謝瑞彬，李 會，張 娟，于文杰，王 楠，高 潔，柳淑芳，陳愛亮,*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所，北京 100081；2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071）

河鲀，俗稱河豚魚，泛指硬骨魚綱（Osteichthyes）鲀形目（Tetraodontiformes）鲀科（Tetraodontidae）的魚類。鲀科魚類在世界各地廣泛分布且種類眾多，包括29 個屬200 個種，其中我國的記錄種有54 種，主要分布于四大海區(qū)及近海江河，是我國重要的魚類資源。經(jīng)濟價值較高的種類多為東方鲀屬（Takifugu），如紅鰭東方鲀（T. rubripes）、假晴東方鲀（T. pseudommus）、暗紋東方鲀（T. obscurus）、菊黃東方鲀（T. flavidus）、黃鰭東方鲀（T. xanthopterus）、蟲紋東方鲀（T. vermicularis）等。我國河鲀魚類年產(chǎn)量3×104～4×104t，約占世界河鲀總產(chǎn)量的70%[1]。

河鲀毒素（tetrodotoxin，TTX）系天然生物堿類神經(jīng)毒素，因最早從河鲀中分離而得名，是已知毒性最強的非蛋白類生物毒素之一，毒性為氰化鈉的1 250 倍，麻醉作用為可卡因的16萬 倍，毒性作用快，且尚無特效解毒劑，中毒者死亡率極高。部分河鲀體內(nèi)含有劇毒的TTX，最少僅需2 mg即可致死一位50 kg的成年人，因此其又被稱作鲀毒魚。

導致TTX中毒原因主要包括：部分消費者抱有僥幸心理，盲目嘗鮮引發(fā)中毒；含TTX的水產(chǎn)品同其他水產(chǎn)品混在一起被捕撈或撿拾，誤食導致中毒；個別生產(chǎn)經(jīng)營者未對食品原料進行嚴格篩選，導致含TTX的食品混入[2]。鲀毒魚中毒事件在全球均有發(fā)生，表1例舉了近20 年中國、日本、孟加拉國和泰國等國家及地區(qū)因誤食河鲀致死的案例。

表1 全球河鲀中毒事件舉例Table 1 Global cases of puffer fish poisoning

由于TTX致死率高、潛伏期短，且沒有解毒劑或特效藥[10]，目前只能通過洗胃、供氧等輔助手段救治中毒患者，因此，TTX的檢測、鲀毒魚的鑒定對于預防鲀毒魚中毒和及時救治十分重要。本文在梳理TTX性狀及中毒機理的基礎上，對關于鲀毒魚的檢測技術從兩部分進行綜述：一是針對鲀毒魚體內(nèi)TTX的檢測；二是針對鲀毒魚物種的鑒定，同時簡述了鲀毒魚檢測目前存在的問題，提出了未來鲀毒魚檢測技術的發(fā)展方向，以期能減少鲀毒魚引起的食物中毒事件。

1 河鲀毒素性質(zhì)及中毒機理

1.1 河鲀毒素的化學性質(zhì)與結構特征

TTX最早于1909年由日本科學家Yoshizumi Tahara在河鲀體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，并因此得名[11]。1950年Hirata Yoshimasa開發(fā)出純晶體毒素制備方法[11]。1964年Woodward發(fā)現(xiàn)TTX的化學結構為C11H17O8N3（分子質(zhì)量為319 Da），為籠狀極性分子[12]。TTX是一種劇毒的非蛋白神經(jīng)毒素，經(jīng)腹腔注射對小鼠的半數(shù)致死量為80 μg/kg[13]。

TTX純品為無臭無色的針狀晶體，易潮解，微溶于水，不溶于有機溶劑；對酸作用穩(wěn)定，在堿性溶液中易分解。TTX化學性質(zhì)非常穩(wěn)定，一般食物制備過程（如高溫烹飪、冷凍保藏、腌制或曝曬）均不能將其分解或破壞，即使唾液淀粉酶、胰蛋白酶、乳化酶和糖轉化酶等酶類也難以將其分解，只有在高溫加熱30 min以上或在堿性條件下其才能被分解。其衍生物為白色無定形酸性物質(zhì)，迄今已報道了40多個TTX的結構類似物[14]，這些類似物因缺乏商品標準物質(zhì)使其研究受到嚴重限制。

