高平娉，任玉偉，楊鑫焱，楊 濤，王鄭輝，宋 楊，滿朝新，姜毓君

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

牛乳及乳制品作為膳食中鈣和優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來(lái)源，越來(lái)越受到人們青睞。而近年來(lái)全球爆發(fā)的“拉克塔利斯嬰兒配方奶粉沙門氏菌超標(biāo)”“三鹿奶粉”等質(zhì)量安全事件嚴(yán)重影響乳品行業(yè)發(fā)展，甚至引起社會(huì)恐慌。因此，現(xiàn)場(chǎng)快速監(jiān)測(cè)乳中致病因子，對(duì)保證乳品安全、促進(jìn)乳業(yè)發(fā)展以及維持社會(huì)穩(wěn)定具有重要意義。引發(fā)乳品安全問(wèn)題的因子主要分為大分子物質(zhì)（如病原微生物）和小分子物質(zhì)（如農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、真菌毒素、非法添加劑等[1]）。

病原微生物可用平板計(jì)數(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等方法測(cè)定，但是這些方法需要專業(yè)人員操作，無(wú)法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。采用氣/液相色譜、毛細(xì)管電泳、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法檢測(cè)乳中殘留抗生素、非法添加劑等小分子物質(zhì)具有良好重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性，但此類方法不能對(duì)未知待測(cè)物進(jìn)行定性分析，并且程序復(fù)雜、費(fèi)用高，對(duì)快速檢測(cè)意義不大。

側(cè)流免疫層析技術(shù)（lateral flow immunochromatographic assays，LFIA）是基于單克隆抗體技術(shù)、免疫標(biāo)記技術(shù)及免疫層析技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一種新型簡(jiǎn)化檢測(cè)技術(shù)，用于病原體、藥物和毒素等檢測(cè)。LFIA以條狀纖維層析材料為固相，借助毛細(xì)管吸附作用使樣品在層析材料上移動(dòng)，待測(cè)物與層析材料上一定區(qū)域的抗體結(jié)合，通過(guò)酶促顯色反應(yīng)或直接使用著色標(biāo)記物在短時(shí)間獲得直觀結(jié)果[2]。LFIA因簡(jiǎn)便、特異、快速，且不依賴于專業(yè)技術(shù)人員及昂貴儀器設(shè)備的優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于乳中各種致病因子檢測(cè)。而近年來(lái)，對(duì)多分析物進(jìn)行同時(shí)測(cè)定需求的不斷增加，推動(dòng)了高通量檢測(cè)的發(fā)展。本文結(jié)合乳中致病因子的檢測(cè)，論述LFIA的原理，闡述其不同的增敏方式，總結(jié)高通量檢測(cè)的不同模式，以期為乳品企業(yè)高靈敏、快速現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)提供理論支撐。

1 側(cè)流免疫層析技術(shù)的組成及檢測(cè)原理

LFIA又稱試紙條技術(shù)，20世紀(jì)80年代，試紙條開(kāi)始在臨床上用于檢測(cè)人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG），而后逐漸廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)控[3]、醫(yī)療診斷[4]、食品安全[5]等領(lǐng)域。如圖1所示，LFIA的樣品墊、共軛墊、吸收墊和硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜依附在有一定硬度的支架上，同時(shí)NC膜上固化檢測(cè)線（T線）和控制線（C線）。LFIA不需要外部支持設(shè)備或動(dòng)力，樣品隨著毛細(xì)管作用和吸水作用從樣品墊到達(dá)吸水墊，通過(guò)疏水鍵、靜電作用、氫鍵在NC膜沉積[6-7]。其中，C線顯色表示檢測(cè)有效，T線顯色指示陽(yáng)/陰性。LFIA的結(jié)果可通過(guò)視覺(jué)觀察或閱讀器進(jìn)行定性和半定量檢測(cè)。LFIA主要有競(jìng)爭(zhēng)法（圖1A）和夾心法（圖1B），一般使用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)如抗生素等僅有一個(gè)位點(diǎn)的小分子質(zhì)量物質(zhì)。競(jìng)爭(zhēng)法有兩種類型：其一是在T線上包埋待測(cè)抗原的抗體，在共軛墊固定待測(cè)抗原與標(biāo)記物的復(fù)合物，樣品墊上的待測(cè)抗原與共軛墊上的復(fù)合物共同競(jìng)爭(zhēng)T線上抗體的結(jié)合位點(diǎn)；其二是在T線偶聯(lián)待測(cè)抗原或其類似物，共軛墊為標(biāo)記物與待測(cè)抗原對(duì)應(yīng)抗體的偶聯(lián)物，當(dāng)有目標(biāo)物存在時(shí)，待測(cè)抗原與共軛墊的抗體偶聯(lián)，T線不顯色。競(jìng)爭(zhēng)法的響應(yīng)值與目標(biāo)物量成反比。

針對(duì)致病菌等表面具有多個(gè)抗原位點(diǎn)的生物大分子，一般采用夾心法進(jìn)行檢測(cè)，待測(cè)抗原的一個(gè)位點(diǎn)與共軛墊上的標(biāo)記抗體1結(jié)合，另一位點(diǎn)與T線上的抗體2結(jié)合形成抗體標(biāo)記物-待測(cè)抗原-抗體的三層夾心結(jié)構(gòu)并顯色，響應(yīng)值與目標(biāo)物含量成正比。

