郭 嘉，卞 華，單 雨，趙晶晶，張瀟文，陳 爽，卞 博

（1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2. 南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院，河南 省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南南陽 473004）

系統(tǒng)性硬化癥（systemic sclerosis，SSC）是一種免疫介導(dǎo)的疾病，其發(fā)病機(jī)制是血管病變、免疫系統(tǒng)激活和廣泛的組織纖維化的復(fù)雜相互作用［1］。盡管有證據(jù)表明其存活率有所提高，但死亡率仍然很高，比任何其他風(fēng)濕性疾病都高［2，3］。目前臨床常用免疫抑制劑與激素控制病情。免疫抑制劑包括環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤，以及最近使用的單克隆抗體進(jìn)行的靶向治療［4］。盡管研究顯示治療后皮膚和肺部受累有所改善，但尚無確切證據(jù)表明它們能有效治療硬皮?。?，6］。

刺山柑是維吾爾族用于治療風(fēng)濕病的一味常用藥，使用范圍包括根皮、葉和果實(shí)，具有祛風(fēng)、散寒、除濕的作用［7］。近年來多項(xiàng)基礎(chǔ)研究表明刺山柑在SSC 小鼠模型中可通過調(diào)節(jié)多項(xiàng)通路和細(xì)胞因子來影響SSC 的疾病進(jìn)展［8-11］。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，利用已有數(shù)據(jù)庫，對刺山柑治療SSC過程中可能作用的靶點(diǎn)和通路進(jìn)行預(yù)測，為今后相關(guān)臨床研究提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 SSC 靶點(diǎn)的收集

登錄GEO 數(shù)據(jù)庫獲取GSE76807 芯片，P＜0.05，｜logFC｜＞0.5 為過濾條件，使用R 軟件繪制火山圖，篩選差異基因。分別登錄GeneCards、PharmGkb、TTD 以及DrugBank 以“scleroderma”為關(guān)鍵詞搜索SSC 相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 刺山柑治療SSC 靶點(diǎn)預(yù)測

查閱相關(guān)文獻(xiàn)［7，12，13］獲取刺山柑化學(xué)成分，依次輸入PubChem 數(shù)據(jù)庫獲取2D 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫獲取刺山柑靶點(diǎn)。匯總后刪除重復(fù)數(shù)據(jù)。將刺山柑靶點(diǎn)與SSC 靶點(diǎn)取交集，并繪制Venn 圖，獲取有效靶點(diǎn)。使用Cytoscape 3.8.0 繪制刺山柑-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治霁@取核心基因

登錄String 數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入有效靶點(diǎn)，選擇人類物種，設(shè)置最低得分0.4，獲取蛋白互作分析（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖并保存CSV 文件。打開Cytoscape 3.8.0 導(dǎo)入CSV 文件，使用自帶CytoNCA 插件進(jìn)行拓?fù)浞治觯^濾條件為中介中心度（betweenness centrality，BC）、接近中心度（closeness centrality）、程度中心性（degree centrality，DC）、特征向量中心度（Eigenvector centrality，EC）、基于局部平均連接度的方法（local average connectivity-based method，LAC）、信息中心度（information centrality）以及網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality）每次大于中位值，最終獲取核心基因。

1.4 分子對接驗(yàn)證

將獲取的核心基因登錄PDB 數(shù)據(jù)庫下載其結(jié)構(gòu)，去除水分子和小分子配體，與其所對應(yīng)的化合物使用AutoDock Vina 軟件進(jìn)行分子對接。選取最低結(jié)合能的組合結(jié)果，使用Pymol 軟件進(jìn)行可視化繪圖。

1.5 GO 和KEGG 分析

通過R 軟件中的ClusterProfiler 對預(yù)測基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）的生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，對P值進(jìn)行FDR（false discovery rate）矯正，設(shè)置閾值qvalue＜0.05，使用R 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 SSC 相關(guān)靶點(diǎn)

