何書琪，童銘瑤，雷素珍，張 怡,2,*，曾紅亮,2,3,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.中愛國際合作食品物質(zhì)學(xué)與結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)研究中心，福建 福州 350002）

抗性淀粉（resistant starch，RS）作為一種新型膳食纖維，具有易獲取、低熱量、易飽腹、難消化、血糖生成指數(shù)低等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于代餐食品和保健食品中[1]。腸道微生物與宿主之間通過相互制約和相互依存形成復(fù)雜而健康的腸道微生態(tài)，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體健康[2]。在胃和小腸中難以消化的RS在到達(dá)結(jié)腸后被結(jié)腸中多種微生物利用從而產(chǎn)生短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs），并對(duì)人體健康有促進(jìn)作用，如減輕炎癥、降低結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)和改善腸道屏障功能[3]；此外，肝臟和腸道中產(chǎn)生的膽汁酸（bile acids，BAs）也被證明與腸道疾病及代謝性疾病有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，RS的結(jié)構(gòu)可以影響腸道微生物的增殖，改變腸道微生物組成進(jìn)而影響SCFAs和BAs等物質(zhì)的代謝，從而對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生影響；此外，利用菌群發(fā)酵RS可使淀粉結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的變化進(jìn)而影響腸道菌群組成和代謝物質(zhì)的生成[4-5]，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，RS可降低厚壁菌門與擬桿菌門豐度比值，增加雙歧桿菌屬、瘤胃球菌屬、擬桿菌屬等的相對(duì)豐度，從而促進(jìn)丙酸、乙酸等代謝物的產(chǎn)生，并在微生物群和代謝物的綜合作用下，共同提升RS的抗肥胖、緩解代謝綜合征和腸屏障功能。研究人員基于此構(gòu)建了“RS-腸道菌群-代謝產(chǎn)物”營養(yǎng)軸，系統(tǒng)地描繪RS、腸道菌群和代謝產(chǎn)物三者的關(guān)系（圖1），揭示RS調(diào)控腸道菌群介導(dǎo)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生從而改善機(jī)體健康的作用機(jī)制[6]。本文總結(jié)了RS調(diào)節(jié)腸道菌群影響代謝產(chǎn)物的相關(guān)機(jī)制及其對(duì)代謝性疾?。ㄈ绶逝?、高脂血癥和2型糖尿病等）的影響。

圖1 “RS-腸道菌群-代謝產(chǎn)物”營養(yǎng)軸示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the “resistant starch-intestinal florametabolite” nutrition axis

1 抗性淀粉與腸道微生物概述

淀粉是由天然的、豐富的、可再生的生物大分子組成，一般含有直鏈淀粉和支鏈淀粉。它作為食物的主要成分，對(duì)食物的營養(yǎng)、質(zhì)地和消化具有重要影響，在食品配料的封裝、組織工程材料、涂層等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[7]。由于部分淀粉在小腸內(nèi)無法被全部或部分消化吸收，因此，人們根據(jù)淀粉在小腸內(nèi)的生物可利用性將淀粉分為快速消化淀粉（ready digestible starch，RDS）、緩慢消化淀粉（slowly digestible starch，SDS）和抗消化淀粉。其中，抗消化淀粉又稱RS，是一種新型膳食纖維，被定義為“不能被健康人體小腸所消化吸收但能被大腸菌群利用的淀粉及其降解產(chǎn)物[8]”。RS在馬鈴薯、小麥、玉米、蓮子、大米、香蕉等食物中天然存在，可分為5 類：物理包埋淀粉（physically trapped starch，RS1）、未糊化的天然淀粉顆粒（resistant starch granules，RS2）、回生淀粉（retrograded starch，RS3）、化學(xué)改性淀粉（chemically modified starch，RS4）、淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物（starch-lipid complex，RS5）[9]。

腸道微生物組成主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形桿菌門[10]。RS可以被腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生SCFAs、乳酸、琥珀酸等代謝產(chǎn)物進(jìn)而發(fā)揮益生作用[11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物利用RS產(chǎn)生的酸和酶會(huì)侵蝕和水解淀粉顆粒結(jié)構(gòu)，使淀粉顆粒出現(xiàn)裂縫、孔洞、片狀等結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可以保護(hù)腸道有益菌從而促進(jìn)其增殖[12]。腸道微生物可以利用RS作為底物生產(chǎn)多種代謝物（包括SCFAs、乳酸等），而RS也會(huì)在發(fā)酵過程中影響微生物組成和腸道代謝物。SCFAs具有促進(jìn)機(jī)體健康的作用，如改善炎癥、維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)、提高免疫力[13]、降低患結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)和和改善腸道屏障功能等[14]；BAs分為初級(jí)BAs和次級(jí)BAs，對(duì)保持腸道菌群健康、平衡脂肪和碳水化合物代謝具有重要作用。腸道菌群可以通過影響B(tài)As代謝來調(diào)節(jié)BAs的結(jié)構(gòu)和數(shù)量，而BAs可以通過干擾腸道細(xì)菌膜的完整性來改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)和數(shù)量[15]；此外，有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群可以通過調(diào)節(jié)BAs從而改善大腸癌[16]、肥胖[17]、高脂血癥[18]、糖尿病[19]等疾病。

2 抗性淀粉對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

不可消化的碳水化合物（如RS等）可作為發(fā)酵底物被腸道菌群利用并誘導(dǎo)腸道發(fā)生各種變化[5]，如促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌（如擬桿菌、長雙歧桿菌[20]、梭狀芽孢桿菌、乳酸桿菌[10]等）的增殖和抑制有害菌（如腸球菌、大腸桿菌[21]等）的生長，起到調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的作用，從而預(yù)防腸道疾病、改善腸道健康及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等[8]，RS經(jīng)腸道菌群發(fā)酵后形成的粗糙結(jié)構(gòu)可保護(hù)腸道有益菌免受SCFAs分泌所造成腸道pH值下降的影響，同時(shí)酸化的腸道環(huán)境可抑制病原菌的生長（圖2）。因此可認(rèn)為結(jié)構(gòu)粗糙的RS有利于有益菌生長從而影響代謝產(chǎn)物及發(fā)揮益生作用。