2 側(cè)流免疫層析技術(shù)增敏方式

膠體金納米顆粒（Au nanoparticles，AuNPs）具有良好的生物相容性和較高的摩爾吸光系數(shù)[8-9]，表面因等離子體共振呈現(xiàn)紅色[10]，因此成為L(zhǎng)FIA中應(yīng)用最廣泛的信號(hào)分子（表1）。但是傳統(tǒng)LFIA所用AuNPs粒徑一般為20～40 nm，信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)較弱，靈敏度較低[11]。為使LFIA更靈敏、準(zhǔn)確、適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，許多研究者致力于開(kāi)發(fā)高靈敏檢測(cè)方法，如顯色增強(qiáng)策略、采用新型納米材料增敏以及LFIA與其他技術(shù)聯(lián)用等。

2.1 顯色增強(qiáng)策略

2.1.1 納米顆粒生長(zhǎng)

研究表明，粒徑較大的AuNPs具有更高的摩爾吸光系數(shù)和吸光度[21]，因此在T線上積累大尺寸的AuNPs能夠有效提高LFIA的靈敏度。其中，金、銀生長(zhǎng)是最常用的增大粒徑的方法。該方法可將增強(qiáng)劑中的金/銀離子還原為金/銀聚積在AuNPs表面，最多可使其尺寸增加5 倍[22]，從而增強(qiáng)AuNPs吸光度，進(jìn)而增強(qiáng)LFIA靈敏度。1）Kaur等[23]于2007年首次提出通過(guò)金生長(zhǎng)的方法，利用AuNPs作為催化劑，加快金增強(qiáng)劑（HAuCl4和NH2OH·HCl）中Au3＋還原以增加AuNPs尺寸，從而提高靈敏度。這種方法需要通過(guò)洗滌減少非特異性結(jié)合，雖然可以有效地阻斷背景信號(hào)干擾，但是耗時(shí)長(zhǎng)。Wang Jingyun等[24]提出了一種簡(jiǎn)單的方法，在NC膜上添加金增強(qiáng)劑，當(dāng)金標(biāo)復(fù)合物經(jīng)過(guò)T線時(shí)直接將Au3＋還原，無(wú)需洗滌，對(duì)乳中大腸桿菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）的檢測(cè)靈敏度提高10 倍。2）在銀生長(zhǎng)中，銀鹽和還原劑發(fā)生反應(yīng)在AuNPs表面成核，隨后還原的金屬銀在AuNPs表面逐層沉積，以增大尺寸。與AuNPs呈現(xiàn)的紅色相比，生成黑色的金屬銀與NC膜的白色背景形成更強(qiáng)烈的對(duì)比。Horton等[25]于1991年首次報(bào)道使用銀增強(qiáng)劑將基于AuNPs的LFIA靈敏度從100 ng/mL提高到100 pg/mL。Shyu等[26]通過(guò)將LFIA浸入銀增強(qiáng)液中，使乳中葡萄球菌腸毒素B的靈敏度從100 ng/mL提高到10 pg/mL，且與SEA、SEC、SED、SEE等無(wú)交叉反應(yīng)。

但是，金或銀的生長(zhǎng)反應(yīng)并不可控，導(dǎo)致LFIA重復(fù)率差且易出現(xiàn)背景信號(hào)。因此，應(yīng)在T線區(qū)域采用可控制的生長(zhǎng)方法，以提高靈敏度、可重復(fù)性和可靠性。此外，Ag＋/Au3＋具有危險(xiǎn)性，會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定毒性作用。

2.1.2 納米顆粒積累

在LFIA中，T線累積AuNPs的數(shù)量達(dá)到肉眼識(shí)別的色度閾值[27]才能產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。然而AuNPs尺寸一般為20～40 nm，比色亮度較低[28-29]。因此，除金、銀生長(zhǎng)外，還可以通過(guò)積累AuNPs產(chǎn)生由單位分析物引起的可檢測(cè)紅色帶。AuNPs的積累可以使摩爾吸光系數(shù)增大，進(jìn)一步放大AuNPs的比色信號(hào)強(qiáng)度，增強(qiáng)策略包括雙AuNPs共軛、AuNPs聚集體。

利用一個(gè)（或多個(gè)）AuNPs作為檢測(cè)探針，另一個(gè)AuNPs作為放大探針，可以實(shí)現(xiàn)基于雙AuNPs共軛的信號(hào)增強(qiáng)。放大AuNPs探針可與檢測(cè)AuNPs探針特異性結(jié)合，通過(guò)多種分子識(shí)別元件（包括抗原-抗體反應(yīng)[30]，核酸雜交[31]和生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)[31]）被T線捕獲。隨著雙AuNPs探針的積累，AuNPs的比色信號(hào)強(qiáng)度放大，檢測(cè)靈敏度提高。Zhong Youhao等[14]通過(guò)用三聚氰胺抗體和牛血清白蛋白包被AuNPs表面來(lái)制備第一AuNPs-抗體復(fù)合物，通過(guò)將牛血清白蛋白抗體固定在AuNPs表面上獲得第二AuNPs-抗體復(fù)合物，將第一和第二復(fù)合物分別噴涂在兩個(gè)不同的結(jié)合物墊上，用于靶標(biāo)檢測(cè)和信號(hào)放大。結(jié)果表明，改進(jìn)LFIA可在10 min內(nèi)檢測(cè)到1.4×10－9mol/L乳中三聚氰胺，與沒(méi)有信號(hào)放大的LFIA相比提高了約100 倍。Pan Ruili等[32]將捕獲抗體-AuNPs復(fù)合物固定在T線上，將檢測(cè)抗體-AuNPs復(fù)合物固定在共軛墊上，通過(guò)在T線上形成檢測(cè)抗體-AuNPs-靶細(xì)菌-捕獲抗體-AuNPs的三層結(jié)構(gòu)積累AuNPs，放大信號(hào)。增強(qiáng)型LFIA比未增強(qiáng)型檢測(cè)靈敏度提高約100 倍。由于第二AuNPs結(jié)合取決于與第一AuNPs表面上的受體分子的分子間相互作用，因此，存在的位阻效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致第二AuNPs結(jié)合減少，這說(shuō)明需要進(jìn)一步優(yōu)化兩個(gè)AuNPs的粒徑進(jìn)而提高信號(hào)增強(qiáng)能力[33]。

