何 歡,劉昭雪,張亞琳,張歡歡,蘆玉佳,朱 璇
(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052)
杏(Prunus armeniacaL.)屬薔薇科、李屬[1]。新疆是杏的重要起源地和栽培中心,擁有豐富的種質(zhì)資源[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì),新疆杏樹(shù)在2018年種植面積約為11.13萬(wàn) hm2,占全疆果樹(shù)種植面積的11.66%,杏果實(shí)產(chǎn)量約為93.3萬(wàn) t,占疆內(nèi)水果總量的9%[3]。杏是典型的呼吸躍變型果實(shí),在貯藏期極易腐爛[4]。雖然低溫貯藏可以有效控制杏果實(shí)的腐爛,但由于杏的冷敏特性,在冷藏期間易發(fā)生冷害,出現(xiàn)果皮水漬斑、果肉褐變及絮敗等冷害癥狀,嚴(yán)重影響可食性和商品價(jià)值,使低溫貯藏技術(shù)在杏果實(shí)的應(yīng)用上受到限制[5-6]。因此,研究采后杏果實(shí)的冷害機(jī)理、探索控制杏果實(shí)冷害的技術(shù)已成為其貯運(yùn)產(chǎn)業(yè)中亟需解決的問(wèn)題。
褪黑素,化學(xué)名稱(chēng)為N-乙酰-5-甲氧基色胺,是所有植物都具有的一種內(nèi)源吲哚胺類(lèi)化合物[7]。有關(guān)植物褪黑素的研究表明,其作為一種多功能的生物信號(hào)分子,參與植物生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟及衰老的生理調(diào)節(jié),在植物非生物脅迫過(guò)程中也起著重要作用[8-11]。近年來(lái),褪黑素在果蔬采后處理上的應(yīng)用越來(lái)越多。外源褪黑素在延緩草莓[12]、番茄[13]、櫻桃[14]果實(shí)的后熟衰老進(jìn)程,提高櫻桃番茄[15]、香蕉[16]等果實(shí)的抗病性,抑制荔枝[17]果實(shí)的褐變,增強(qiáng)黃瓜[18]、桃[19]果實(shí)抗冷性方面的顯著作用也被相繼報(bào)道。此外,褪黑素可通過(guò)誘導(dǎo)抗氧化酶、非酶抗氧化劑和與氧化蛋白修復(fù)相關(guān)的酶來(lái)消除采后果蔬中過(guò)多的活性氧(reactive oxygen species,ROS),保護(hù)果蔬免受氧化損傷[10]。Jannatizadeh[20]發(fā)現(xiàn)褪黑素減輕石榴果實(shí)冷害可能是因?yàn)槠淠軌蛱岣吖麑?shí)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxide,APX)活性,維持ROS平衡。基于這些發(fā)現(xiàn),推測(cè)褪黑素調(diào)控ROS穩(wěn)態(tài)可能對(duì)減輕采后果實(shí)冷害有積極的影響。
ROS代謝失調(diào)被認(rèn)為是導(dǎo)致冷害發(fā)生的機(jī)制之一[21],外源褪黑素處理是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)ROS代謝來(lái)增強(qiáng)采后杏果實(shí)抗冷性還鮮見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。本研究以‘賽買(mǎi)提’杏為實(shí)驗(yàn)材料,采用不同濃度的外源褪黑素對(duì)杏果實(shí)進(jìn)行減壓滲透處理。篩選出外源褪黑素增強(qiáng)杏果實(shí)抗冷性的最適濃度,并從ROS代謝的角度揭示褪黑素處理減輕杏果實(shí)冷害的作用機(jī)理。
本研究供試杏品種為‘賽買(mǎi)提’杏,于2019年6月19日采自新疆庫(kù)車(chē)縣烏恰鎮(zhèn)杏果園。采收時(shí)選取硬度(23.0±0.5)N、可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)13.5%~14.0%、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷、大小均一的果實(shí),采摘后于12 h之內(nèi)運(yùn)回新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬采后生理與貯運(yùn)實(shí)驗(yàn)室,于5 ℃下預(yù)冷24 h。
褪黑素(粉劑,純度≥98%) 上海源葉生物科技有限公司;鹽酸羥胺、對(duì)氨基苯磺酸、α-萘胺、丙酮、濃硫酸、四氯化鈦、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、氮藍(lán)四唑、核黃素、L-蛋氨酸、磷酸氫二鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純。