圖2 腸道菌群利用淀粉破壞淀粉表觀結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 2 Schematic diagram of the destruction of starch apparent structure by intestinal microflora

不同類型的RS在腸道微生物發(fā)酵中會(huì)表現(xiàn)出不同調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的方式。如RS2有利于雙歧桿菌、瘤胃球菌、直腸真桿菌、擬桿菌和放線菌的生長；RS3能提高瘤胃球菌、直腸真桿菌、阿托普菌、雙歧桿菌和梭菌（IV、IX、XV、XVI、XVII）的豐度，但會(huì)抑制梭菌XIVa的生長；RS4能增加擬桿菌、放線菌的數(shù)量[22]。RS與腸道微生物組成的關(guān)系如表1所示。被腸道微生物發(fā)酵后的高粱RS表現(xiàn)出促進(jìn)乳酸桿菌和雙歧桿菌增殖和抑制大腸桿菌生長的結(jié)果，且該研究表明高粱RS可以改善大鼠因高脂飲食引起的脂質(zhì)代謝紊亂、肥胖和腸道菌群失調(diào)[23]。Zeng Hongliang等[24]對(duì)蓮子RS的研究發(fā)現(xiàn)，攝入中、高劑量的蓮子RS顯著促進(jìn)了乳酸桿菌、雙歧桿菌、瘤胃球菌和梭菌屬等淀粉利用菌及產(chǎn)丁酸菌的增殖，也提高了乙酸、丙酸、丁酸等SCFAs的產(chǎn)量，同時(shí)抑制了引起結(jié)腸炎等腸道疾病的理研菌科和紫單胞菌科的生長，因此改變了小鼠糞便細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)。玉米R(shí)S增加了厚壁菌門與擬桿菌門數(shù)量，促進(jìn)了雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖，同時(shí)抑制了大腸桿菌的生長，也促進(jìn)了SCFAs的生成[25]。因此，RS的攝入可調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)有益菌的增殖，抑制有害菌的生長。

許多研究證實(shí)了腸道有益菌的增殖與RS表觀結(jié)構(gòu)有關(guān)。項(xiàng)豐娟等[9]利用高直鏈玉米淀粉與棕櫚酸形成的復(fù)合物制備RS5，將RS5發(fā)酵液接種至人糞便中進(jìn)行體外發(fā)酵，并與RS2進(jìn)行比較。結(jié)果表明，RS5對(duì)雙歧桿菌、乳桿菌和擬桿菌的增殖效果較RS2更好，RS2對(duì)腸桿菌、腸球菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌的抑制效果較弱，而RS5對(duì)這3 種致病菌生長的抑制效果較強(qiáng)，這主要是因?yàn)镽S2具有較完整的淀粉顆粒結(jié)構(gòu)；因此乳桿菌和雙歧桿菌對(duì)其利用率低，而顆粒較粗糙的RS5能很好地保護(hù)有益菌并使其大量繁殖，且腸道微生物發(fā)酵RS5產(chǎn)生大量的有機(jī)酸造成發(fā)酵液pH值顯著降低，形成酸化的大腸環(huán)境，從而抑制了腸道有害菌的生長，而粗糙的RS5表面結(jié)構(gòu)很好地保護(hù)了有益菌，使其能夠抵抗低pH值環(huán)境。該結(jié)論與Zeng Hongliang等[24]的研究結(jié)果一致，其研究結(jié)果表明，體積分?jǐn)?shù)20%乙醇溶液沉降的蓮子RS顆粒表面較體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液沉降的蓮子RS粗糙，更能被微生物迅速利用，從而保護(hù)益生菌并促進(jìn)其增殖。綜上，顆粒粗糙程度高的RS可較好保護(hù)腸道有益菌抵抗酸化的腸道環(huán)境從而有利于其增殖并改變腸道微生物群落結(jié)構(gòu)。

表1 腸道菌群發(fā)酵淀粉后的代謝產(chǎn)物及微生物組成變化Table 1 Changes in metabolites and microbial composition after starch fermentation by intestinal microflora

3 菌群發(fā)酵后抗性淀粉的結(jié)構(gòu)變化

3.1 菌群發(fā)酵后抗性淀粉的表觀結(jié)構(gòu)

RS經(jīng)微生物發(fā)酵后，微生物產(chǎn)生的酸和酶等物質(zhì)會(huì)逐漸侵蝕顆粒，造成顆粒表觀結(jié)構(gòu)的破損，如顆粒斷裂、腐蝕、孔洞、顆粒尺寸變小等，從而促進(jìn)了酶與顆粒表明的結(jié)合，吸引更多微生物聚集并附著在顆粒周圍。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵造成淀粉顆粒破裂主要是歸因于微生物群中的優(yōu)勢(shì)菌群，如雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬、瘤胃球菌屬、普氏糞桿菌等淀粉利用菌和丁酸產(chǎn)生菌，研究人員將優(yōu)勢(shì)菌群單獨(dú)或混合發(fā)酵淀粉發(fā)現(xiàn)，其對(duì)淀粉顆粒的破壞程度均大于自然發(fā)酵，這主要是因?yàn)樽匀话l(fā)酵前期菌群豐度大，但起作用的優(yōu)勢(shì)菌種生長較慢，而將優(yōu)勢(shì)菌株單一或混合發(fā)酵，在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，產(chǎn)生的酸和酶不僅能破壞無定形區(qū)域，還能通過孔道水解內(nèi)部淀粉鏈[26-28]。因此，采用單一或混合優(yōu)勢(shì)菌屬發(fā)酵RS對(duì)淀粉表觀結(jié)構(gòu)造成的破壞程度強(qiáng)于自然發(fā)酵。