關于河鲀體內(nèi)毒素的起源眾說紛紜，目前最被接受的說法是河鲀自身分泌少量TTX，大量TTX則是通過海洋食物鏈進行生物積累的[15-18]。因此，不同個體、不同地區(qū)、不同季節(jié)河鲀體內(nèi)的毒素水平均有所差異，甚至同一個體、不同年齡的毒素含量也有所不同[19-21]，如在產(chǎn)卵季節(jié)，河豚肝臟中積累的毒素會轉移到卵巢中，使卵巢毒性增強[22]。

1.2 河鲀毒素的作用機理及中毒表現(xiàn)

TTX通過與鈉離子通道受體結合，阻斷具有電壓依賴性的鈉離子通道，從而阻滯動作電位，導致相關的生理活動受阻礙[23]。而TTX衍生物的毒性程度隨結構改變而變化，主要是每個類似物對鈉離子通道的親和力不同，受其結構中羥基數(shù)量和位置影響[24]，如11-酮化TTX的毒性比TTX高4～5 倍，而5-脫氧TTX、3-脫氧TTX、4-半胱氨酸TTX和脫水TTX的毒性很弱，可忽略不計，張曉春等[25]描述了4 種TTX中毒級別的癥狀（表2）。TTX中毒的程度取決于所攝入TTX的劑量、攝入TTX后的時間、體內(nèi)的水合狀態(tài)以及中毒前受害者的總體健康狀況。

2 河鲀毒素常用檢測方法

2.1 生物檢測技術

2.1.1 小鼠生物測定法

小鼠生物測定法是最早使用的、全世界公認的檢測食品中TTX毒性的標準方法[26]。該方法使用體質(zhì)量為20～22 g的健康雄性小鼠，腹腔注射不同濃度的TTX，記錄小鼠的死亡時間，死亡時間的倒數(shù)與TTX的劑量存在線性關系，從而實現(xiàn)定量。TTX的致死效率以“鼠單位”（mouse unit，MU）表示，1 MU指小鼠腹腔注射含TTX的提取劑后30 min內(nèi)殺死小鼠需要的最少毒素劑量[27-28]。

該方法操作簡單，不需要昂貴的儀器設備，但小鼠的死亡時間受飼養(yǎng)條件、小鼠的健康程度、TTX的溶劑等多種因素影響，因此重復性差、目標性差、靈敏度低，且不能對毒素進行準確定量，不適用于臨床上的尿液、血液樣本檢測；此外，該方法使用動物，在倫理上存在爭議。

2.1.2 免疫分析法

免疫分析是利用抗原抗體特異性結合原理來對靶標物質(zhì)進行快速檢測的一種分析方法。其中，最常見的是酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。1992年，Raybould等[29]在小鼠體內(nèi)誘導產(chǎn)生抗TTX的單克隆抗體，并使用堿性磷酸酶進行標記，通過酶標儀進行定量檢測。Gong Huizhi等[30]利用TTX單克隆抗體開發(fā)了一種間接免疫競爭模式的ELISA試劑盒，該方法檢出限可達40 μg/kg。除了ELISA，近年來發(fā)展的膠體金免疫層析技術集成了免疫分析的特異性、層析技術的簡便性以及納米金顏色變化等優(yōu)點，還具有簡單、方便、快捷以及便于現(xiàn)場應用等優(yōu)點，在醫(yī)療診斷、食品安全等領域受到廣泛應用?；诖思夹g， Li Yue等[31]開發(fā)了TTX膠體金免疫層析試紙條，實現(xiàn)了TTX可視化檢測，靈敏度達到10 μg/kg。

TTX抗體對TTX具有非常高的特異性，對其衍生物或其他毒素沒有交叉反應，從而使免疫分析具有很好的特異性[32]。除此之外，免疫分析還具有快速靈敏等優(yōu)點，可在2 h內(nèi)實現(xiàn)TTX的準確定量分析[33]。同時免疫分析樣品用量少，方便現(xiàn)場測定，目前已經(jīng)研發(fā)出了商品化的TTX ELISA試劑盒[34]。研究還發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體與TTX結合還能中和其毒性，減少中毒危害[35]。