GSE76807 芯片過濾作火山圖（圖1），獲取差異基因1 431 個。分別于GeneCards、PharmGkb、TTD以及DrugBank 數(shù)據(jù)庫獲取SSC 相關(guān)靶點(diǎn)1 796 個、74 個、8 個和1 個。去除重復(fù)基因，共獲取SSC 相關(guān)靶點(diǎn)3 171 個。

圖1 GSE76807 芯片基因差異火山圖Fig 1 Gene difference volcano map of GSE76807 chip

2.2 刺山柑治療SSC 靶點(diǎn)預(yù)測

去除無有效靶點(diǎn)的成分和重復(fù)基因后，獲取刺山柑有效成分黃酮類［漢黃芩素（Wogonin）、異鼠李素（Isorhamnetin）、山柰酚（Kaempferol）、槲皮素（Quercetin）、異銀杏黃素（Isoginkgetin）、銀杏黃素（Ginkgetin）、櫻黃素（Prunetin）、Isorhamnetin-3-Orutinoside、槲皮素3-O-glucoside-7-O-rhamnoside、槲皮素3-O-glucoside、山奈酚-3-glucoside、蘆丁（Rutin）］、生物堿類［Cadabicine、煙酰胺（Niacinamide）以及水蘇堿（Stachydrine）］共15 個，所對應(yīng)靶點(diǎn)178個。將SSC 靶點(diǎn)與刺山柑靶點(diǎn)取交集獲得預(yù)測靶點(diǎn)66 個，并在Cytoscape 3.8.0 軟件中繪圖（圖2），其中圖中節(jié)點(diǎn)大小與其在網(wǎng)絡(luò)中邊的數(shù)量成正相關(guān)。

圖2 刺山柑-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Capparis spinosa-active ingredients-target network diagram

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治霁@取核心基因

登錄String 數(shù)據(jù)庫，將預(yù)測靶點(diǎn)輸入，物種選擇人類，過濾得分為0.4，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。保存TSV 文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件進(jìn)行拓?fù)浞治觯▓D4），最終獲取核心基因VEGFA、TNF、AKT1、PTGS2、MMP9、MMP2、ACE、IL2、EGFR以及ESR1。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network diagram

圖4 Cytoscape 拓?fù)浞治鯢ig 4 Cytoscape topology analysis

2.4 分子對接驗(yàn)證

選取核心基因排名靠前的VEGFA、TNF、AKT1、PTGS2、MMP9 靶蛋白與度值排名前6 的化合物（漢黃芩素、異鼠李素、山柰酚、槲皮素、異銀杏黃素、銀杏黃素）進(jìn)行分子對接，選取最低結(jié)合能組合（表1）使用Pymol 軟件進(jìn)行繪圖（圖5～9）。最低結(jié)合能越低，靶蛋白與活性成分之間結(jié)合活性度越高，說明兩者之間結(jié)合能力越好。結(jié)果表明靶蛋白與刺山柑主要有效成分具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。

圖5 AKT1-異銀杏黃素Fig 5 AKT1- Isoginkgetin

圖6 MMP9-槲皮素Fig 6 MMP9-Quercetin

圖7 PTGS2-銀杏黃素Fig 7 PTGS2- Ginkgetin

圖8 TNF-異銀杏黃素Fig 8 TNF-Iso- Isoginkgetin

圖9 VEGFA-異銀杏黃素Fig 9 VEGFA- Isoginkgetin

表1 核心靶點(diǎn)與有效成分分子對接結(jié)果Tab 1 Molecular docking results between core targets and active ingredients