馬鈴薯、香蕉、蓮子、玉米等食物中天然存在RS[29]，這些RS顆粒在掃描電子顯微鏡下呈現(xiàn)出較光滑平整的表觀結(jié)構(gòu)，但在腸道菌群的發(fā)酵下，顆粒的表觀結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生侵蝕破壞，且單一菌、混合菌和自然發(fā)酵RS會(huì)造成淀粉顆粒表面不同程度的破壞。圖3為不同發(fā)酵方式的RS表觀結(jié)構(gòu)。Reyes等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，玉米淀粉（約含17.33%RS[30]，RS2）顆粒表面逐漸被侵蝕，并附著大量保加利亞乳桿菌，同時(shí)產(chǎn)生的淀粉酶和乳酸水解破壞淀粉顆粒結(jié)構(gòu)導(dǎo)致顆粒尺寸變小。Li Nannan等[28]將乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵大米淀粉（約含18%RS[31]，RS2），與自然發(fā)酵比較發(fā)現(xiàn)，單一乳酸菌發(fā)酵嚴(yán)重破壞大米淀粉顆粒，乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵發(fā)現(xiàn)表面破裂程度較單一菌發(fā)酵輕微，而自然發(fā)酵的淀粉顆粒表面基本保持平整。這與寇芳等[26]的研究結(jié)果相似，自然發(fā)酵前期對(duì)顆粒結(jié)構(gòu)造成主要破壞作用的優(yōu)勢(shì)菌屬生長緩慢，導(dǎo)致顆粒表面侵蝕破壞程度較輕。Zeng Hongliang等[24]利用雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌分別發(fā)酵體積分?jǐn)?shù)20%和30%乙醇溶液沉降的蓮子RS（lotus seed resistant starch，LRS3）24 h后在掃描電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與未發(fā)酵RS光滑完整的表面相比，發(fā)酵RS顆粒表面都呈現(xiàn)出更不規(guī)則且布滿裂痕和鱗片狀的結(jié)構(gòu)，且發(fā)酵后的淀粉顆粒更加粗糙和疏松。該結(jié)論與Xu Yihan等[32]的研究結(jié)果一致，植物乳桿菌CGMCC 14177發(fā)酵生馬鈴薯淀粉（約含4.44%RS[33]，RS2）后使其表面出現(xiàn)明顯小洞和凹陷，且培養(yǎng)基pH值持續(xù)下降。Zhao Tong等[34]將小麥淀粉進(jìn)行自然發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)發(fā)酵過程中，淀粉培養(yǎng)基pH值不斷下降，發(fā)酵淀粉顆粒表面出現(xiàn)斑點(diǎn)和裂痕，且隨著發(fā)酵的進(jìn)行，斑點(diǎn)逐漸變大，裂痕也更深，導(dǎo)致顆粒變形破裂，說明了淀粉顆粒在發(fā)酵過程中受到微生物及其代謝產(chǎn)物的侵蝕和破壞。因此可認(rèn)為，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，淀粉酶和有機(jī)酸不斷產(chǎn)生并破壞侵蝕淀粉顆粒結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致淀粉表觀結(jié)構(gòu)粗糙、疏松，出現(xiàn)孔洞、裂縫等。

3.2 菌群發(fā)酵后抗性淀粉的晶體結(jié)構(gòu)

目前，大量研究表明RS經(jīng)腸道微生物發(fā)酵后均未改變其晶體類型（表2），且由于微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酸或酶會(huì)先利用結(jié)構(gòu)并不致密的無定形區(qū)域，造成無定型結(jié)構(gòu)數(shù)量降低，結(jié)晶區(qū)的長支鏈淀粉被酸或酶水解成中間及短支鏈淀粉，從而使結(jié)晶度提高。但發(fā)酵到一段時(shí)間后，結(jié)晶度會(huì)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這主要是因?yàn)樵诎l(fā)酵初期無定形區(qū)域首先受到微生物發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的攻擊，從而使結(jié)晶度增加，但隨著無定形區(qū)域含量不斷減少，結(jié)晶度不斷增加，繼續(xù)發(fā)酵使顆粒結(jié)構(gòu)逐漸破壞，造成結(jié)晶區(qū)暴露在淀粉酶和酸的共同作用下，最終導(dǎo)致結(jié)晶度下降；此外，自然發(fā)酵的結(jié)晶度略高于單一菌發(fā)酵和混合菌發(fā)酵。

圖3 單一菌發(fā)酵、混合菌發(fā)酵和自然發(fā)酵后淀粉顆粒的表觀結(jié)構(gòu)Fig. 3 Apparent structure of starch granules after pure culture fermentation, mixed culture fermentation and natural fermentation by intestinal microflora

表2中保加利亞乳桿菌發(fā)酵的玉米淀粉（約含17.33%RS[30]，RS2），晶體類型不變，在15.12°、17.17°、18.05°和23.0°都出現(xiàn)了強(qiáng)度峰，且結(jié)晶度在發(fā)酵后由原來的（32.88±2.12）%增加到（37.32±0.96）%，說明發(fā)酵雖然沒有改變玉米淀粉的A型晶體結(jié)構(gòu)，但增加了結(jié)晶度，繼續(xù)發(fā)酵到24 h，結(jié)晶度降低到（37.32±0.96）%，說明發(fā)酵前期，酶先利用了無定形區(qū)域，造成結(jié)晶度增加，繼續(xù)發(fā)酵造成顆粒結(jié)構(gòu)逐漸破壞，結(jié)晶區(qū)暴露在淀粉酶和酸的共同作用下，最終導(dǎo)致結(jié)晶度下降[12]。植物乳桿菌發(fā)酵的生馬鈴薯淀粉（約含4.44%RS[33]，RS2）也表現(xiàn)出相似的結(jié)果[32]（表2）。有研究認(rèn)為這與無定形區(qū)結(jié)構(gòu)不致密、易受到酶的攻擊有關(guān)[24]。故單一菌發(fā)酵RS不足以改變其內(nèi)部晶體結(jié)構(gòu)，但發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶和酸容易先利用淀粉顆粒的無定形區(qū)域，導(dǎo)致結(jié)晶度改變。