2.1.3 表面等離子共振生物傳感器

表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）生物傳感器是基于芯片表面抗體識別TTX形成復合物過程中引起的界面折射率與一定波長的入射光在界面上形成的反射光衰減程度存在相關性，從而實現(xiàn)檢測的一種光學檢測儀器。由于TTX分子較小，在界面上發(fā)生的折射率變化較小，因此，SPR生物傳感器對TTX的分析通常需要采用相互抑制或競爭等形式來增加信號強度，如組裝抗TTX的SPR生物芯片[36]、納米顆粒標記[37-38]等。Yakes等[39]首次使用SPR生物傳感器直接檢測TTX，這種直接測定法能夠在3 min內(nèi)檢測到待檢樣品溶液中的TTX，檢出限約2 ng/mL。

基于抗體的SPR生物傳感器方法分析速度快、對毒素檢測的準確度較高，具有高靈敏度和特異性。生物試劑的使用少，無需放射性標記或實驗動物，可進行實時和無標記分析，已顯示出廣闊的應用潛力。將SPR生物傳感器結合最新的低噪聲檢測系統(tǒng)[39]，能夠降低系統(tǒng)中噪聲的同時，提高檢測的可重復性，使得直接檢測成為可能，但SPR生物傳感器需要的儀器成本較高，限制了其在現(xiàn)場檢測中的應用。

2.1.4 適配體檢測技術

核酸適配體是一種新型生物識別分子，通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）從單鏈寡核苷酸文庫中篩選出能夠和靶標分子特異性結合的單鏈DNA或RNA分子[40]。適配體又稱化學抗體，其親和力及特異性與抗體相似，但與抗體相比，具有穩(wěn)定性好、檢測方式多樣等優(yōu)點，近年來在醫(yī)療診斷、食品安全檢測中受到廣泛關注。

邵碧英等[41]采用SELEX與聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術制備了78 bp的單鏈DNA適配體，該適配體可與TTX特異性結合，用熒光染料法進行檢測，TTX的檢出限為10－6mol/L，檢測時間只需要10 min。Zhang Man等[42]在傳統(tǒng)方法的基礎上進行改進，將特異性結合TTX的適配體序列與磁珠結合，并使用能與適配體互補的DNA序列與TTX競爭結合位點，然后對游離的DNA片段進行擴增放大檢測信號，實現(xiàn)對TTX定量，檢測靈敏度高達0.05 ng/mL，檢測限低至0.265 pg/mL，回收率為99.67%～116.67%。

TTX適配體檢測技術不需要昂貴的設備和復雜的操作，成本低、速度快、靈敏度高、定量便捷，可用于血清樣品中TTX的檢測[43]，顯示出良好的應用前景。

2.2 理化分析技術

2.2.1 熒光分光光度法

熒光分光光度法是TTX的早期化學檢測方法，在TTX樣品中加入一定量的NaOH后，在較高溫度下（80～120 ℃）加熱，TTX及其類似物經(jīng)化學轉化為能發(fā)出熒光的2-氨基-6-羥甲基-8-羥基-喹唑啉（俗稱C9堿），然后測定其熒光強度[44]。

沈曉書等[45]在熒光分光光度法基礎上進行了改進，用水和異丙醇混合成的堿性溶液對TTX進行堿解，并在堿解過程中使用微波輔助，結果發(fā)現(xiàn)，此方法大大增強了熒光強度，使檢測限降低至0.05 μmol/L。

熒光分光光度法檢測TTX操作簡便、檢測時間短、靈敏度高，但由于毒性較小的TTX類似物也可轉化為C9堿，會導致假陽性，加大了檢測結果的不確定性。

2.2.2 色譜檢測法

近年來，為了精確定量TTX，色譜常被作為首選方法[3]。色譜法又稱色層法或層析法，其原理是利用TTX與其他組分同固定相和流動相之間作用力（分配系數(shù)、吸附能力、離子交換作用等）的差別，當固定相和流動相作相對移動時，各組分在兩相間進行多次平衡，最終實現(xiàn)相互分離。色譜法有多種，包括高效液相色譜法（highperformance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜法（gas chromatography，GC）、薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）。色譜法通常與其他分析方法聯(lián)用，從而實現(xiàn)對TTX及其類似物的定性及定量。

崔建洲等[46]將HPLC與紫外檢測器結合對河豚毒素進行檢測，其將河鲀魚肝臟用醋酸進行粗提取，然后經(jīng)過C18固相萃取柱，用乙醇-醋酸-水洗脫，使用紫外檢測器進行檢測。該方法的檢出限為20 μg/kg，回收率為87.7%～101.7%。