AuNPs聚集體也可以在T線上積累AuNPs。通過(guò)多種分子自組裝技術(shù)制備交聯(lián)的AuNPs聚集體，或?qū)⒍鄠€(gè)AuNPs封裝到納米珠聚合物中，將復(fù)合物用作檢測(cè)探針。Li Yu等[34]首次通過(guò)使用蒸發(fā)誘導(dǎo)自組裝方法將許多小粒徑的AuNPs封裝到納米珠聚合物中合成342 nm的金超粒子（gold superparticle，GSP）。結(jié)果表明，此方法対牛奶中E. coliO157:H7 的檢出限（limit of detection，LOD）為6.0×102CFU/mL，與40 nm AuNPs相比，所得GSP的吸光度顯著提高，靈敏度提高了32 倍。

2.1.3 酶介導(dǎo)顯色信號(hào)增強(qiáng)

酶輔助信號(hào)放大也可以增強(qiáng)LFIA檢測(cè)靈敏度。例如辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）催化3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）生成的不溶性有色產(chǎn)物沉積[35]，增加AuNPs的信號(hào)強(qiáng)度，在T線上生成可見(jiàn)條帶。但是天然酶的催化活性依賴于自身蛋白質(zhì)構(gòu)象，易受溫度、pH值和離子強(qiáng)度等外部環(huán)境的影響，限制其在極端惡劣環(huán)境中廣泛應(yīng)用[36]。納米酶被定義為具有天然酶活性的納米材料[37-39]，比天然酶穩(wěn)定性高、成本低、易修飾、高效[40]。納米酶被廣泛用于模擬多種天然酶的催化活性，包括過(guò)氧化物酶，超氧化物氧化酶和過(guò)氧化氫酶等[39]。此外，新型有色納米材料由于其固有的過(guò)氧化物酶活性，也被用于增強(qiáng)LFIA靈敏度。

2.1.3.1 天然酶增強(qiáng)

在天然酶增強(qiáng)中，一般通過(guò)制備酶-信號(hào)分子雙標(biāo)記探針，信號(hào)分子用于物理吸附/化學(xué)偶聯(lián)綴合酶分子和生物識(shí)別元件的載體，酶發(fā)揮催化放大的作用。Cho等[41]在免疫磁珠上標(biāo)記HRP和單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）抗體，富集樣品置于LFIA，HRP催化T線的TMB生成有色物質(zhì)，2 h內(nèi)在牛奶中的檢測(cè)限為（97.0±19.5）CFU/mL。雖然天然酶的高催化活性能顯著提高LIFA的靈敏度，但是其環(huán)境耐受性差限制了長(zhǎng)期存儲(chǔ)和檢測(cè)性能。

2.1.3.2 納米酶增強(qiáng)

納米酶一般具有過(guò)氧化物酶樣活性，不僅能作為信號(hào)分子，也用于催化產(chǎn)生酶促信號(hào)。2007年，Gao Lizeng等[42]報(bào)道了第一個(gè)納米酶-Fe3O4納米顆粒（nanoparticles，NPs），它表現(xiàn)出固有的過(guò)氧化物酶活性，可作為HRP的替代物催化TMB、3,3’-二氨基聯(lián)苯胺和鄰苯二胺3 種底物并產(chǎn)生相應(yīng)有色產(chǎn)物。Zhang Li等[43]以Fe3O4為納米酶探針結(jié)合單疊丙酸丙啶（propidium monopropionate，PMA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop mediated isothermal amplification，LAMP），超靈敏檢測(cè)牛奶中的阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii），1 h內(nèi)嬰兒配方乳粉中E. sakazakii的LOD為10.0 CFU/mL。

2.1.3.3 復(fù)合納米酶增強(qiáng)

由于不同組分對(duì)催化性能的協(xié)同增強(qiáng)作用，雜化雙金屬NPs比直徑相近的單金屬納米材料具有更高的催化活性[44]。因此研究人員合成了很多新型核-殼雜化雙金屬NPs，例如Au@Pt NPs[45]、Au@Pd NPs[43]、Pd@Pt NPs[38]，用于提高LFIA靈敏度。Han Jiaojiao等[46]合成了Pd@Pt NPs作為納米酶探針，可以提供更多的催化活性位點(diǎn)。通過(guò)雙抗體夾心型LFIA檢測(cè)牛奶中的E. coliO157:H7，T線的比色信號(hào)強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，靈敏度低至9.0×102CFU/mL，比AuNPs-LFIA高出約兩個(gè)數(shù)量級(jí)。雖然納米酶能夠緩解天然酶的局限性，但是催化活性相對(duì)較低、底物特異性較差以及需要“裸露”或清潔的表面來(lái)保持較高的活性限制了其廣泛應(yīng)用。

