn Biotech，加拿大)。

2 BMSCs的培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的 5 周齡 C57BL/6小鼠BMSCs，接種于含有10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，置于含5% CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長至80% ~ 90%時(shí)傳代，并使用第 3 ~ 5 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定 BMSCs 第 3 代細(xì)胞正常培養(yǎng)2 d后，在培養(yǎng)皿中加入適量0.25%胰酶，終止消化后 l 000 r/min 離心 5 min 收集細(xì)胞。PBS 洗滌細(xì)胞3次后分別加入帶有熒光標(biāo)記的BMSCs表面標(biāo)志物的抗體(CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105)。輕彈混勻后放置于冰上避光孵育30 min，PBS洗滌2次后重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。采用FlowJo 10.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

4 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖 將第 3 代 BMSCs以3×103/孔的密度接種于96孔板，細(xì)胞隨機(jī)分為對照組(Vehicle)、衰老模型組 (40 g/L D-gal[9])和CBD 干預(yù)組 (40 g/L D-gal + 2.5 μmol/L CBD)。細(xì)胞接種過夜后更換為含有 40 g/L D-gal或 40 g/L D-gal + 2.5 μmol/L CBD 干預(yù)的培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)，每 2 ~ 3 d 換液，于接種后 1 ~ 10 d 每天檢測細(xì)胞的增殖活力。測定時(shí)，按照CCK-8說明書，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液并于 37℃ 孵育 2 h 后，使用酶標(biāo)儀測量其在450 nm波長處的吸光度值。

5 Western blot檢測 LC-3B 及 P62 蛋白表達(dá) 將第3代BMSCs以5×104/孔的密度接種于6孔板，細(xì)胞隨機(jī)分為對照組(Vehicle)、衰老模型組(40 g/L D-gal)、CBD 干 預(yù) 組 (40 g/L D-gal + 2.5 μmol/LCBD)和自噬抑制組 (40 g/L D-gal + 2.5 μmol/L CBD + 20 μmol/L CQ[10])。細(xì)胞接種過夜后加藥并加入成骨分化誘導(dǎo)液，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后用RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后定量30 μg蛋白上樣并進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜，按照1∶1 000的濃度配置一抗P62和LC-3B并進(jìn)行孵育，4℃過夜，次日二抗室溫孵育1 h后使用顯影劑觀察條帶上蛋白的表達(dá)情況。具體實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[11]。

6 qRT-PCR 檢測衰老及成骨相關(guān)基因的 mRNA表達(dá) 將第3代BMSCs以1×105/孔的密度接種于6孔板，細(xì)胞隨機(jī)分為對照組(Vehicle)、衰老組(D-gal)和 CBD 干預(yù)組 (D-gal + CBD)，正常培養(yǎng)3 d后使用TRIzol試劑提取總RNA，測定RNA濃度后定量1 μg RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測衰老相關(guān)基因P16和P21的mRNA表達(dá)；將BMSCs以5×104/孔的密度接種于6孔板，細(xì)胞分組及處理同Western blot，然后使用qRT-PCR檢測成骨相關(guān)基因ALP、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2(runt-related transcription factor 2，Runx2)和骨鈣素(osteocalcin，OCN)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。PCR 反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃15 s，72℃ 15 s，40 個(gè)循環(huán)。相關(guān)引物均由上海生工合成，引物序列見表1。