AL204-IC電子分析天平、FE22-Meter pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多儀器公司;UV-1700紫外分光光度計(jì) 上海美析儀器有限公司;DDS-307電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器有限公司;HB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;3H16RI高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司;DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠。
1.3.1 原料處理
采用濃度50、100、200 μmol/L的褪黑素溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.05%乙醇),每組處理用果15 kg。杏果實(shí)與褪黑素處理溶液的質(zhì)量比為1∶1,用減壓滲透[4]的方式處理杏果實(shí),將浸泡有杏果實(shí)的不同濃度褪黑素溶液抽氣減壓至0.05 MPa保持2 min,后恢復(fù)常壓繼續(xù)浸泡8 min,以蒸餾水處理作為對(duì)照組。處理后的果實(shí)在20 ℃環(huán)境下自然晾干,再置于冷庫(kù)低溫貯藏(溫度(0±1)℃、相對(duì)濕度90%~95%),貯藏期為49 d,每7 d進(jìn)行實(shí)驗(yàn)取樣及相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。
1.3.2 冷害發(fā)病率及冷害指數(shù)的測(cè)定
核果類(lèi)果實(shí)最初的冷害癥狀為果核周?chē)墓夂肿?,杏果?shí)冷害等級(jí)以果肉褐變面積來(lái)界定[22]:0級(jí),無(wú)褐變;1級(jí),褐變面積比例0~5%;2級(jí),褐變面積比例5%~25%;3級(jí),褐變面積比例25%~50%;4級(jí),褐變面積比例大于50%。冷害指數(shù)按式(1)計(jì)算。
以單個(gè)果實(shí)出現(xiàn)冷害等級(jí)達(dá)1級(jí)以上計(jì)為發(fā)病果,每個(gè)處理觀察20 個(gè)杏果實(shí),統(tǒng)計(jì)發(fā)病個(gè)數(shù)占總果數(shù)的比例,即為冷害發(fā)病率。
1.3.3 丙二醛含量的測(cè)定
丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的測(cè)定參照Carvajal等[23]的方法,并稍作修改。取2 g果實(shí)樣品加入5 mL預(yù)冷的5 g/100 mL三氯乙酸溶液,離心后將上清液和硫代巴比妥酸混合,并在沸水浴中反應(yīng)20 min,分別于420、532、600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液的OD值。MDA含量單位為nmol/L。
1.3.4 細(xì)胞膜滲透率的測(cè)定
細(xì)胞膜滲透率的測(cè)定參照Mao Lichun等[24]的方法,稍作修改。從10 個(gè)果實(shí)的赤道部分切下20 個(gè)圓片(直徑5 mm),放入燒杯中,加入20 mL去離子水。搖動(dòng)后立即用電導(dǎo)率儀測(cè)定果實(shí)的電導(dǎo)率(ρ0/(μS/cm)),30 min后,煮沸5 min后測(cè)定電導(dǎo)率(ρ1/(μS/cm)),冷卻后再次測(cè)定為(ρ2/(μS/cm))。細(xì)胞膜滲透率按公式(2)計(jì)算。
1.3.5 超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率的測(cè)定
1.3.6 H2O2含量的測(cè)定
H2O2含量的測(cè)定參照Shadmani等[26]的方法,稍作修改。取2 g果實(shí)樣品于反應(yīng)液(含丙酮、濃氨水、四氯化鈦)中,離心后,將沉淀溶于濃硫酸,在410 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。H2O2含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算,單位為nmol/g,結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。
1.3.7 SOD、CAT、POD活力的測(cè)定
SOD活力的測(cè)定參照Wayne等[27]的方法,通過(guò)抑制硝基藍(lán)四唑(tetranitroblue tetrazolium chloride,NBT)光化學(xué)還原的能力來(lái)分析其活力,以每克鮮質(zhì)量果實(shí)樣品每分鐘的反應(yīng)體系NBT被光還原50%為1 個(gè)SOD活力單位(U)。
CAT活力測(cè)定參照Shadmani等[26]的方法,以每克鮮質(zhì)量果實(shí)樣品每分鐘引起反應(yīng)體系在240 nm波長(zhǎng)處吸光度增加0.01為1 個(gè)CAT活力單位(U)。