通過(guò)金生長(zhǎng)[24]、雙金共軛[14]、復(fù)合納米酶介導(dǎo)[46]進(jìn)行顯色增強(qiáng)LFIA如圖2所示。

圖2 顯色增強(qiáng)型LFIAFig. 2 LFIA based on enhanced chromogenic reaction

2.2 新型納米標(biāo)記材料增敏

2.2.1 有色納米顆粒

有色NPs直徑在1～100 nm，具有比表面積大、光熱敏感、尺寸效應(yīng)小、易與抗體偶聯(lián)、穩(wěn)定性高、特異性好等特點(diǎn)，用于提高LFIA靈敏度[47]。表2總結(jié)了近年來(lái)用于乳中致病因子檢測(cè)的新型有色NPs，包括膠體AgNPs、膠體硒NPs（SNPs）、膠體鈀NPs（PdNPs）、Co3O4NPs，并將其靈敏度與AuNPs-LFIA進(jìn)行比較。

郭樹(shù)清是中國(guó)整體改革派理論的標(biāo)志性人物。近三十年的仕途生涯中，其在山東從2013年到2017年的四年執(zhí)政經(jīng)歷雖然占比不多，但具有重要意義。盤點(diǎn)郭樹(shù)清在山東的改革舉措，財(cái)稅、金融、三農(nóng)、國(guó)企、科技、教育、醫(yī)療、社保等領(lǐng)域改革都走在了全國(guó)前列，得到中央改革辦的充分肯定，一些經(jīng)驗(yàn)在全國(guó)推廣。中小學(xué)去行政化、科研院所改革、公立醫(yī)院綜合改革，這些很難短時(shí)間見(jiàn)到效果的改革難點(diǎn)，在山東都有了重大突破。

表2 有色NPs在LFIA中的應(yīng)用Table 2 Applications of new colored nanoparticles in LFIA

2.2.2 熒光納米材料

與比色法檢測(cè)相比，基于熒光的檢測(cè)使LFIA具有更高的信噪比，更高的靈敏度和更低的檢測(cè)限[52-53]。近年來(lái)，有機(jī)熒光染料（organic fluorescent dyes，OFDs）、鑭系元素螯合物、量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）、熒光微球（fluorescent microspheres，F(xiàn)Ms）、上轉(zhuǎn)換NPs（upconversion NPs，UCNPs）等新型材料相繼用于LFIA，實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測(cè)。各種熒光材料的優(yōu)缺點(diǎn)及檢測(cè)性能如表3所示。

表3 熒光納米材料在LFIA中的性能Table 3 Performance of fluorescent nanomaterials in LFIA

2.2.2.1 有機(jī)熒光染料

OFDs指具有熒光特性的物質(zhì)，分子質(zhì)量一般很小，且不易產(chǎn)生空間位阻。最常見(jiàn)的是異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC），它可吸收紫外線和藍(lán)光而變得活躍，同時(shí)發(fā)出黃綠色的可見(jiàn)光。如圖3A所示，Song Chunmei等[54]采用FITC標(biāo)記抗原和抗體，細(xì)菌在與標(biāo)記物孵育后可發(fā)出黃綠色熒光，此FITC-LFIA檢測(cè)乳中E. coliO157:H7比傳統(tǒng)的AuNPs-LFIA靈敏度高出10 倍。但FITC容易發(fā)生光漂白和熒光猝滅，有毒且生物相容性差，加之牛奶中某些氨基酸在一定波長(zhǎng)下會(huì)產(chǎn)生背景熒光造成干擾，將直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。

2.2.2.2 鑭系元素

鑭系元素（銪、釤和鏑等）又稱稀土元素，與普通熒光物質(zhì)相比，鑭系物會(huì)受到發(fā)光弱和光漂白限制，因此研究人員研制了以硅納米為殼，稀土元素為內(nèi)核的粒子，其具有以下優(yōu)點(diǎn)：熒光壽命長(zhǎng)，是普通物質(zhì)熒光的103～106倍，同時(shí)Stokes位移高達(dá)290 nm，是普通物質(zhì)熒光的幾十倍；激發(fā)光譜帶寬（300～500 nm），發(fā)射光譜帶極窄（小于10 nm）[61]。與使用光學(xué)濾波器的技術(shù)相比，它能夠通過(guò)波長(zhǎng)差異將熒光從背景光中分離出來(lái)，幾乎能消除所有背景熒光干擾，以提高熒光性能和檢測(cè)靈敏度[47]。Eu螯合物摻雜在硅NPs中已被廣泛用于時(shí)間分辨免疫熒光分析，Wang Quan等[55]將EuNPs偶聯(lián)E. coliO157:H7單克隆抗體用作熒光報(bào)告分子，如圖3B所示，15 min即可觀察到熒光，將牛奶樣品預(yù)富集6 h，靈敏度提高至1.0 CFU/mL。

2.2.2.3 量子點(diǎn)