在混合菌發(fā)酵RS的研究中，研究人員利用乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵大米淀粉（約含18% RS[31]，RS2），通過X射線衍射分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前后均呈現(xiàn)出A型和V型晶體特征，混合發(fā)酵使淀粉的結(jié)晶度降低（表2），這可能是由于A型淀粉晶體是由單斜晶胞構(gòu)成的，含有短程螺旋和螺旋間水分子，它們通過分子間和分子內(nèi)氫鍵結(jié)合在一起，因此菌株能有效破壞大米淀粉的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，從而破壞淀粉結(jié)晶，且該研究中自然發(fā)酵相較于混合發(fā)酵和單一菌發(fā)酵的結(jié)晶度更高[28]。高梁淀粉（約含22.21% RS[35]，RS2）和小麥淀粉（約含5.5% RS[36]，RS2）自然發(fā)酵期間，晶體類型不變，優(yōu)勢(shì)菌種代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸或酶水解破壞無定形區(qū)域，同時(shí)使結(jié)晶區(qū)外側(cè)底物短支鏈淀粉降解，使支鏈淀粉的短支鏈聚合度降低，結(jié)晶區(qū)相對(duì)比例增加，導(dǎo)致結(jié)晶度增加。小麥淀粉發(fā)酵期間，結(jié)晶度呈先增加后減小的循環(huán)規(guī)律，但總體是呈增加趨勢(shì)[29,34]。因此，淀粉顆粒在發(fā)酵期間，由于無定形區(qū)域受到酸或酶的利用，造成結(jié)非結(jié)晶區(qū)數(shù)量減少，結(jié)晶區(qū)數(shù)量增加，但發(fā)酵到一定時(shí)間后，結(jié)晶區(qū)暴露在酸和酶的共同作用下導(dǎo)致結(jié)晶度下降，但總體結(jié)晶度呈上升趨勢(shì)。

表2 淀粉的結(jié)晶類型與結(jié)晶度Table 2 Crystallization types and crystallinity of starch

3.3 菌群發(fā)酵后抗性淀粉的分子結(jié)構(gòu)

微生物在發(fā)酵淀粉后產(chǎn)生的酸和酶會(huì)利用淀粉顆粒的無定形區(qū)域，即非晶區(qū)（包括短程有序和長程無序區(qū)域），通過顆粒的孔道進(jìn)入內(nèi)部結(jié)構(gòu)，水解支鏈或直鏈淀粉鏈，形成小分子物質(zhì)，從而被微生物利用，且長支鏈淀粉也會(huì)被水解成短支鏈淀粉以及脫支的支鏈淀粉，從而造成重均、數(shù)均分子質(zhì)量發(fā)生變化，吸收峰減弱或部分消失。由于支鏈淀粉較直鏈淀粉更容易受到酸和酶的水解作用影響，且自然發(fā)酵初期優(yōu)勢(shì)菌種生長較緩慢，產(chǎn)酸和酶的作用較弱，故單一菌發(fā)酵和混合發(fā)酵降解直鏈淀粉的作用較自然發(fā)酵強(qiáng)。此外，發(fā)酵能減弱官能團(tuán)區(qū)吸收峰強(qiáng)度，但不改變峰位，指紋區(qū)的吸收峰也會(huì)減弱甚至消失，且單一菌發(fā)酵和混合發(fā)酵的吸收峰強(qiáng)度較自然發(fā)酵低，另外，微生物發(fā)酵還能增加淀粉分子的內(nèi)部有序程度和雙螺旋程度[24]。

不同菌群發(fā)酵RS后的分子結(jié)構(gòu)變化如表3所示。淀粉發(fā)酵后根據(jù)分子質(zhì)量可以分為I區(qū)（主要含支鏈淀粉）和II區(qū)（含大部分直鏈淀粉及少部分支鏈淀粉），多分散系數(shù)（重均相對(duì)分子質(zhì)量（Mw）/數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量（Mn））越接近于1，樣品的組分越單一，數(shù)值越大說明樣品的組分越復(fù)雜[27]?？芊嫉萚27]利用植物乳桿菌、釀酒酵母菌分別單一發(fā)酵小米淀粉（約含2.9% RS[37]，RS2），發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌發(fā)酵小米淀粉后，支鏈淀粉和直鏈淀粉被水解成小分子物質(zhì)并由微生物利用，從而導(dǎo)致Mw和Mn均降低，此外，I區(qū)的Mw/Mn增加，II區(qū)的Mw/Mn減少（表3），這是因?yàn)镮區(qū)的支鏈淀粉分子鏈發(fā)生水解、斷裂或脫支使分子鏈長短發(fā)生變化，導(dǎo)致組分變復(fù)雜，而II區(qū)的直鏈淀粉主要被水解成小分子物質(zhì)，組分變單一。有研究發(fā)現(xiàn)單一菌發(fā)酵后淀粉的Mw/Mn均小于自然發(fā)酵，且單一菌發(fā)酵和自然發(fā)酵的Mw/Mn均低于未發(fā)酵[38]。由此說明，發(fā)酵使淀粉組分變單一，且由于單一菌發(fā)酵能更快產(chǎn)生淀粉酶，使長支鏈淀粉及部分直鏈淀粉水解成小分子物質(zhì)，增加中間及短支鏈淀粉含量，從而改變淀粉組分。Zhao Tong等[34]對(duì)小麥淀粉（約含5.5%RS[36]，RS2）進(jìn)行自然發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，淀粉的Mw和直鏈淀粉含量均降低，這可能是因?yàn)樗岷兔傅墓餐饔脤?dǎo)致直鏈和支鏈淀粉的降解，存在于無定形區(qū)域的長支鏈淀粉則被水解成短支鏈淀粉。這與Batista等[39]的研究結(jié)果一致。此外，寇芳等[26]利用乳酸菌、酵母菌和芽孢菌混合發(fā)酵小米淀粉（約含2.9% RS[37]，RS2），結(jié)果表明混合發(fā)酵的I區(qū)Mw和Mn高于自然發(fā)酵，II區(qū)的Mw和Mn則低于自然發(fā)酵。其原因可能是自然發(fā)酵初期優(yōu)勢(shì)菌種生長緩慢，所產(chǎn)生的酶只能破壞無定型結(jié)構(gòu)，使直鏈淀粉水解，而混合發(fā)酵由于產(chǎn)酸和酶的作用較強(qiáng)，且不僅能破壞無定形區(qū)域，還能通過孔道水解結(jié)晶區(qū)外側(cè)的部分支鏈淀粉為短支鏈淀粉及小分子物質(zhì)；因此，混合發(fā)酵水解直鏈淀粉更多，導(dǎo)致I區(qū)Mw和Mn較大，II區(qū)Mw和Mn最小。