由于TTX自身不會發(fā)出熒光，因此，需要進行前處理才能利用熒光檢測器檢測。Dell’Aversano等[47]開發(fā)出一種由HPLC通過柱前氧化和熒光檢測確定TTX的方法。樣品在進柱前利用過氧化物進行氧化，接著以醋酸為流動相，C18反向柱為固定相進行梯度洗脫，最后根據(jù)保留時間、峰面積對樣品進行定性及定量。O’Leary等[48]則通過HPLC柱后衍生和熒光檢測進行分析，柱后衍生后使用熱濃縮的NaOH溶液將TTX轉換成C9堿來產(chǎn)生熒光信號強度，TTX最低檢出限為5 ng/mL。

色譜法是一種很好的分離手段，其定量能力強，但定性以及結構分析能力較弱，需要與其他檢測器結合使用。由于TTX不具有揮發(fā)性，采用GC檢測需將TTX轉化為易揮發(fā)的C9堿衍生物，延長了檢測時間。HPLC-紫外檢測靈敏度有限，與之相比，HPLC-熒光檢測對于TTX的檢測應用相對廣泛，但是TTX種類繁多，對熒光的響應強度相差較大，這在一定程度上限制了該方法的應用。

2.2.3 質(zhì)譜檢測法

質(zhì)譜法是通過將TTX及其類似物轉化為運動的氣態(tài)離子并按質(zhì)荷比（m/z）進行分離并記錄其信息的分析方法。根據(jù)質(zhì)譜圖提供的信息可以進行定性和定量分析以及TTX衍生物的結構分析等。

質(zhì)譜檢測將TTX或其類似物打碎成分子質(zhì)量不同的片段，其官能團及結合鍵的片段化模式已被廣泛研究，TTX的特征片段有m/z302（失去1 個水分子）、284（失去3 個水分子），并且在m/z256、178和162處產(chǎn)生特征片段。6-表TTX在m/z302、284、256、178和162處產(chǎn)生特征片段。4-表TTX、11-去甲基TTX-6-(S)-醇、4,9-脫水TTX、5-脫氧TTX和5,6,11-三羥基TTX具有共同的m/z162片段。11-去甲基TTX-6-(S)-醇和11-去甲基TTX-6,6-醇都具有m/z178的片段。5-脫氧TTX和11-脫氧TTX在m/z176處產(chǎn)生一個特征片段。5-脫氧TTX和5,6,11-三羥基TTX在m/z146處產(chǎn)生特征性片段。11-酮化TTX在m/z336、318（失去1 個水分子）、300（失去2 個水分子）、282（失去3 個水分子）以及m/z178和m/z162處產(chǎn)生特征片段。

質(zhì)譜法可以有效地定性分析化合物，但是對于混合物的分析卻無能為力，因此，常與具有分離作用的色譜分析法聯(lián)用。Bane等[49]使用LC-MS技術成功對TTX進行定量。樣品組織用醋酸提取TTX，然后注入C18柱，使用醋酸-甲醇溶液進行洗脫，洗脫液注入質(zhì)譜儀中電離成碎片離子，通過分析特征性碎片離子實現(xiàn)對TTX、11-去甲基TTX-6(S)-醇、11-脫氧TTX的分別定量。該方法的定量限為0.136 μg/g，檢出限為0.041 μg/g。

TTX也可以通過GC-MS進行分析，但由于TTX是強極性物質(zhì)，不能直接進行測定，需要額外的衍生化處理才能適用于GC。柳潔等[50]采用體積分數(shù)3%乙酸-甲醇溶液從樣品中提取TTX，使用Oasis MCX固相柱凈化，樣品液中加入3 mol/L KOH溶液和甲醇，二甲基甲酰胺將TTX轉化成C9堿，經(jīng)Oasis親水親脂平衡固相萃取柱凈化，再用硅烷化衍生劑衍生，質(zhì)譜檢測器進行定性、定量分析，定量限為5.0 ng/mL，檢出限為1.0 ng/mL。

質(zhì)譜法檢出限低、靈敏度高，能夠提供豐富的結構信息，解決了TTX及其衍生物的結構分析難題，定性分析結果可靠、用樣量少、分析范圍廣，幾乎可以檢測TTX所有的衍生物。LC-MS只需要簡單的樣品制備，并且與HPLC-熒光檢測和HPLC-紫外檢測相比，可提供更低的檢測限，是目前TTX分析的主流方法。當然質(zhì)譜法分析需要昂貴的大型儀器，其成本高、操作復雜，且需要專業(yè)人員操作。