QDs是粒徑在1～10 nm三維半導(dǎo)體熒光材料，一般為核殼型，具有較高的發(fā)光效率。與鑭系元素相同，QDs也具有光學(xué)穩(wěn)定性高、吸收譜寬、發(fā)射帶窄、Stokes位移大、不易光漂白和化學(xué)降解、生物相容性好和易修飾等優(yōu)勢(shì)，被稱為L(zhǎng)FIA中最有潛力的信號(hào)分子[62]，但QDs制備困難[63]。Chen Rui等[56]對(duì)乳中金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）進(jìn)行檢測(cè)（圖3C）并比較了QDs-LFIA和AuNPs-LFIA，檢測(cè)限分別為3.0 CFU/mL和30 CFU/mL。雖然QDs能在很大程度上提高靈敏度，但自身帶毒性，因此限制其廣泛應(yīng)用[64]

2.2.2.4 熒光微球

FMs是熒光物質(zhì)經(jīng)過(guò)化學(xué)鍵合、聚合包埋、自組裝等方式制備的納米材料。FMs內(nèi)部包裹大量的染料分子能發(fā)出高強(qiáng)度熒光，外部涂層能有效防止光漂白；同時(shí)FMs可以在表面修飾配體，通過(guò)靜電吸附、化學(xué)鍵合等方式偶聯(lián)生物識(shí)別分子[65]。Chen Rui等[57]首次將FMs作為信號(hào)分子和單克隆抗體偶聯(lián)檢測(cè)牛乳中的獸藥殘留磺胺甲嗪，檢測(cè)限為0.11 μg/L，比AuNPs高出約200 倍。

聚集誘導(dǎo)發(fā)射FMs（aggregation induced emission fluorescence microspheres，AIEFMs）材料能在致密的堆積狀態(tài)下表現(xiàn)出優(yōu)異的發(fā)光性能和良好的穩(wěn)定性，有研究表明AIEFMs的最大熒光強(qiáng)度和相對(duì)量子產(chǎn)率分別是傳統(tǒng)FMs的4.5、5 倍，與FM-LFIA相比，AIEFM-LFIA的靈敏度有所提高[66-67]。Hu Song等[68]建立了AIEFMs-LFIA并用于牛奶中諾氟沙星檢測(cè)（圖3D），LOD為0.04 ng/mL，線性范圍為0.05～20.00 ng/mL，與在磷酸鹽緩沖液中的范圍基本相同，說(shuō)明AIEFM基本沒(méi)有基質(zhì)效應(yīng)并且具有強(qiáng)穩(wěn)定性，非常適用于LFIA。

2.2.2.5 上轉(zhuǎn)換納米顆粒

與其他熒光標(biāo)記材料相比，UCNPs具有低毒性，其顯著的抗Stokes光致發(fā)光（photoluminescence，PL）特性能夠消除生物樣本中的背景熒光，提高目標(biāo)物質(zhì)的獲取率，表現(xiàn)出優(yōu)異的信噪比。此外，發(fā)射波長(zhǎng)的調(diào)控可以通過(guò)改變稀土離子種類而實(shí)現(xiàn)。這些特點(diǎn)彌補(bǔ)了有機(jī)染料和QDs的不足，使稀土摻雜上轉(zhuǎn)換熒光材料在生物熒光標(biāo)記、分析檢測(cè)、醫(yī)學(xué)成像等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力[69]。然而UCNPs發(fā)光效率低，且一般通過(guò)羧基偶聯(lián)抗體，具有抗體修飾不良等缺點(diǎn)。Huang Zhen等[58]制備了具有5 倍增強(qiáng)PL強(qiáng)度的納米級(jí)（80 nm）UCNPs，選擇葫蘆絲尿素作為UCNPs表面的配體交換試劑與1-金剛烷羧基修飾的抗體結(jié)合（圖3E），以維持UCNPs的高穩(wěn)定性且將PL強(qiáng)度再提高2 倍。利用此探針檢測(cè)乳中達(dá)氟沙星，比傳統(tǒng)基于羧基-氨基偶聯(lián)的LFIA靈敏度提高40 倍。該方法繼承了UCNPs出色的基質(zhì)耐受性，還提高了LFIA的靈敏度，降低了成本。

圖3 不同熒光信號(hào)分子增強(qiáng)型側(cè)流免疫層析Fig. 3 Enhanced LFIA based on different fluorescent signal molecules

2.2.3 染料摻雜納米顆粒

2.2.3.1 乳膠珠

乳膠珠（latex beads，LBs）又稱聚苯乙烯微球，成本低、易合成，可以通過(guò)在聚苯乙烯基質(zhì)或表面結(jié)合不同發(fā)色基團(tuán)制備各種彩色乳膠珠。與AuNPs不同的是，LBs通過(guò)表面修飾羧基與生物識(shí)別分子（如抗體）共價(jià)偶聯(lián)，使抗體具有較高的生物活性和穩(wěn)定性。Wang Cheng等[59]分別將LBs與AuNPs作為信號(hào)分子的LFIA檢測(cè)牛乳中抗生素殘留，結(jié)果表明，在偶聯(lián)相同數(shù)量單克隆抗體的前提下，LBs的靈敏度高于AuNPs約4 倍。然而彩色乳膠珠極易發(fā)生染料泄漏，影響其廣泛應(yīng)用。