表3 淀粉的分子結(jié)構(gòu)特征Table 3 Molecular structural characteristics of starch after pure culture fermentation, mixed culture fermentation and natural fermentation by intestinal microflora

在傅里葉變換紅外光譜圖中有官能團(tuán)區(qū)（4 000～1 300 cm－1）和指紋區(qū)（1 300～400 cm－1），其中指紋區(qū)可表征淀粉分子短程有序結(jié)構(gòu)，當(dāng)指紋區(qū)圖譜部分消失時(shí)，表明淀粉顆粒的短程有序結(jié)構(gòu)遭到破壞[40]?？芊嫉萚40]利用乳酸菌單一發(fā)酵和自然發(fā)酵小米淀粉（約含2.9% RS[37]，RS2）的研究中發(fā)現(xiàn)，乳酸菌單一發(fā)酵后2 931 cm－1和2 062 cm－1處的C—H伸縮振動(dòng)峰以及1 648 cm－1處的C＝O振動(dòng)吸收峰位置沒有發(fā)生變化，說明單一乳酸菌發(fā)酵并不能改變官能團(tuán)區(qū)峰位，但減弱了吸收峰強(qiáng)度，而單一乳酸菌發(fā)酵后1 368.38～1 154.00 cm－1及527.54～438.01 cm－1處的吸收峰消失，自然發(fā)酵后1 368.38～1 154.00 cm－1處吸收峰強(qiáng)度減弱，且傅里葉變換紅外光譜圖中顯示單一乳酸菌發(fā)酵的吸收峰強(qiáng)度較自然發(fā)酵低，說明單一菌發(fā)酵產(chǎn)生的淀粉酶和有機(jī)酸會(huì)破壞淀粉顆粒表面和無定型結(jié)構(gòu)，并通過淀粉顆粒的孔道進(jìn)入淀粉內(nèi)部，逐漸水解淀粉，使化學(xué)鍵發(fā)生改變，最終導(dǎo)致淀粉短程有序結(jié)構(gòu)被破壞，指紋區(qū)圖譜部分消失，而自然發(fā)酵對(duì)淀粉顆粒的破壞程度弱，因此吸收峰減弱但并未消失。此外，Li Nannan等[28]利用乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌混合發(fā)酵小米淀粉（約含2.9% RS[37]，RS2），結(jié)果也表明自然發(fā)酵吸收峰強(qiáng)度高于混合發(fā)酵。

傅里葉變換紅外光譜圖中R1 047 cm－1/1 022 cm－1和R995 cm－1/1 022 cm－1分別用來描述RS的有序程度和雙螺旋程度[24]。Reyes[12]和Zeng Hongliang[24]等對(duì)單一菌發(fā)酵RS的研究結(jié)果一致，都表明在發(fā)酵過程中，隨著無定形區(qū)和亞晶區(qū)結(jié)構(gòu)數(shù)量的減少，RS的有序結(jié)構(gòu)和雙螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)量增加，說明不致密的無定形區(qū)域會(huì)首先被微生物產(chǎn)生的酶破壞。Zhao Tong等[34]對(duì)小麥淀粉（約含5.5% RS[36]，RS2）進(jìn)行自然發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，R1047cm－1/1022cm－1和R995 cm－1/1 022 cm－1均增加，說明發(fā)酵過程中產(chǎn)生的短鏈淀粉分子相互聚集形成有序的微晶，使分子有序度增加。

4 抗性淀粉與腸道短鏈脂肪酸互作的研究

由前述可知，腸道微生物可利用RS產(chǎn)生SCFAs、淀粉酶、氣體等物質(zhì)[41]，所產(chǎn)生的SCFAs和酶會(huì)破壞淀粉顆粒結(jié)構(gòu)，使其變得粗糙疏松，而這些粗糙的結(jié)構(gòu)以及RS可促進(jìn)腸道有益菌的增殖，從而產(chǎn)生大量的SCFAs[42]，且不同的優(yōu)勢(shì)菌群對(duì)SCFAs的產(chǎn)生影響不同。此外，不同腸道菌群可共培養(yǎng)從而顯著促進(jìn)SCFAs產(chǎn)生，其中，乳酸可作為微生物發(fā)酵的中間代謝產(chǎn)物為其他菌群生長提供能量，且乳酸、乙酸和丙酸可被腸道菌群協(xié)同發(fā)酵轉(zhuǎn)化為丁酸[22,43-44]。因此，RS可通過含量和結(jié)構(gòu)變化調(diào)節(jié)腸道菌群群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響SCFAs的產(chǎn)生，且腸道菌群之間的共生及SCFAs之間的轉(zhuǎn)化也會(huì)影響SCFAs含量和組成的變化，從而對(duì)機(jī)體代謝性疾病起到一定的改善作用。