2.5 GO 和KEGG 通路分析

GO 分析（圖10）顯示涉及的BP 過程有活性氧代謝過程（reactive oxygen species metabolic process）、蛋白激酶B 信號（protein kinase B signaling）、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)（regulation of inflammatory re-sponse）、磷脂酰肌醇3-激酶信號（phosphatidylinositol 3-kinase signaling）、細(xì)胞對藥物的反應(yīng)（cellular response to drug）。CC 過程涉及多巴胺能神經(jīng)突觸（dopaminergic synapse）、突觸膜的組成部分（integral component of synaptic membrane）、突觸膜的內(nèi)在組成部分（intrinsic component of synaptic membrane）、谷氨酸能突觸（glutamatergic synapse）、突觸后膜的組成部分（integral component of postsynaptic membrane）等。MF 過程涉及血紅素結(jié)合（heme binding）、四吡咯結(jié)合（tetrapyrrole binding）、兒茶酚胺結(jié)合（catecholamine binding）、核受體活性（nuclear receptor activity）、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性（ligand-activated transcription factor activity）、轉(zhuǎn)錄輔激活結(jié)合（transcription coactivator binding）、G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性（G protein-coupled amine receptor activity）、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性（transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity）、金屬肽酶活動（metallopeptidase activity）等。KEGG 通路分析（圖11）顯示涉及PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、蛋白聚糖與癌癥（Proteoglycans in cancer）、人乳頭瘤病毒感染（Human papillomavirus infection）、黏著斑（Focal adhesion）、Rap1 信號通路（Rap1 signaling pathway）、MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）、癌癥中的microRNA（MicroRNAs in cancer）等通路。

圖10 GO 富集分析Fig 10 GO enrichment analysis

圖11 KEGG 富集分析Fig 11 KEGG enrichment analysis

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)刺山柑含有廣泛的生物活性化合物，如生物堿、黃酮類、甾體類、萜類和生育酚［14］，其分離鑒定主要集中在果實(shí)中。本研究發(fā)現(xiàn)，刺山柑治療SSC 的主要化學(xué)成分為漢黃芩素、異鼠李素、山柰酚、槲皮素等。漢黃芩素對肝纖維化具有保護(hù)作用。漢黃芩素能顯著減輕CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化和TGF-β1激活的肝星狀細(xì)胞的肝纖維化［15］。漢黃芩素能有效地抑制TGF-β1誘導(dǎo)的I型膠原和α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)水平的上調(diào)，并且可以降低Smad3 磷酸化，從而起到在腎小管上皮細(xì)胞中抗纖維化作用［16］。異鼠鼠素通過抑制TGF-β1介導(dǎo)的Smad3 和p38 MAPK 信號通路，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)的形成和自噬，對肝纖維化具有保護(hù)作用［17］。山奈酚注射可顯著減少受損皮膚的瘤狀細(xì)胞SMA+肌成纖維細(xì)胞、CD3+T 細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞的數(shù)量［18］。此外，山奈酚可顯著降低硬化皮膚中氧化應(yīng)激相關(guān)因子HO-1、NOX2 的mRNA 水平，以及炎性和促纖維化細(xì)胞因子IL-6、TGF 和TNF 的mRNA 水平。山奈酚可以抑制氧化誘導(dǎo)的SSC 成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的積累，降低氧化誘導(dǎo)的SSC 成纖維細(xì)胞的凋亡［18］。槲皮素可以抑制F4/80+/CD11b+/CD206+ M2 巨噬細(xì)胞的極化，并通過拮抗TGF-β1/Smad2/3 信號，減少細(xì)胞外基質(zhì)的過度積累和間質(zhì)纖維化，來改善腎纖維化［19］。

SSC 內(nèi)皮功能障礙是其最重要的特征，它涉及到大血管和微血管。微循環(huán)進(jìn)行性紊亂導(dǎo)致慢性組織缺氧狀態(tài)，刺激血管生成生長因子如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的釋放，與健康人群對比SSC 患者的血清VEGF 水平更高［20］。有基礎(chǔ)研究表明刺山柑總生物堿對SSC 的VEGF 與ET-1 異常表達(dá)具有一定調(diào)節(jié)作用［21］。IL-22 能使成纖維細(xì)胞對TNF產(chǎn)生反應(yīng)，并通過促進(jìn)TNF 誘導(dǎo)的角化細(xì)胞激活促進(jìn)促炎成纖維細(xì)胞表型。這些結(jié)果證實(shí)了角化細(xì)胞-成纖維細(xì)胞相互作用在皮膚纖維化中的影響［22］。PTGS2 又稱環(huán)氧合酶-2（COX-2），其在內(nèi)皮功能中的作用包括血管反應(yīng)性和血管生成［23］。有研究表明COX-2 升高的患者中，除了TNF-α 水平升高外，趾部潰瘍和關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率也很高［24］。SSC 的主要病理特征是皮膚和內(nèi)部器官纖維化，這是由正常的組織結(jié)構(gòu)改變和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白沉積造成的。ECM 組分被基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）降解［25］。國內(nèi)有研究表明刺山柑總生物堿可通過調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1 失衡，減少Col-Ⅳ合成，改善SSC 組織纖維化。