表1 衰老及成骨相關(guān)基因引物序列Tab.1 Primers sequences used for qRT-PCR

7 ALP 活性檢測 將 BMSCs 以 5×104/孔的密度接種于6孔板，細(xì)胞分組及處理同Western blot。分別于加藥后 1 d、3 d、5 d 和 7 d 按照 ALP 檢測試劑盒的操作說明收集各組細(xì)胞裂解液，分別取50 μL 加入 96 孔板，37℃ 孵育 5 min 后加入 100 μL終止液終止反應(yīng)，測量樣品在405 nm波長處的吸光度值并計(jì)算各組的ALP活性。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用 SPSS26.0 和 Graphpad Prism 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠 BMSCs 鑒定及體外衰老模型的建立 對復(fù)蘇的小鼠BMSCs進(jìn)行表面標(biāo)志物鑒定，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，P3代小鼠BMSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD29(99.27%)、CD44(98.04%)、CD73(96.66%)、CD90(99.26%)和 CD105(98.90%)，低表達(dá)造血及內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志CD11b(1.11%)、CD31(0)、CD34(1.35%)和 CD45(0.98%)(圖1A)。使用40 g/L D-gal作用于 BMSCs，qRT-PCR顯示 D-gal處理后BMSCs的P16和P21 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)，證明D-gal處理成功建立了衰老BMSCs模型；而CBD干預(yù)后P16和P21的表達(dá)水平較D-gal組明顯降低(P＜0.05)，提示CBD可明顯改善D-gal誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老狀態(tài)(圖1B)。

圖1 小鼠BMSCs衰老細(xì)胞模型的建立A：小鼠BMSCs表面標(biāo)志物鑒定；B：P16和P21的mRNA表達(dá)水平(aP＜0.05，vs Vehicle組；bP＜0.05，vs D-gal組)Fig.1 Senescence model of mice BMSCs A: surface markers of mice BMSCs by flow cytometric analysis; B: mRNA expression levels of P16 and P21 (aP＜0.05, vs vehicle group; bP＜0.05, vs D-gal group)

2 CBD 促進(jìn)衰老 BMSCs的增殖活性 CCK-8 法檢測 D-gal及 CBD 處理后小鼠 BMSCs 1 ~ 10 d 的增殖變化。與正常增殖的空白對照組相比，D-gal誘導(dǎo)的衰老BMSCs從第4天開始增殖活力明顯降低(P＜0.05)，而聯(lián)用CBD則顯著增強(qiáng)，從第5天開始與僅使用D-gal組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，表明CBD可促進(jìn)衰老BMSCs的增殖。見圖2。

圖2 CBD對衰老BMSCs增殖的影響(aP＜0.05，vs Vehicle組；bP＜0.05，vs D-gal組)Fig.2 Effect of CBD on senescent BMSCs proliferation (aP＜0.05,vs vehicle group; bP＜0.05, vs D-gal group)

3 CBD 激活衰老 BMSCs 中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot檢 測 各 組BMSCs 中 自 噬 相關(guān)P62和LC3B蛋白表達(dá)情況。在D-gal誘導(dǎo)的衰老模型中，P62蛋白表達(dá)顯著升高，LC3B-Ⅱ表達(dá)降低(P＜0.05)。而CBD干預(yù)顯著提高了被D-gal抑制的LC3B-Ⅱ表達(dá)，同時(shí)降低P62蛋白表達(dá)(P＜0.05)，提示CBD可激活BMSCs的自噬活性。而在CBD干預(yù)組中再加入自噬抑制劑氯喹后，P62蛋白和LC3B-Ⅱ蛋白的表達(dá)均升高(P＜0.05)，表明自噬抑制劑氯喹抑制了CBD激活的BMSCs自噬。見圖3。

圖3 CBD對衰老BMSCs中自噬相關(guān)蛋白P62和LC3B表達(dá)的影響(aP＜0.05，vs Vehicle組；bP＜0.05，vs D-gal組；cP＜0.05，vs D-gal+CBD 組)Fig.3 Effect of CBD on protein levels of P62 and LC3B in senescent BMSCs (aP＜0.05, vs vehicle group; bP＜0.05, vs D-gal group; cP＜0.05, vs D-gal+CBD group)

4 CBD 通過自噬增強(qiáng)衰老 BMSCs成骨相關(guān)基因的表達(dá) qRT-PCR檢測成骨相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。與空白對照組相比，D-gal組中ALP、Runx2和OCN基因mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05)，提示衰老BMSCs中成骨分化受到抑制。而CBD干預(yù)組ALP、Runx2和OCN的mRNA表達(dá)水平顯著高于D-gal組(P＜0.05)，同時(shí)高于空白對照組(P＜0.05)。而當(dāng)CBD激活的自噬被氯喹抑制后，CBD提高成骨相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的作用被顯著抵消，表明CBD增強(qiáng)衰老BMSC成骨分化的作用在一定程度上是由激活自噬產(chǎn)生的。見圖4。