4.1 RS調(diào)控腸道菌群介導(dǎo)SCFAs產(chǎn)生

乳酸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌等可利用RS產(chǎn)生SCFAs，被稱為淀粉利用菌，瘤胃球菌科、毛螺菌科、梭菌屬等不僅能利用RS產(chǎn)生SCFAs，同時(shí)還可以發(fā)酵乳酸和丙酸產(chǎn)生丁酸，因此被稱為丁酸產(chǎn)生菌[4]。腸道中最豐富的SCFAs是乙酸、丙酸、丁酸；其中，乙酸含量最高，其次是丙酸，丁酸含量最少[45]。由前述RS結(jié)構(gòu)與腸道菌群之間的關(guān)系可知，RS粗糙的顆粒結(jié)構(gòu)有利于腸道有益菌的增殖，且隨著小鼠攝入RS含量的增加，乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量也增加[46]，從而促進(jìn)了乙酸、丙酸和丁酸等SCFAs含量的增加[25]（表1）；因此，RS的攝入可促進(jìn)淀粉利用菌的增加從而使SCFAs含量增加。由此說明，RS的含量和結(jié)構(gòu)可影響腸道菌群群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響SCFAs的產(chǎn)生。

Lee等[47]對(duì)小鼠補(bǔ)充酶促修飾板栗淀粉后，發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬顯著增加，進(jìn)而促進(jìn)乙酸的產(chǎn)生。白永亮等[48]研究乳酸桿菌對(duì)香蕉RS（RS2）的發(fā)酵特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，香蕉RS可顯著增加乳酸桿菌的數(shù)量，說明香蕉RS有利于乳酸桿菌的增殖，且其可作為乳酸桿菌的碳源被利用。因此可推測(cè)，腸道菌群的種類可影響產(chǎn)生SCFAs的類型，即腸道優(yōu)勢(shì)菌屬，如雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、乳酸桿菌屬、瘤胃球菌屬、普氏糞桿菌等淀粉利用菌和丁酸產(chǎn)生菌會(huì)影響腸道SCFAs的組成，同時(shí)RS的種類也會(huì)影響腸道菌群群落的結(jié)構(gòu)，如結(jié)腸微生物中的布氏瘤胃球菌降解RS能力最強(qiáng)，尤其是對(duì)RS3，因其偏愛α-(1,4)-糖苷鍵連接的低聚糖[49]，此外，布氏瘤胃球菌主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙酸，與直腸桿菌共培養(yǎng)可協(xié)同促進(jìn)乙酸和丁酸產(chǎn)生[50]。楊玥熹等[44]研究外源腸道菌群發(fā)酵玉米R(shí)S對(duì)SCFAs產(chǎn)生的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在含RS2培養(yǎng)基中單一添加嗜酸乳桿菌后，乙酸含量顯著增加，而單一添加雙歧桿菌則顯著增加了丙酸、丁酸含量，當(dāng)混合添加嗜酸乳桿菌和青春雙歧桿菌時(shí)，產(chǎn)乙酸、丙酸和丁酸效果比單獨(dú)發(fā)酵好。Zeng Hongliang等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，隨著LRS3劑量的增加和處理時(shí)間的延長，乳酸和丙酸含量呈先增加后減少的趨勢(shì)（表1），且乳酸只能檢測(cè)到較低濃度，而丁酸產(chǎn)生菌和乳酸產(chǎn)生菌（雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌等）共培養(yǎng)時(shí)，乳酸產(chǎn)生菌可發(fā)酵碳水化合物底物產(chǎn)生乳酸、單糖等中間代謝產(chǎn)物，為丁酸產(chǎn)生菌提供能量，促進(jìn)其生長和丁酸產(chǎn)生[51]。因此，乳酸產(chǎn)量低可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵初期乳酸由直腸菌群（如雙歧桿菌、乳酸桿菌等）利用RS產(chǎn)生，并為其他菌群提供能量，供其生長繁殖，且在發(fā)酵后期還會(huì)被丁酸產(chǎn)生菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化為丁酸[52]。于卓騰等[53]也報(bào)道了部分產(chǎn)丁酸菌可利用丁酰輔酶A:乙酸輔酶A將乙酸作為碳源產(chǎn)生丁酸。由此可知，腸道菌群可共生促進(jìn)產(chǎn)酸，SCFAs的產(chǎn)生不僅受RS和菌群的影響，還與菌群共生和SCFAs互作有關(guān)。