2.2.4 核磁共振檢測法

核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）對TTX的檢測是通過強磁場對TTX進行輻射，TTX中的原子核自旋對射頻輻射進行吸收，發(fā)生核能級的躍遷，從而實現(xiàn)對TTX及其類似物成分、結構進行定性及定量分析。

Yotsu-Yamashita等[51]將色譜分離純化后的11-酮化TTX粉末用CD3COOD-D2O復溶，利用NMR儀對其進行分析，以600 MHz的頻率記錄1H NMR譜。根據(jù)頻率譜圖與11-酮化TTX標準品信號強度比較，將半純化的11-酮化TTX定量為約20 μg/g。1962年，定量NMR問世并應用于化合物的純度測定[52]，實現(xiàn)了不需要標準品即可定量的檢測。Watanabe等[53]經(jīng)過親水作用色譜柱分離后用二維NMR定量了半乳糖型TTX、內(nèi)酯型TTX、表位型TTX和脫水型TTX混合物，結果與串聯(lián)質(zhì)譜結果相符，證明了定量NMR技術還可用于TTX標準品的制備。

核磁共振檢測技術不會破壞TTX結構，能夠精確分析TTX及其衍生物的精細結構，但其缺乏分離功能，難以分析多組分混合物，且該方法提供原子水平上的信息量，靈敏度相對較低，定量誤差大，而且需要的樣品量大。

2.2.5 紅外光譜檢測法

用紅外光照射TTX時，TTX分子中的化學鍵或官能團可發(fā)生振動吸收，不同的化學鍵或官能團吸收頻率不同，在紅外光譜上處于不同位置，能夠通過已獲得的化學鍵或官能團信息對TTX進行定性或定量。

Hasan等[54]從河鲀肝臟中提取并純化得到TTX，利用紅外光照射，在3 405 cm－1（—OH特征峰）、1 623 cm－1（胍基特征峰）、1 559 cm－1（COO－特征峰）以及1 120 cm－1（C—O特征峰）處有吸收峰，在279 nm波長處也有TTX的特征峰。

紅外光譜技術檢測速度快、操作方便、重復性好、靈敏度高、試樣用量少、儀器結構簡單，能夠提供許多關于官能團的信息，有助于定性分析，但是樣品需要有足夠的吸光強度，且分離效果較好才能實現(xiàn)定量，對前處理過程要求較嚴，主要用于對標準品的純度分析。

2.2.6 TTX前處理技術

魚肉中基質(zhì)復雜、含有較多的干擾物質(zhì)，因此TTX檢測的效果往往和前處理有較大關系。目前，TTX檢測技術日益成熟，檢測耗費的時間越來越短，但前處理過程卻仍需要較長時間，成為了縮短整體檢測時間的“短板”[55]。目前，常用的TTX樣品前處理方法有液相提取與固相萃取，并輔以超聲波、加熱等手段[56]，從而實現(xiàn)對TTX的提取、純化和富集。以LC-MS聯(lián)用技術測定TTX的前處理為例，一般需采用乙酸-甲酯作為提取劑，通過漩渦振蕩、水浴使蛋白質(zhì)變性，采用超聲輔助提取TTX，重復兩次后，冷凍濃縮并使用磷酸鹽緩沖液稀釋，最后，稀釋液使用免疫親和柱和0.22 μm濾膜進行凈化[57]。液相色譜檢測對樣品純度要求較高，前處理步驟較多，用時達2 h以上，且需要較多儀器設備與有機試劑。

近年來，隨著樣品制備技術迅速發(fā)展，固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）技術作為一種最重要的新興技術得到了廣泛的認可與應用[58]。SPME技術是Authur等[59]在1990年提出的，該方法采用二氧化硅材質(zhì)的針狀纖維作為提取裝置，將固定相涂在表面，然后，提取裝置暴露在樣品中，通過涂層吸附目標物，最后將其置于檢測器中，從而將樣品的采集、提取、富集和進樣集于一體。