圖4 CBD對成骨相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響(aP＜0.05，vs Vehicle組；bP＜0.05，vs D-gal組；cP＜0.05，vs D-gal+CBD組)Fig.4 Effect of CBD on mRNA expression levels of osteogenesisrelated gene (aP＜0.05, vs vehicle group; bP＜0.05, vs D-gal group; cP＜0.05, vs D-gal+CBD group)

5 CBD 通過自噬增強(qiáng)衰老 BMSCs 的 ALP 活性 經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，各組BMSCs隨著時(shí)間生長，ALP活性逐漸增強(qiáng)。與空白對照組相比，D-gal誘導(dǎo)的衰老BMSCs組ALP活性受到顯著抑制(P＜0.05)，而在 3 d、5 d 和 7 d 時(shí)，CBD 干預(yù)組BMSCs的ALP活性較衰老組顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。但當(dāng)CBD與自噬抑制劑氯喹聯(lián)用時(shí)，ALP活性顯著降低(P＜0.05)。以上結(jié)果說明CBD增強(qiáng)衰老BMSCs的ALP活性的作用，與激活自噬明顯相關(guān)。見表2。

表2 各組BMSCs的ALP活性檢測Tab.2 ALP activity of different groups

討 論

本研究通過使用D-gal構(gòu)建衰老BMSCs模型，在衰老BMSCs中觀察到CBD能夠降低衰老相關(guān)基因P16、P21的表達(dá)水平，促進(jìn)衰老BMSCs增殖，激活自噬相關(guān)蛋白，并促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，提高衰老BMSCs的ALP活性。加入自噬抑制劑氯喹后，CBD促進(jìn)衰老BMSCs成骨分化的作用明顯減弱，表明CBD通過激活自噬促進(jìn)衰老BMSCs的成骨分化。

間充質(zhì)干細(xì)胞具有多能性，其自我更新和成骨譜系分化是維持骨組織穩(wěn)態(tài)和修復(fù)的重要基礎(chǔ)[12]。在生理性過程中，BMSCs在細(xì)胞因子的激活下增殖并分化為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等，通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)維持骨代謝平衡[13]。在本研究中，我們首先通過流式細(xì)胞術(shù)對培養(yǎng)的小鼠BMSCs進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子，證明我們成功培養(yǎng)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

P16和P21是細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，作為衰老標(biāo)志物，是氧化應(yīng)激等多重因素引發(fā)細(xì)胞衰老的重要機(jī)制[14]。研究表明CBD可降低衰老胰島細(xì)胞中P16和P21的表達(dá)[15]。在本研究中，D-gal顯著提高了BMSCs的P16和P21的mRNA表達(dá)水平，表明D-gal的干預(yù)成功誘導(dǎo)了BMSCs的衰老狀態(tài)。而CBD的加入顯著降低了D-gal引起的P16和P21表達(dá)升高，提示CBD在抵抗BMSCs衰老中的有益作用。

干細(xì)胞的增殖潛能往往會隨著衰老的進(jìn)程而逐漸減弱，并與骨質(zhì)疏松的發(fā)生密切相關(guān)[16]。研究發(fā)現(xiàn)，老年小鼠BMSCs的增殖能力顯著降低[17]。體外實(shí)驗(yàn)表明，CBD單獨(dú)應(yīng)用可促進(jìn)BMSCs的活力[18]。在本實(shí)驗(yàn)中我們也觀察到，經(jīng)D-gal處理后的BMSCs，增殖活性受到明顯抑制，而聯(lián)用CBD則顯著恢復(fù)了增殖活性，表明CBD可在一定程度上促進(jìn)衰老BMSCs的增殖潛能。