2.2.3.2 彩色二氧化硅納米顆粒

彩色SiO2NPs由穩(wěn)定性良好的有機(jī)反應(yīng)性染料和改性SiO2NPs通過(guò)磺酸/碳酸-氨基硅烷鍵偶聯(lián)制成，其光學(xué)性質(zhì)取決于偶聯(lián)染料分子的顏色和數(shù)量。與LBs不同的是，彩色SiO2NPs呈剛性，不易發(fā)生染料泄漏，具有穩(wěn)定性強(qiáng)、親水性高、在溶液中分散性好且易與生物分子結(jié)合等優(yōu)點(diǎn)，在惡劣環(huán)境中不會(huì)褪色[70]。雖然染料摻入后會(huì)出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象，但與單個(gè)染料分子相比，熒光信號(hào)能大幅度提升。此外，SiO2NPs基體會(huì)產(chǎn)生有效的屏障，保護(hù)染料免受周圍環(huán)境（如氧水平、pH值和離子濃度）的影響，傳統(tǒng)染料的光漂白現(xiàn)象也被最小化。已有研究證明單分散的彩色SiO2NPs可作為免疫分析的信號(hào)分子，用于放大待測(cè)病原菌的響應(yīng)信號(hào)[71-74]。Zhu Chunjie等[60]首次將彩色SiO2NPs應(yīng)用于乳品中E. coliO157:H7的檢測(cè)，20 min即可完成檢測(cè)，靈敏度與AuNPs-LFIA相當(dāng)。

2.3 磁性納米顆粒增敏

磁性NPs（magnetic NPs，MNPs）由高分子材料包裹納米級(jí)Fe3O4制備，能在磁場(chǎng)中迅速聚集，撤去磁場(chǎng)后均勻分散。MNPs外層修飾的多種配體（羧基、巰基、鏈霉親和素等）可以與抗體、核酸等分子偶聯(lián)，富集目標(biāo)物質(zhì)且不影響活性。與熒光材料不同，MNPs可以有效地降低基質(zhì)效應(yīng)[75-76]，擴(kuò)大線性范圍，不易發(fā)生光漂白[77]。MNPs在LFIA中主要有以下作用。

2.3.1 富集

Qi Hui等[76]將MNPs偶聯(lián)抗體對(duì)乳中E. coliO157:H7進(jìn)行富集，以AuNPs為信號(hào)分子，富集前后LFIA的LOD分別為1.0×105CFU/mL和1.0×103CFU/mL，靈敏度提高2 倍。Chen Wenyao等[77]建立了一個(gè)集成級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的新型LFIA，如圖4A所示，用于對(duì)乳中E. coliO157:H7敏感和無(wú)鉤效應(yīng)檢測(cè)。該LFIA利用MNPs-E. coliO157:H7抗體復(fù)合物和AuNPs-E. coliO157:H7抗體-β-內(nèi)酰胺酶復(fù)合物捕獲靶細(xì)菌，形成夾層復(fù)合物；在夾層復(fù)合物上加入青霉素溶液，被β-內(nèi)酰胺酶水解，將水解物轉(zhuǎn)移至LFIA。該方法的靈敏度為1.37×102CFU/mL，較傳統(tǒng)方法提高1 000 倍，同時(shí)消除了鉤效應(yīng)和假陰性。

2.3.2 富集和信號(hào)放大

MNPs呈棕色，可以在T線聚集形成有色條帶。Huang Yanmei等[78]用MNPs富集黃曲霉毒素M1，并加至LFIA的樣品墊進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，此LFIA對(duì)原料奶中黃曲霉毒素M1的LOD為0.1 ng/mL，低于GB 2761—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》標(biāo)準(zhǔn)（0.5 ng/mL）。Yan Lingzhi等[79]制備了MNPs雙探針網(wǎng)絡(luò)復(fù)合物，如圖4B所示，檢測(cè)乳中呋喃唑酮，LOD、靈敏度分別為0.044 ng/mL和0.88 ng/mL，靈敏度比AuNPs-LFIA提高10 倍。上述研究將MNPs用于富集和比色，但是存在復(fù)雜的洗滌步驟。Huang Zhen等[80]制備了核-殼衛(wèi)星結(jié)構(gòu)熒光磁性納米管（fluorescent magnetic nanoparticles，F(xiàn)MNBs），并首次應(yīng)用于LFIA檢測(cè)乳中E. coliO157:H7，LOD為2.4×102CFU/mL。該方法無(wú)需多次洗滌，F(xiàn)MNBs表現(xiàn)出優(yōu)異的磁性和熒光性能。

2.3.3 富集、比色、熒光猝滅

MNPs具有較寬的吸收帶，可以抑制熒光。Fang Bolong等[81]將MNPs作為三功能材料，定量檢測(cè)乳中磺胺甲嘧啶，如圖4C所示，其功能一為富集目標(biāo)；其次是比色；其三是猝滅FITC熒光微球的熒光。熒光LFIA的線性范圍和LOD分別為0.033～33.000 ng/mL和0.026 ng/mL，比色LFIA的線性范圍和LOD分別為1～100 ng/mL和0.71 ng/mL。該方法可用于牛奶中磺胺甲嘧啶的高靈敏快速定量檢測(cè)，并且能消除內(nèi)部過(guò)濾干擾。但是MNPs因?yàn)檫w移率低會(huì)在經(jīng)過(guò)NC膜時(shí)沉積，影響T線顯色。

圖4 MNPs在LFIA中的不同作用Fig. 4 Different roles of MNPs in LFIA

2.4 側(cè)流免疫層析技術(shù)與其他技術(shù)聯(lián)用實(shí)現(xiàn)增敏

2.4.1 表面增強(qiáng)拉曼散射-側(cè)流免疫層析技術(shù)