SPME技術如今已廣泛應用于多種領域研究的樣品制備，如環(huán)境分析[60]、食品檢測[61]、重金屬檢測[62]以及臨床醫(yī)藥試驗[63]，同時也逐漸被應用于TTX的檢測中。Chen Le等[64]將活的暗紋東方鲀麻醉后，把纖維萃取頭插入其背部肌肉維持45 min后，進行洗脫，即可完成TTX的采樣，與LC-MS/MS技術聯(lián)用，檢出限為2.3 ng/g，且具有較好的重現(xiàn)性和準確性。Tang Yijia等[65]在纖維萃取頭采樣的基礎上進行了改良，采用納米級材料制備纖維萃取頭，使用LC-MS/MS進行檢測，將采樣時間縮短到15 min，檢出限降低至0.52 ng/g。

與傳統(tǒng)液相萃取相比，SPME技術極大地簡化了前處理步驟，縮短了樣品處理時間，減少了化學試劑的使用，操作簡單，有利于現(xiàn)場實地采樣，且具有生物相容性，可實現(xiàn)活體采樣，通過對探針涂層以及探針的制備材料的摸索，可以提高選擇性與提取效率[66]。

TTX的各種檢測方法均有利弊（表3）。免疫檢測技術具有較高的靈敏度，被廣泛應用于樣本初篩，在TTX的快速檢測領域具有較好的發(fā)展空間，但需要昂貴的單克隆抗體。與ELISA方法相比，色譜法的成本較低。LC-MS是定性和定量測定TTX簡單、有效和靈敏的方法[14]，雖然LC-MS和GC-MS聯(lián)用技術都對設備、人員要求較高且需要使用有機溶劑，但是在定量檢測方面具有無法取代的地位，已經(jīng)用作TTX監(jiān)管監(jiān)測工具十多年，是分析TTX及其衍生物的成熟工具，對于分析TTX及其類似物非常穩(wěn)定[67]，是歐洲食品安全局建議的使用方法。

3 鲀毒魚物種鑒定方法

根據(jù)伍漢霖等[78]調(diào)查，我國共有35 種河鲀含有不同水平的TTX。最常引起食物中毒的是東方鲀屬（Takifugu）魚類[79]，該屬有26 個種，絕大多數(shù)東方鲀屬的魚肉中含有TTX，有的器官甚至含有劇毒劑量的毒素（表4）。在鲀毒魚體內(nèi)，肝臟組織全年都有毒[80]；而在河鲀產(chǎn)卵的季節(jié)（5—7月），雌性河鲀卵巢的毒性為全年最高[81]，這種差異被認為是雌性個體在繁殖季節(jié)時TTX向卵巢聚集以及卵巢也會排出毒素造成的，以保護機體及魚卵免受捕食者的侵害。然而，這種不同物種、不同器官甚至不同季節(jié)的TTX含量變化，導致毒素檢測技術受采樣部位的影響較大，如墨綠東方鲀肌肉無毒，肝臟有毒，雄魚的性腺無毒，但雌魚的性腺有劇毒（http://museum.ioz.ac.cn）。目前除了暗紋東方鲀和紅鰭東方鲀外，其他河鲀物種仍被禁止進入市場，若以TTX含量為判斷標準，則易發(fā)生假陰性檢測。發(fā)展鲀毒魚物種鑒定技術，即可避免發(fā)生假陰性的問題，而且物種鑒定不受采樣部位影響使是魚鰭、魚鱗，甚至是魚骨等組織，只要DNA未被降解，即可進行鑒定。

表4 東方鲀屬物種體內(nèi)TTX分布情況Table 4 TTX distribution in Takifugu

DNA作為生命的遺傳物質(zhì)，具有物種特異性，而且生物體內(nèi)各個組織、器官的DNA序列相同，不受取樣部位的影響。同時DNA具有一定的熱穩(wěn)定性，即使在烹飪后，使用DNA擴增技術仍可進行物種鑒定。對攜帶TTX的鲀毒魚類進行物種鑒定，既有利于市場監(jiān)管，能夠有效預防鲀毒魚引起的食物中毒事件，也能在中毒事件發(fā)生后及時采取正確的急救措施。

3.1 核苷酸測序法

確定物種的大多數(shù)遺傳方法都是基于利用保守引物通過PCR擴增線粒體DNA（mtDNA）或核DNA（nDNA）區(qū)域后，進行測序并與數(shù)據(jù)庫（GenBank）進行BLAST比對，從而實現(xiàn)物種鑒定。Bartlett等[82]首次提出法醫(yī)信息核苷酸測序技術，與BLAST分析相似，它涉及對擴增的DNA片段進行測序，利用系統(tǒng)發(fā)育分析對物種進行遺傳鑒定。