4.2 RS通過SCFAs改善機(jī)體代謝性疾病

結(jié)腸中的微生物可發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生SCFAs，SCFAs可通過刺激L細(xì)胞上G蛋白偶聯(lián)游離脂肪酸受體2（free fatty acid receptor 2，F(xiàn)FAR2）來釋放胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1），從而增加飽腹感，減少食物攝入，起到抗肥胖作用，而丙酸具有最高的FFAR2親和力[54]，且丙酸可通過促進(jìn)脾臟或固有層T調(diào)節(jié)細(xì)胞的擴(kuò)增和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10的產(chǎn)生來改善膠原性關(guān)節(jié)炎病癥和減輕炎癥[55]。此外，SCFAs還可下調(diào)與脂肪形成有關(guān)的基因表達(dá)，增強(qiáng)與脂質(zhì)有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，從而起到改善非酒精性脂肪肝并控制肥胖[56]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥RS通過改善腸道菌群失調(diào)從而抑制炎癥，改善膽固醇水平升高和葡萄糖代謝異常[57]；馬鈴薯RS的攝入增加了雙歧桿菌、瘤胃球菌、擬桿菌、阿克曼菌的相對(duì)豐度，從而促進(jìn)了乙酸、丙酸和其他代謝物的產(chǎn)生，并在微生物群及其代謝物的共同作用下起到抗肥胖、緩解代謝綜合征和腸屏障的作用[6]。由此可知，RS可通過調(diào)控腸道菌群從而影響SCFAs的產(chǎn)生，起到改善機(jī)體代謝性疾病的作用。值得一提的是，糖尿病目前的發(fā)生率非常高，而普氏糞桿菌是一種典型的丁酸產(chǎn)生菌，可產(chǎn)生丁酸，且丁酸可作為一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，促進(jìn)β-細(xì)胞的分化、增殖和改善胰島素抵抗[58]。因此，對(duì)于糖尿病等代謝性疾病可通過增加患者腸道內(nèi)產(chǎn)丁酸菌等數(shù)量從而起到改善病情的作用。

5 抗性淀粉調(diào)節(jié)腸道菌群影響膽汁酸代謝的研究

許多研究表明，RS可結(jié)合BAs并將其從體內(nèi)排出，從而阻止BAs被重新吸收，而RS結(jié)合BAs的能力與RS表面粗糙程度、含量、顆粒的有序程度和雙螺旋結(jié)構(gòu)呈正相關(guān)[57,59-60]。高濃度BAs會(huì)破壞腸道有益菌膜的完整性，而RS由于自身粗糙的結(jié)構(gòu)可保護(hù)BAs利用菌，進(jìn)而提高這些細(xì)菌對(duì)BAs的耐受性[57]，此外，利用BAs的細(xì)菌還可通過分泌膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）使結(jié)合型BAs去結(jié)合后再經(jīng)脫羥生成次級(jí)BAs，并由RS包裹并排出體外，減少BAs的重吸收，促進(jìn)BAs代謝，減少血液中膽固醇含量[51]。因此，RS的含量和結(jié)構(gòu)不僅影響RS結(jié)合能力和BAs排泄，還可影響B(tài)As利用菌的增殖，進(jìn)而影響B(tài)As代謝。而BAs代謝發(fā)生在腸-肝軸中，因此，RS可通過調(diào)節(jié)腸道菌群改變BAs代謝，從而起到改善肥胖、肝病、糖尿病等代謝性疾病的作用。

5.1 BAs的合成與分類

BAs作為微生物發(fā)酵產(chǎn)生的一類重要代謝產(chǎn)物，是由肝臟中的膽固醇經(jīng)膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）的催化而成的一類小分子物質(zhì)，這些物質(zhì)被腸道微生物群進(jìn)一步代謝并激活腸道、肝臟和外周組織的受體，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體代謝過程（包括脂質(zhì)的消化、吸收和能量代謝等）[61]。初級(jí)BAs通過兩種途徑在肝臟中合成，一種是由CYP7A1催化的7α-羥基膽固醇引導(dǎo)的經(jīng)典途徑；另一種是膽固醇27α-羥化酶（CYP27A1）催化的替代途徑。如圖4所示，膽固醇在肝臟中分解成初級(jí)游離型BAs，主要包括膽酸（cholic acid，CA）和鵝去氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA），而嚙齒動(dòng)物則產(chǎn)生CA和鼠膽酸（muricholic acid，MCA），之后這些初級(jí)游離型BAs可與甘氨酸（glycine，G）和牛磺酸（taurine，T）結(jié)合成初級(jí)結(jié)合型BAs[59]，通過膽汁鹽輸出泵分泌到膽汁中，并儲(chǔ)存在膽囊[62]，直到人體進(jìn)食后再釋放到十二指腸中[63]，少量進(jìn)入腸腔中的BAs經(jīng)腸道菌群的BSH去結(jié)合形成游離的BAs，再經(jīng)脫羥形成次級(jí)BAs，包括脫氧膽酸（deoxycholic acid，DCA）、LCA等[61]，這一過程中，腸道菌群的細(xì)菌膜可能受到BAs的干擾，而RS的攝入可保護(hù)腸道有益菌免受BAs的破壞，并且RS還可包裹BAs并將其排出體外。大約95%的膽汁分泌的BAs是以結(jié)合BAs的形式在回腸末端通過鈉依賴BAs轉(zhuǎn)運(yùn)體被重吸收，經(jīng)門靜脈回到肝臟[59]。

圖4 BAs腸肝循環(huán)Fig. 4 Bile acid of intestinal liver circulation

5.2 RS調(diào)控腸道菌群影響B(tài)As代謝

RS在腸道中可與BAs結(jié)合，且隨RS含量及顆粒粗糙程度的增加，對(duì)BAs的結(jié)合能力也越高，從而包裹BAs將其排出體外，而RS的顆粒結(jié)構(gòu)可保護(hù)有益菌免受高濃度BAs的破壞，從而促進(jìn)利用BAs的有益菌增殖，進(jìn)而影響次級(jí)BAs代謝。