過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)活力的測(cè)定參照曹建康等[28]的方法,以每克鮮果實(shí)樣品每分鐘吸光度增加0.01為1 個(gè)POD活力單位(U)。
以上酶活力單位均為U/g。
每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)平行,使用Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 8.5軟件制圖,采用SPSS 26.0軟件差異顯著性分析(最小顯著性差異檢驗(yàn))和皮爾遜相關(guān)性分析。
由圖1可知,在貯藏前期,各處理組均未發(fā)生冷害,之后各組杏果實(shí)的冷害發(fā)病率都隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升的趨勢(shì)。28 d時(shí),對(duì)照組和50 μmol/L褪黑素處理的杏果實(shí)開(kāi)始出現(xiàn)冷害,100、200 μmol/L褪黑素處理的杏果實(shí)在35 d開(kāi)始發(fā)生冷害。3 個(gè)濃度褪黑素處理組杏果實(shí)冷害發(fā)病率在發(fā)生冷害的整個(gè)貯藏過(guò)程中都顯著低于同期對(duì)照組(P<0.05)。50、100、200 μmol/L褪黑素處理組在貯藏結(jié)束時(shí)的冷害發(fā)病率分別比對(duì)照組降低了15.38%、53.85%和33.33%。結(jié)果表明,褪黑素處理可以推遲杏果實(shí)冷害的發(fā)生時(shí)間,且能顯著降低冷害發(fā)病率,100 μmol/L褪黑素處理降低冷害發(fā)病率的效果最佳。
圖1 褪黑素處理對(duì)冷藏杏果實(shí)冷害發(fā)病率的影響Fig. 1 Effect of exogenous melatonin on the incidence of chilling injury in apricot fruit during cold storage
如圖2所示,發(fā)生冷害后,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),杏果實(shí)冷害指數(shù)不斷增加,但3 個(gè)濃度褪黑素處理組的冷害指數(shù)顯著低于同期對(duì)照組(P<0.05)。50、100、200 μmol/L褪黑素處理組在貯藏末期的冷害指數(shù)分別比對(duì)照組低33.06%、53.34%和45.80%。結(jié)果表明外源褪黑素處理杏果實(shí)可以抑制冷害指數(shù)的上升,以100 μmol/L褪黑素處理效果最優(yōu)。
通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出,100 μmol/L褪黑素減輕杏果實(shí)冷害作用的效果最佳。因此,在后續(xù)研究中選取100 μmol/L褪黑素處理的杏果實(shí),探討外源褪黑素處理對(duì)采后杏果實(shí)冷害和ROS代謝的影響。
圖2 褪黑素處理對(duì)冷藏杏果實(shí)冷害指數(shù)的影響Fig. 2 Effect of exogenous melatonin on the chill injury index of apricot fruit during cold storage
MDA含量可作為判斷膜脂過(guò)氧化程度的一個(gè)主要指標(biāo)。如圖3所示,杏果實(shí)的MDA含量隨貯藏期的延長(zhǎng)而持續(xù)增加。在整個(gè)貯藏期,褪黑素處理的杏果實(shí)MDA含量上升速度顯著低于同期對(duì)照組(P<0.05)。在貯藏49 d時(shí),對(duì)照組和褪黑素處理組的MDA含量分別為采收當(dāng)天的1.57 倍和0.75 倍,褪黑素處理組杏果實(shí)的MDA含量比對(duì)照組低46.44%(P<0.05)。說(shuō)明褪黑素處理可明顯抑制杏果實(shí)貯藏期MDA含量上升。
圖3 褪黑素處理對(duì)冷藏杏果實(shí)MDA含量的影響Fig. 3 Effect of exogenous melatonin on MDA content of apricot fruit during cold storage
在低溫逆境下,果蔬的膜相由液晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài),導(dǎo)致膜透性增加,膜內(nèi)電解質(zhì)外滲,所以細(xì)胞膜滲透率是判斷冷害傷害程度的最直接指標(biāo)。由圖4可知,杏果實(shí)的細(xì)胞膜滲透率隨貯藏期的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。在整個(gè)貯藏期,褪黑素處理杏果實(shí)的細(xì)胞膜滲透率均顯著低于同期對(duì)照組(P<0.05)。杏果實(shí)貯藏初期的細(xì)胞膜滲透率為15.71%,在貯藏49 d時(shí),對(duì)照組和褪黑素處理組果實(shí)的細(xì)胞膜滲透率分別上升到70.10%和44.62%,其中對(duì)照組杏果實(shí)的細(xì)胞膜滲透率是褪黑素處理組的1.57 倍(P<0.05)。結(jié)果表明褪黑素能有效抑制杏果實(shí)冷藏期間細(xì)胞膜滲透性的增加。