表面增強(qiáng)拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）是一種表面敏感的檢測(cè)方法，可通過(guò)吸附在金屬表面的分子增強(qiáng)拉曼散射，增強(qiáng)因子高達(dá)1010～1011，這意味著基于SERS的LFIA可以檢測(cè)單個(gè)分子[82-84]。SERS-LFIA最重要的部分是拉曼標(biāo)記探針，拉曼信號(hào)分子（4-巰基苯甲酸（4-methylthiobenzoic acid，4-MBA）、2,4-二硝基硫氰基苯）和生物活性分子（抗體、適配體等）偶聯(lián)于NPs構(gòu)成，標(biāo)記探針會(huì)依據(jù)捕獲目標(biāo)物的數(shù)量產(chǎn)生相應(yīng)的拉曼信號(hào)，在很大程度上決定了SERS-LFIA的靈敏度，AuNPs仍然目前應(yīng)用最普遍的NPs。Li Yu等[85]創(chuàng)建了SERS-LFIA鑒定牛奶中的黏菌素，靈敏度提高了10～14 倍。Liu Haibin等[86]為了解決AuNPs-SERS-LFIA活性較弱的弊端，將拉曼分子4-MBA置于Au、Ag之間，制成AuMBA@Ag，利用Au和Ag間隙的強(qiáng)電磁場(chǎng)增強(qiáng)作用進(jìn)一步提高信號(hào)強(qiáng)度，并首次應(yīng)用于乳中E. coliO157:H7定量分析，靈敏度提高10 倍。

2.4.2 核酸擴(kuò)增-側(cè)流免疫層析技術(shù)

核酸擴(kuò)增-LFIA現(xiàn)已成為傳感器領(lǐng)域的流行趨勢(shì)，通過(guò)核酸擴(kuò)增獲得大量半保留復(fù)制鏈，實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)放大，比傳統(tǒng)方法更快速、準(zhǔn)確、靈敏和穩(wěn)定，推動(dòng)了乳品安全檢測(cè)的發(fā)展[86-88]，傳統(tǒng)的結(jié)合方式為變溫?cái)U(kuò)增PCRLFIA[89-90]，然而基于PCR的檢測(cè)技術(shù)具有儀器笨重、熱循環(huán)步驟耗時(shí)等局限性。隨著等溫?cái)U(kuò)增的發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了更多結(jié)合方式，如LAMP-LFIA[91-92]、重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）-LFIA[93-94]、耐熱解旋酶核酸等溫?cái)U(kuò)增（thermostable helicase nucleic acid isothermal amplification，THDA）-LFIA[95]等應(yīng)用于乳中致病因子檢測(cè)。Zhao Yueming等[91]將LAMP-LFIA用于檢測(cè)嬰兒配方乳粉中的沙門氏菌，LOD為2.2 CFU/g，靈敏度提高10 倍。Hu Jinqiang等[96]建立了RPA-LFIA檢測(cè)乳中E. coliO157:H7的新方法，LOD為4.4 CFU/mL。

2.4.3 適配體-側(cè)流免疫層析技術(shù)

適配體是一種新型的生物識(shí)別分子，其本質(zhì)是一段20～100 bp長(zhǎng)的單鏈DNA，可以通過(guò)折疊形成一定的構(gòu)象并與靶標(biāo)進(jìn)行特異性結(jié)合。適配體的篩選主要依賴指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，從體外合成的隨機(jī)文庫(kù)中經(jīng)過(guò)多輪篩選和指數(shù)富集得到。適配體被稱為“人工抗體”，與抗體相比，具有親和力高、制備方法簡(jiǎn)單、應(yīng)用范圍廣、穩(wěn)定性強(qiáng)、利于儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，越來(lái)越多研究?jī)A向于用適配體作為目標(biāo)物識(shí)別分子，實(shí)現(xiàn)高靈敏、穩(wěn)定檢測(cè)。Zhang Lisha等[97]利用Fe3O4NPs修飾適配體，特異性識(shí)別L. monocytogenes，該方法在5.4×103～1×108CFU/mL呈線性，LOD為5.4×103CFU /mL。

SERS/適配體-LFIA[98]、核酸擴(kuò)增-LFIA分別如圖5A、B所示。

圖5 SERS/適配體-LFIA（A）與核酸擴(kuò)增-LFIA（B）示意圖Fig. 5 Schematic diagram of surface enhanced Raman scattering/aptamer-LFIA (A) and nucleic acid amplification-LFIA (B)

2.4.4 智能手機(jī)-側(cè)流免疫層析技術(shù)

智能手機(jī)已經(jīng)成為日常生活的必需品。隨著其規(guī)格的改進(jìn)，大型隨機(jī)存取存儲(chǔ)器、高速中央處理器、高分辨率互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體（complementary metal oxide semiconductor，CMOS）傳感器和無(wú)線保真網(wǎng)絡(luò)等使智能手機(jī)成為與LFIA聯(lián)用進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的基礎(chǔ)[99]。并且智能手機(jī)可以拍攝并收集不同濃度樣本所呈現(xiàn)的顏色，利用特定的應(yīng)用程序及RGB、HSV和HSL等模型將顏色轉(zhuǎn)換成分析信號(hào)，解決抗體-抗原關(guān)系被轉(zhuǎn)導(dǎo)到NC膜產(chǎn)生的不確定性顏色變化問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)物質(zhì)的定量檢測(cè)。Cheng Nan等[100]以智能手機(jī)設(shè)備對(duì)LFIA結(jié)果進(jìn)行成像和記錄，檢測(cè)乳中腸炎沙門氏菌和E. coliO157:H7，LOD分別為20、34 CFU/mL。