Aribas等[62]的研究表明，15%、20%和25%的RS均可與BAs結(jié)合并將其從體內(nèi)排泄，且結(jié)合能力隨RS含量增加而增加，與其他組相比，25%的RS使意大利面條具有較好的BAs結(jié)合能力，且能更好地促進(jìn)膽固醇分解成其他BAs從而降低血液膽固醇。Xu Jiangbin等[64]采用脈沖高壓滅菌引起淀粉糊化，導(dǎo)致RS含量、相對(duì)結(jié)晶度和雙螺旋結(jié)構(gòu)含量均顯著降低，淀粉顆粒聚集，顆粒表面積減少，從而限制了淀粉與BAs的結(jié)合。因此，淀粉顆粒有序結(jié)構(gòu)含量的減少使BAs結(jié)合能力降低。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)具有雙螺旋結(jié)構(gòu)的RS可以包裹BAs并將其排出體外，且BAs還可以通過RS表面的裂紋進(jìn)入淀粉內(nèi)部[59]。有研究發(fā)現(xiàn)，由于脫氧膽酸分子存在兩個(gè)羥基，因此可與天然豌豆RS中的羥基形成較強(qiáng)的相互作用從而結(jié)合，并隨糞便排出，使血液膽固醇含量降低[57]。由此可推測(cè)，RS可與BAs特異性結(jié)合，雙羥基BAs與RS的結(jié)合能力較高，且RS表面越粗糙、含量越高、有序結(jié)構(gòu)和雙螺旋結(jié)構(gòu)越多，RS與BAs結(jié)合能力越高，從而抑制BAs重吸收，增加糞便中的BAs排泄，減少血液膽固醇。

有研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌屬可以分泌BSH參與BAs代謝，阿克曼菌可以減輕小鼠肥胖，并參與次級(jí)BAs的合成[65]。Lei Suzhen等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，LRS促進(jìn)了可能利用BAs的乳桿菌增殖，并抑制了潛在有害細(xì)菌（如腸球菌和葡萄球菌）的生長，且在高濃度膽鹽條件下，LRS組的微生物多樣性增加，說明RS含量可促進(jìn)BAs利用菌的增殖。體積分?jǐn)?shù)20%乙醇溶液沉降的LRS3比體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液沉降的LRS3表面更粗糙，而較粗糙的表面有助于雙歧桿菌和乳桿菌黏附在淀粉表面，從而保護(hù)益生菌，提高其在高BAs濃度的不利環(huán)境中的耐受性[25]。Bang等[5]的研究表明，馬鈴薯淀粉（RS2）能夠促進(jìn)阿克曼菌、薩特氏菌、Turicibacter等的豐度增加，同時(shí)，腸道中T-LCA、G-LCA等次級(jí)BAs的數(shù)量也增加，硫酸化膽酸（cholic acid-sulfate，CA-S）、TCA、MCA等初級(jí)BAs的數(shù)量降低（表1）。因此認(rèn)為，RS能夠促進(jìn)BAs利用菌增殖，從而產(chǎn)生BSH，使結(jié)合型BAs去結(jié)合并轉(zhuǎn)化為次級(jí)BAs，這些次級(jí)BAs（如LCA）可被RS包裹排出體外，從而促進(jìn)BAs代謝和降低血液膽固醇。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群可能通過降低T-MCA的水平以及促進(jìn)回腸中法尼醇X受體依賴性成纖維細(xì)胞生長因子15的表達(dá)來抑制CYP7A1和BAs的合成[66]。因此，RS的含量和結(jié)構(gòu)可影響B(tài)As利用菌的增殖，進(jìn)而影響次級(jí)BAs的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)BAs的結(jié)構(gòu)和合成。

5.3 RS通過BAs改善機(jī)體代謝性疾病

大量研究表明，BAs可通過G蛋白偶聯(lián)BAs受體5或G蛋白偶聯(lián)受體119途徑增加L細(xì)胞環(huán)磷酸腺苷和激活蛋白激酶A，誘導(dǎo)GLP-1和多肽YY激素釋放，從而減少進(jìn)食量，延緩胃動(dòng)力，增加胰島素分泌[67]，改善糖尿病。此外，BAs可增加脂蛋白脂酶活性從而促進(jìn)血漿甘油三酯的清除，還可減少肝臟糖異生[68]。除此之外，BAs還可通過激活法尼醇X受體和固醇調(diào)節(jié)元素結(jié)合蛋白1c途徑調(diào)節(jié)脂肪生成，抑制極低密度脂蛋白的產(chǎn)生，從而改善非酒精性脂肪肝[69]。綜上所述，RS可通過含量和結(jié)構(gòu)的變化影響腸道菌群群落結(jié)構(gòu)，尤其是促進(jìn)利用BAs細(xì)菌的增殖，進(jìn)而改變BAs的代謝并起到改善機(jī)體健康的作用。因此，在改善機(jī)體代謝性疾病和腸道功能方面，利用RS改變腸道BAs譜是一種有效的方法。

6 結(jié) 語

近年來，人們對(duì)RS結(jié)構(gòu)及其發(fā)酵特性作了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)RS作為新型膳食纖維可以被腸道菌群利用進(jìn)而調(diào)控腸道代謝物發(fā)揮益生作用，且RS可以利用自身結(jié)構(gòu)特性促進(jìn)益生菌增殖并影響代謝產(chǎn)物。本文以“RS-腸道菌群-代謝產(chǎn)物”營養(yǎng)軸為基礎(chǔ)，從RS調(diào)控腸道菌群群落結(jié)構(gòu)、菌群發(fā)酵后RS顆粒結(jié)構(gòu)變化及RS介導(dǎo)SCFAs產(chǎn)生和BAs代謝4 個(gè)方面探討了RS調(diào)控腸道菌群介導(dǎo)代謝產(chǎn)物從而改善機(jī)體健康的作用機(jī)制，為飲食調(diào)控機(jī)體健康提供理論依據(jù)。

但目前關(guān)于“RS-腸道菌群-代謝產(chǎn)物”營養(yǎng)軸對(duì)腸道健康、代謝性疾病等的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。如RS-腸道菌群-BAs之間的分子機(jī)制、RS調(diào)控腸道菌群介導(dǎo)SCFAs轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制、RS介導(dǎo)BAs轉(zhuǎn)化的生化途徑等仍需進(jìn)一步探討。此外，RS在高血脂、高血糖、肥胖等代謝性疾病中與BAs、SCFAs相互作用的分子機(jī)制有待更深入的研究。