圖4 褪黑素處理對(duì)杏果實(shí)細(xì)胞膜滲透率的影響Fig. 4 Effect of exogenous melatonin treatment on cell membrane permeability in apricot fruit
圖6 外源褪黑素對(duì)冷藏杏果實(shí)SOD活力的影響Fig. 6 Effect of exogenous melatonin on SOD activity of apricot fruit during cold storage
H2O2是最穩(wěn)定的ROS自由基,冷脅迫刺激會(huì)使其過(guò)度積累,引起膜脂過(guò)氧化。如圖7所示,在整個(gè)貯藏期間,兩組杏果實(shí)H2O2含量均隨采后貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,但褪黑素處理組杏果實(shí)的H2O2含量均低于同期對(duì)照組。貯藏28 d時(shí),對(duì)照組和褪黑素處理組的杏果實(shí)H2O2含量分別是47.184 nmol/g和33.420 nmol/g,褪黑素處理組比對(duì)照組低29.17%(P<0.05)。在貯藏結(jié)束時(shí),杏果實(shí)的H2O2含量達(dá)到最大值,褪黑素處理組比對(duì)照組低17.96%(P<0.05)。說(shuō)明外源褪黑素處理可以顯著抑制杏果實(shí)H2O2的積累。
圖7 外源褪黑素對(duì)冷藏杏果實(shí)H2O2含量的影響Fig. 7 Effect of exogenous melatonin on the H2O2 content of apricot fruit during cold storage
圖8 外源褪黑素對(duì)杏果實(shí)CAT活力的影響Fig. 8 Effect of exogenous melatonin on CAT activity of apricot fruit during cold storage
由圖8可知,對(duì)照組和褪黑素處理組的杏果實(shí)CAT活力隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先快速上升后下降的趨勢(shì)。貯藏7 d時(shí),褪黑素處理組的杏果實(shí)CAT活力達(dá)到最大(15.289 U/g),比同期對(duì)照組高46.38%(P<0.05)。貯藏至21 d時(shí),褪黑素處理組的杏果實(shí)CAT活力是對(duì)照組的1.74 倍(P<0.05)。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,外源褪黑素處理的杏果實(shí)能保持較高的CAT活力。
POD是植物體內(nèi)普遍存在的一種氧化還原酶,可與CAT協(xié)同作用,將H2O2分解為水和分子氧,減少H2O2的積累。由圖9可知,杏果實(shí)POD活力隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)。褪黑素處理的杏果實(shí)POD活力在整個(gè)貯藏期間均顯著高于同期對(duì)照組(P<0.05)。貯藏28 d時(shí),褪黑素處理組的杏果實(shí)POD活力達(dá)到最大值,是同期對(duì)照組的1.28 倍。貯藏至49 d時(shí),褪黑素處理組的杏果實(shí)POD活力比對(duì)照組高15.56%。說(shuō)明外源褪黑素處理能延緩杏果實(shí)的POD活力降低。
圖9 外源褪黑素對(duì)冷藏杏果實(shí)POD活力的影響Fig. 9 Effect of exogenous melatonin on POD activity of apricot fruit during cold storage
表1 杏果實(shí)冷害發(fā)病率、冷害指數(shù)與不同指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of chilling injury incidence and chilling injury index in apricot fruit with different indexes
如表1所示,冷害發(fā)病率、冷害指數(shù)與活性氧水平(H2O2含量、產(chǎn)生速率)呈極顯著正相關(guān),與MDA含量、細(xì)胞膜滲透率呈顯著或極顯著正相關(guān)。此外,H2O2含量與MDA含量、細(xì)胞膜滲透率也呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),相關(guān)系數(shù)分別為0.988、0.989。