目前，最常用于脊椎動物物種鑒定的分子標記是線粒體基因（16S核糖體RNA（16S rRNA）、細胞色素b（cytochrome，Cyt b）和細胞色素氧化酶亞基I（cytochrome c oxidase subunit，COI）[83]基因）。線粒體Cyt b基因位點已在不同脊椎動物中得到了很好地表征[84]。研究發(fā)現(xiàn)，Cyt b在河鲀物種之間具有高突變率，因此，也常被用作河鲀間的物種鑒定標記[85]。然而，16S rRNA的高保存度使其不能成為河鲀種間鑒定的合適標記基因，COI基因雖然具有低序列變異性，但是其種內(nèi)變異少，種內(nèi)保守性較好，因此，適用于鲀毒魚的物種鑒定[86]，也是目前動物物種鑒定的DNA條形碼序列。沈青等[87]使用河鲀魚COI基因的通用引物對90 份樣品進行PCR擴增，并將測序結果與基因庫Blast比對，從而實現(xiàn)對鲀毒魚魚種的鑒定。

測序鑒定操作簡單，只需要簡單擴增即可進行測序，但是成本較高，需要復雜的設備，而且更耗時，難以實現(xiàn)高通量，對于摻雜多個物種的混合樣品而言會導致擴增產(chǎn)物不純，難以進行測序。

3.2 限制性片段長度多態(tài)性技術

限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RLFP）技術是利用限制性內(nèi)切酶能識別DNA分子的特異序列，并在特定序列處切開DNA分子，產(chǎn)生限制性片段的特性進行鑒定。對于不同種類的鲀毒魚而言，DNA序列存在至少一個或多酶切位點的差別，這樣就導致了用限制性內(nèi)切酶進行酶切時，產(chǎn)生不同長度、不同數(shù)量的限制性酶切片段。將這些片段通過電泳、轉膜、變性等技術分離，與標記過的探針進行雜交，即可分析其多態(tài)性結果。

Hsieh等[88]用10 種限制性內(nèi)切酶BsaJI、Hinf I、BsaI、SAPI、TaqI、EcoR V、SapI、EarI、StuI和BsrDI對16 種河鲀進行了分析，得到了不同的限制性內(nèi)切酶圖譜。通過限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性和序列分析獲得的多態(tài)性，準確鑒定出16 種河鲀的近緣物種。RFLP也可用于實際樣品的檢測，Hsieh等[89]利用RFLP分析從中國臺灣不同市場收集的60 種商業(yè)化干魚片制品，首先對魚肉樣品進行簡單PCR擴增，然后使用5 種限制性內(nèi)切酶BsaJ I、AciI、Hinf I、TaqI和SapI對PCR產(chǎn)物進行酶切，成功地在9 h內(nèi)檢測出60 種樣品中可能含有的17 種河鲀魚，并識別出兔頭鲀屬[90]。

RLFP操作簡單且反應時間短，獲得的多態(tài)性片段為準確識別河鲀物種提供了一套新的遺傳標記[91]。

3.3 熒光定量PCR

熒光定量（quantitative PCR，qPCR）技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對模板DNA進行相對定量分析的方法。

Jones等[92]采用基于TaqMan探針的qPCR方法，針對鲀科16S rDNA中的一個區(qū)域設計特異性較好的引物與探針，經(jīng)實驗證明能成功從105 種魚中鑒定出20 種河鲀魚，檢出限達1.75 pg。

qPCR具有較高的靈敏度與特異性，且操作簡單、耗時短，無需進行凝膠電泳，可實現(xiàn)相對定量，檢測范圍較廣，成為魚類物種鑒定的目前主流技術。本文整理了目前針對鲀毒魚開發(fā)的qPCR方法引物探針序列（表5）。

表5 鲀毒魚引物探針序列Table 5 Sequences of primers and probes used for qPCR for species identification of puffer fish

DNA條形碼技術、限制性內(nèi)切酶分析和qPCR都是鑒定物種的良好策略[96]。相較而言，測序方法昂貴且費時，還需要復雜的設備和操作；RFLP和qPCR方法具有快速、靈敏等優(yōu)點。qPCR方法操作尤為簡便，結合當前快速核酸提取方法以及高通量自動化提取檢測設備，已經(jīng)成為目前醫(yī)療診斷、食品安全檢測領域核酸檢測的主流方法[97]。當然，除了qPCR，還有更多的核酸檢測方法如環(huán)介導等溫擴增技術[98]、重組酶聚合酶擴增技術等已被用來進行魚類物種的鑒別。