通路分析顯示刺山柑治療SSC 可能涉及多條通路?，F(xiàn)已有研究表明PI3K-Akt 信號通路與皮膚纖維化評分具有密切的相關(guān)性和時(shí)間模式。COMP、THBS1、THBS4、FN1和TNC是PI3K-Akt通路在皮膚纖維形成中的前沿基因［26］。有試驗(yàn)證明BBEZ235 阻斷PI3K/Akt/mTOR 信號通路對真皮纖維化有較好地抑制作用，這提示垂直抑制PI3K/Akt/mTOR 信號傳導(dǎo)通路可能對SSC 有治療潛力［27］。病毒感染被認(rèn)為是SSC 發(fā)生的一個共同因素［28］，雖然HPV 的作用到目前為止還沒有被評估，但一項(xiàng)SSC 婦女人乳頭狀瘤病毒感染的篩查顯示在SSC 組中多重HPV 感染的頻率是對照組的兩倍［29］。蛋白多糖可以通過其核心蛋白和糖胺聚糖與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、生長因子和趨化因子的多種相互作用，影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)動、黏附、生長和凋亡［30］。腫瘤發(fā)生過程中的細(xì)胞變化和酶活性可以改變蛋白多糖的組成和結(jié)構(gòu)，從而改變其功能，這可能與SSC 發(fā)病有相關(guān)性。關(guān)于黏著斑通路，一項(xiàng)研究表明增強(qiáng)的黏附信號與SSC 成纖維細(xì)胞的纖維化表型密切相關(guān)，阻斷黏附信號或ROS 的產(chǎn)生可能有利于控制SSC 中觀察到的纖維化［31］。Rap1 信號通路與血管發(fā)育和內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)的多個方面相關(guān)［32］，這與SSC 皮膚內(nèi)皮細(xì)胞變性有著密切聯(lián)系。哺乳動物MAPK 家族的三大類包括ERKs、c-jun 氨端或應(yīng)激激活蛋白激酶（JNK/SAPKs）和p38 激酶［33］，p38MAPK 信號通路在TGF-β 介導(dǎo)的人α2（I）膠原基因在正常皮膚成纖維細(xì)胞中的調(diào)節(jié)以及在SSC 成纖維細(xì)胞中I 型膠原和纖維連接蛋白的結(jié)構(gòu)性上調(diào)中起重要作用［34］。Bagnato 等［35］認(rèn)為miRNAs 在生物學(xué)上比僅是mRNA 穩(wěn)定性的內(nèi)源性調(diào)節(jié)器更復(fù)雜，而且也可能像細(xì)胞因子一樣提供炎癥信號，進(jìn)一步將miRNAs 的作用擴(kuò)展到參與纖維化疾病發(fā)病機(jī)制的免疫過程的直接調(diào)節(jié)器。

綜上所述，刺山柑治療SSC 可能是通過漢黃芩素、異鼠李素、山柰酚、槲皮素等多種化合物，作用于VEGFA、IL-22、TNF、PTGS2、MMP2、MMP9等蛋白靶點(diǎn)和PI3K-Akt 信號通路、蛋白聚糖與癌癥、粘著斑、Rap1 信號通路、MAPK 信號通路、癌癥中的microRNA 等通路產(chǎn)生效用。本研究為后續(xù)研究刺山柑治療SSC 提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐，但由于調(diào)用數(shù)據(jù)庫有限等客觀原因，可能存在誤差，課題組將會在未來繼續(xù)跟進(jìn)此項(xiàng)研究。