因品種、采收成熟度而異,杏果實(shí)的冷害癥狀繁雜,且在低溫貯藏時(shí)不易被及時(shí)發(fā)現(xiàn),冷害后的果實(shí)更易患侵染性病害,最終導(dǎo)致果實(shí)貯藏品質(zhì)下降,降低了商品價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[29-30]。本實(shí)驗(yàn)中,不同濃度(50、100、200 μmol/L)褪黑素均能有效抑制杏果實(shí)的冷害,延緩果肉褐變和表皮水漬斑等冷害癥狀的出現(xiàn),推遲冷害發(fā)生,且以100 μmol/L褪黑素處理延緩杏果實(shí)冷害的效果最佳。在桃[31]和番茄[32]果實(shí)的研究中也發(fā)現(xiàn)采用100 μmol/L褪黑素處理可提高果實(shí)的抗冷性,維持貯藏品質(zhì)。這表明,適宜濃度的外源褪黑素處理可以有效抑制冷敏性果實(shí)發(fā)生冷害。
已有研究發(fā)現(xiàn),植物組織發(fā)生冷害的初始反應(yīng)為膜脂的相變,膜脂從液晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài),導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化,膜內(nèi)電解質(zhì)滲漏,進(jìn)而引發(fā)一系列次級(jí)反應(yīng)[33]。所以細(xì)胞膜滲透率和MDA含量是衡量低溫脅迫對(duì)細(xì)胞膜傷害程度的重要指標(biāo)。相關(guān)性分析結(jié)果表明,冷害指數(shù)、冷害發(fā)病率與細(xì)胞膜滲透率和MDA含量呈顯著或極顯著正相關(guān)(P<0.05、P<0.01)。本實(shí)驗(yàn)中,外源褪黑素能有效抑制杏果實(shí)低溫貯藏過(guò)程中細(xì)胞膜滲透率和MDA含量的增加。說(shuō)明外源褪黑素處理可維持膜的穩(wěn)定性,有利于緩解低溫對(duì)杏果實(shí)細(xì)胞膜的傷害。胡苗[34]和Liu Changhong[35]等將褪黑素應(yīng)用于獼猴桃、草莓果實(shí)采后貯藏中也得到相同的結(jié)果。
低溫誘導(dǎo)的植物傷害通常涉及ROS的產(chǎn)生和消耗之間的失衡[36]。H2O2和等ROS過(guò)度積累會(huì)不可逆地?fù)p害葉綠體和線(xiàn)粒體等細(xì)胞器,保護(hù)細(xì)胞免受脅迫下的氧化傷害被認(rèn)為是植物抵抗低溫的一個(gè)主要機(jī)制,而這種抗性可能取決于抗氧化系統(tǒng)的能力[37]。酶促抗氧化系統(tǒng)是控制ROS產(chǎn)生的主要渠道,而SOD、CAT、POD是清除ROS的關(guān)鍵抗氧化酶[38]。其中,SOD在自發(fā)和極快速的反應(yīng)中將分解為H2O2和氧[37];CAT和POD進(jìn)一步分解H2O2[39]。這3 種抗氧化酶協(xié)同降低H2O2和對(duì)細(xì)胞膜的氧化損傷,維持細(xì)胞膜的完整性,從而減輕果實(shí)的冷害。本研究中,褪黑素處理可顯著提高杏果實(shí)的SOD活力,有效降低的產(chǎn)生速率,同時(shí)維持較高CAT和POD活力,從而抑制H2O2的積累。相關(guān)性分析結(jié)果表明,冷害指數(shù)與H2O2含量(r=0.893)、產(chǎn)生速率(r=0.960)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),H2O2含量與MDA含量(r=0.988)、細(xì)胞膜滲透率(r=0.989)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。說(shuō)明ROS的積累與膜脂過(guò)氧化、冷害加劇密切相關(guān),減輕杏果實(shí)氧化應(yīng)激是維持細(xì)胞膜完整性、提高抗冷性的基礎(chǔ)。結(jié)果表明褪黑素可能在杏果實(shí)的抗氧化平衡中起著重要作用,維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài),從而調(diào)節(jié)ROS的對(duì)果實(shí)毒性,降低膜脂過(guò)氧化程度,緩解低溫對(duì)生物膜的傷害,減輕冷藏期間杏果實(shí)的冷害,這與Cao Shifeng等[40]的研究結(jié)果相似。Mirshekari等[41]也證實(shí)褪黑素處理增強(qiáng)果實(shí)的抗冷性與調(diào)控SOD、CAT、POD等抗氧化酶活力,抑制ROS的積累,保持ROS代謝的平衡有關(guān)。以上這些結(jié)果表明,褪黑素作為介導(dǎo)酶類(lèi)抗氧化劑抗氧化能力的信號(hào)分子,其卓越的ROS清除級(jí)聯(lián)反應(yīng)作用,可激活ROS清除酶活力,進(jìn)而降低ROS的積累,這可能是改善園藝作物冷藏期氧化應(yīng)激的關(guān)鍵。
綜上所述,外源褪黑素處理可以通過(guò)調(diào)節(jié)ROS代謝有效減輕杏果實(shí)冷害。本研究結(jié)果表明,采后應(yīng)用褪黑素可以通過(guò)提高SOD、CAT、POD等ROS清除酶的活性,降低H2O2和的積累,減輕膜脂過(guò)氧化程度,從而增強(qiáng)杏果實(shí)的抗冷性。說(shuō)明外源褪黑素處理減輕杏果實(shí)的冷害與調(diào)控ROS代謝密切相關(guān)。