4 結 語

鲀毒魚引起的中毒事件時有發(fā)生，對TTX進行精準檢測或鲀毒魚物種準確鑒定都是預防TTX中毒的重要措施。目前，比較常見的是河鲀毒素的檢測，在各類TTX檢測方法中，免疫層析技術更適用于TTX的快速半定量檢測，LC-MS法適用于TTX及其多種衍生物的同步定量檢測[99]。TTX的檢測能有效預防中毒事件的發(fā)生，而且可以在中毒事件發(fā)生后迅速判斷病因并及時采取有效的急救措施。但是由于河鲀體內(nèi)毒素含量不一致，采樣部位不同會影響檢測結果。此外，對于監(jiān)管部門來說，要禁止野生河豚在市場上流通，TTX檢測無法完全滿足需求，尤其是對于烤魚片、魚干等加工食品，魚體不完整，難以根據(jù)形態(tài)外觀識別出是否為鲀毒魚。因此，使用各個部位具有一致性的DNA作為檢測對象，對魚類產(chǎn)品進行物種鑒定，可以獲得更為準確可靠的判斷結果。目前已經(jīng)利用分子標記建立了各種序列分析的方法，能快速準確地實現(xiàn)物種鑒定。鲀毒魚物種鑒定的發(fā)展有利于鲀毒魚市場流通的監(jiān)管、簡化河鲀魚物種證書的鑒定手續(xù)、促進河鲀魚交易。

然而，目前對于鲀毒魚檢測方法的準確性、靈敏性、時效性等仍然存在諸多問題亟需解決：1）快檢方面，雖然已經(jīng)研發(fā)出TTX膠體金快速檢測卡，但其靈敏度偏低，無法準確定量，而其他方法無法實現(xiàn)現(xiàn)場快速鑒定；鲀毒魚物種鑒定方法包括RFLP和PCR技術等，也都無法實現(xiàn)現(xiàn)場快速鑒定，而對于鲀毒魚辨別或者中毒施救，現(xiàn)場快速鑒定具有重要的意義。2）TTX及其衍生物種類繁多，目前已知的有40多種，且結構相似，有很多尚無標準品，而標準品是保證準確定量、結果具有可比性的重要物質(zhì)基礎；3）雖然利用DNA條形碼測序技術可以對所有鲀毒魚的物種進行鑒定，但利用qPCR等快速方法開展的鲀毒魚鑒定種類研究還很少，亟需針對更多有毒物種開發(fā)快速鑒定方法。

為了解決上述問題，還需要開展多方面研究：1）需明確鲀毒魚毒素的產(chǎn)生機制及影響因素，掌握毒素與養(yǎng)殖環(huán)境、生長季節(jié)、生長周期、不同部位以及體內(nèi)環(huán)境微生物的關系，確定毒素的生成分布規(guī)律，為準確檢測和判定鲀毒魚毒性提供指導。2）研究TTX及其衍生物合成技術，克服難以分離或者分離量少的問題，并解決缺乏標準品導致的無法定量的困難。3）針對更多鲀毒魚物種進行毒性研究，確定不同物種與毒性的關系，并針對有毒物種開發(fā)物種鑒定方法，同時根據(jù)種屬毒性關系，分別開發(fā)屬通用或種特異的鲀毒魚快速鑒定方法。4）目前還缺乏TTX現(xiàn)場快速定量檢測方法，在現(xiàn)有膠體金檢測卡基礎上，開發(fā)基于熒光標記的檢測卡同時配套讀卡儀，可以實現(xiàn)鲀毒素的現(xiàn)場快速定量。針對鲀毒魚的物種快速鑒定，則可以采取環(huán)介導等溫擴增技術、重組酶聚合酶擴增技術結合微流控芯片等研發(fā)提取-擴增-檢測一體的鲀毒魚現(xiàn)場快速鑒定試劑盒。這些研究既能有效防止鲀毒魚流入市場，預防食品欺詐、標簽錯誤以及健康風險，保障人民生命財產(chǎn)安全，也能進一步推動河鲀市場的合法化發(fā)展，更好地開發(fā)及利用河鲀資源。