3 高通量檢測(cè)模式

多分析物同時(shí)檢測(cè)可以提供豐富的樣品信息，提高分析效率、減少樣品體積、縮短分析時(shí)間和降低成本[101]。傳統(tǒng)的分析技術(shù)側(cè)重于單一的分析物，只能提供有限的樣本信息，其結(jié)果在某些情況下不夠準(zhǔn)確和可靠[102-104]，因此對(duì)單一樣品中多個(gè)分析物快速、同步檢測(cè)，已經(jīng)成為L(zhǎng)FIA的另一個(gè)發(fā)展方向。

3.1 多線型檢測(cè)

多線型檢測(cè)在傳統(tǒng)LFIA基礎(chǔ)上噴涂多條T線，實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)物質(zhì)檢測(cè)。Le Tao等[105]提出一種多線型LFIA用來(lái)同時(shí)檢測(cè)乳品中三聚氰胺和環(huán)丙嗪。該分析采用競(jìng)爭(zhēng)法，兩種物質(zhì)的LOD分別為0.22、0.26 ng/mL，與高效液相色譜法的檢測(cè)結(jié)果一致，證明了該方法在實(shí)際樣品中的實(shí)用性。Chen Yiqiang等[106]開(kāi)發(fā)了1 種同時(shí)檢測(cè)乳中的內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類的四元LFIA，如圖6A所示，制備了4 種待檢測(cè)物質(zhì)的特異性單克隆抗體和受體，形成4 個(gè)抗體/受體-AuNPs偶聯(lián)物作為檢測(cè)探針，四元免疫反應(yīng)同時(shí)發(fā)生在4 條T線上。與傳統(tǒng)LFIA相比，多T線設(shè)計(jì)減少了樣品量和生產(chǎn)成本。然而，T線數(shù)量受到條帶的空間、物理限制和Washburn理論[107]限制。此外，由于T線數(shù)量的增加，樣品通過(guò)多個(gè)檢測(cè)區(qū)時(shí)存在流量變化不確定性，設(shè)計(jì)的復(fù)雜性也隨之增加，還需要考慮不同分析物和各T線之間的相互干擾。

3.2 多條型檢測(cè)

如圖6B所示，多條型檢測(cè)一般呈“山”字型，能夠避免多線型檢測(cè)中，多線界面交叉反應(yīng)造成污染。Cheng Nan等[100]創(chuàng)建了多條型LFIA，分別用于檢測(cè)牛奶或冰淇淋中SalmonellaEnteritidis和E. coliO157:H7，LOD分別為20.0、34.0 CFU/mL，回收率為91.44%～117.00%。多條型LFIA是實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)最直接的方法，即將幾條常規(guī)條帶共享樣品墊，但是無(wú)法確保樣品溶液在每個(gè)條帶上均勻分布，而樣品量與靈敏度、準(zhǔn)確性密切相關(guān)；并且隨著待檢物質(zhì)的增多，耗費(fèi)的成本和樣品體積也增加。因此，如何精確地控制樣品溶液的均勻分布和節(jié)約成本，是進(jìn)一步推廣其應(yīng)用需要研究的問(wèn)題。

圖6 高通量檢測(cè)的兩種模式Fig. 6 Two modes of high-throughput detection

4 結(jié) 語(yǔ)

LFIA提供了一個(gè)簡(jiǎn)單、快速、高通量的生化分析方法，但是該方法在靈敏度、檢測(cè)限、高通量檢測(cè)方面仍然需要進(jìn)一步提升。本文從增敏和高通量檢測(cè)兩個(gè)方面論述了LFIA在乳品致病因子檢測(cè)的研究現(xiàn)狀。雖然這些方法能夠在很大程度上提高靈敏度，但是在實(shí)際應(yīng)用中還應(yīng)解決以下問(wèn)題：1）降低乳基質(zhì)干擾。在乳品安全分析中，LFIA的靈敏度主要受到標(biāo)記分子和乳基質(zhì)（如蛋白質(zhì)、脂肪）兩方面因素的影響。目前提出的增敏方式主要集中在增強(qiáng)標(biāo)記分子的光學(xué)性能，除了磁分離、樣品預(yù)濃縮以外，降低乳基質(zhì)干擾的方法少有報(bào)道?？梢詫FIA與微流控通道相結(jié)合，通過(guò)在通道中包埋相應(yīng)分子對(duì)干擾物質(zhì)進(jìn)行吸附以及分解，降低干擾。2）建立云數(shù)據(jù)平臺(tái)。LFIA的增敏方式非常多樣化，增敏效果也各有不同，但目前沒(méi)有統(tǒng)一的云平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)將這些數(shù)據(jù)收錄，也沒(méi)有衡量各種信號(hào)分子增敏倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范。3）設(shè)備小型化。諸如熒光、拉曼光譜等高靈敏度的檢測(cè)方法只能通過(guò)大型、昂貴的設(shè)備檢測(cè)?？梢詫FIA與微電子系統(tǒng)、光電光源等相結(jié)合，例如超小型大功率激光二極管、CMOS圖像傳感器等可以提供可見(jiàn)光和紅外光譜，使其能夠在現(xiàn)場(chǎng)條件和資源有限的環(huán)境下進(jìn)行使用。