自噬是細(xì)胞代謝的重要過程，能夠通過溶酶體清除胞內(nèi)異常物質(zhì)而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，且與細(xì)胞衰老關(guān)系密切[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，代表細(xì)胞衰老狀態(tài)的P16和P53水平與細(xì)胞自噬水平呈明顯正相關(guān)[21]。P62是細(xì)胞自噬的底物蛋白，與自噬的激活狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)[22]。當(dāng)自噬激活時(shí)P62被利用，當(dāng)自噬被抑制時(shí)P62蛋白在細(xì)胞內(nèi)堆積[23]。LC3B是自噬的標(biāo)志蛋白，當(dāng)自噬激活時(shí)，胞質(zhì)游離型LC3B-Ⅰ迅速轉(zhuǎn)換為膜結(jié)合型LC3B-Ⅱ，進(jìn)而促進(jìn)自噬體的形成[24]。在本研究中，衰老BMSCs的P62蛋白表達(dá)升高，LC3B-Ⅱ水平較低，說明其自噬狀態(tài)受到抑制。CBD干預(yù)降低P62表達(dá)水平，同時(shí)升高LC3B-Ⅱ表達(dá)水平，表明CBD能夠激活自噬過程。氯喹是自噬過程的抑制劑，通過抑制自噬體與溶酶體的融合在自噬晚期發(fā)揮抑制作用[25]。因此氯喹干預(yù)后LC3B-Ⅱ的表達(dá)水平并不會降低。我們將CBD與氯喹聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)P62與LC3B-Ⅱ的表達(dá)顯著增高，表明CBD激活的自噬被氯喹抑制，從反面證明了CBD對自噬的激活作用。

成骨分化能力下降是衰老BMSCs最重要的表現(xiàn)，與自噬抑制顯著相關(guān)[26]。但CBD是否能通過自噬過程調(diào)控BMSCs成骨分化尚無實(shí)驗(yàn)證據(jù)。ALP和Runx2是BMSCs成骨分化早期的重要指標(biāo)，而OCN主要表達(dá)于成骨后期[27]。研究表明在MG-63細(xì)胞中，CBD促進(jìn)ALP和Runx2的表達(dá)并提高ALP活性[7]。我們首先通過qRT-PCR檢測了BMSCs中ALP、Runx2和OCN的mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示經(jīng)D-gal干預(yù)的BMSCs中三種基因的mRNA表達(dá)均降低，而聯(lián)用CBD抵消了D-gal對成骨基因表達(dá)的抑制作用。同時(shí)，我們觀察到ALP活性檢測結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，CBD顯著提高了被D-gal降低的BMSCs的ALP活性?？梢酝茢啵珻BD可能在成骨的早期和后期具有持續(xù)的促進(jìn)衰老BMSCs成骨分化的作用，而自噬抑制劑氯喹可部分對抗CBD促進(jìn)成骨相關(guān)基因表達(dá)和提高ALP活性的效應(yīng)。以上結(jié)果表明，CBD通過激活自噬進(jìn)而促進(jìn)D-gal誘導(dǎo)的衰老BMSCs成骨分化。

有研究發(fā)現(xiàn)，ROS水平升高、氧化應(yīng)激和自由基損傷等是細(xì)胞衰老的重要機(jī)制[28]。而D-gal通過誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，包括ROS的升高，從而建立體外細(xì)胞衰老模型[29]。既往研究表明，CBD能夠降低衰老胰島細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激應(yīng)答和ROS水平[15]，因此衰老小鼠BMSCs中CBD促進(jìn)成骨分化與細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激及ROS水平的關(guān)系值得進(jìn)一步探討。本研究存在一定的局限性，CBD對衰老小鼠骨質(zhì)疏松的干預(yù)效果仍需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。

綜上所述，CBD的干預(yù)可激活衰老小鼠BMSCs的自噬過程，這種激活作用能夠促進(jìn)衰老小鼠BMSCs成骨分化。CBD作為一種安全有效的藥物，對衰老性骨質(zhì)疏松的治療潛力值得關(guān)注。