武明月，孔祥麗，張?zhí)礻?，馮熙瑞，徐境含，許曉曦

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

肉類是人類飲食中重要的組成部分，含有高生物學(xué)效價(jià)的蛋白質(zhì)、鐵、鋅、硒和VB[1]。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，全球肉類消費(fèi)持續(xù)增長，近年來紅肉導(dǎo)致各類疾病風(fēng)險(xiǎn)和死亡率升高的報(bào)道與日俱增。研究表明，紅肉的日攝入量每增加50 g/1 000 kcal，結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)增加35%[2]；總紅肉和非加工紅肉的日攝入量每增加1 份，冠心病風(fēng)險(xiǎn)分別升高12%和11%[3]；除了提高心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)以外，大量食用紅肉也會增加消化道惡性腫瘤、非酒精性脂肪肝病、2型糖尿病及乳腺癌等疾病風(fēng)險(xiǎn)，其中牛肉對癌癥發(fā)生的影響則更為顯著[4-6]。完整的腸道黏膜屏障系統(tǒng)對保護(hù)機(jī)體健康和腸道穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[7]。目前認(rèn)為，腸黏膜屏障由腸黏膜上皮屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障以及腸道菌群屏障構(gòu)成[8],因此腸道菌群的失調(diào)也標(biāo)志著腸屏障的損傷，進(jìn)而可能引起慢性腸道炎癥的發(fā)生[9]。如紅肉的大量攝入會導(dǎo)致未消化的蛋白被腸道菌群發(fā)酵，產(chǎn)生腐胺和吲哚等物質(zhì)[10]，破壞腸穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致腸屏障功能障礙及炎癥等，從而增加結(jié)直腸癌和其他疾病的風(fēng)險(xiǎn)[11]。紅肉中的肉毒堿和膽堿經(jīng)腸道菌群代謝和酶的氧化作用生成有害產(chǎn)物氧化三甲胺（trimetlylamine oxide，TMAO），能增快血小板聚集、血栓形成及動脈粥樣硬化，是預(yù)防和治療心血管疾病的新靶點(diǎn)[12]。

近年來，通過飲食靶向腸道菌群來防治各類疾病成為了研究焦點(diǎn)。前瞻性研究結(jié)果分析表明，用含植物蛋白食物（豆類、堅(jiān)果、大豆等）替換飲食中非加工紅肉，冠心病風(fēng)險(xiǎn)會降低13%[3]；抗性淀粉能緩解紅肉導(dǎo)致的小鼠結(jié)腸DNA損傷和促結(jié)腸炎作用[13-14]；但膳食纖維調(diào)節(jié)紅肉飲食宿主腸道菌群從而降低患病風(fēng)險(xiǎn)的研究少有報(bào)道。研究表明，膳食纖維等復(fù)雜碳水化合物可降低結(jié)腸中微生物對蛋白質(zhì)的代謝[15]，抑制有害菌生長，促進(jìn)有益菌生長并發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），調(diào)節(jié)宿主代謝及改善腸屏障功能，進(jìn)一步減少心血管疾病、2型糖尿病、結(jié)直腸癌和乳腺癌等各類疾病的罹患風(fēng)險(xiǎn)[16]。其中菊粉作為最廣泛使用的膳食纖維之一，能調(diào)節(jié)和改善結(jié)腸癌、心血管疾病和肥胖[17]。大豆膳食纖維作為大豆中重要的活性組分，可降低肥胖、糖尿病和結(jié)腸炎的發(fā)生率[18]。

目前為止，紅肉仍具有無法替代的營養(yǎng)價(jià)值和適口性，因此，通過合理膳食調(diào)配以消除紅肉對健康的負(fù)面影響是未來營養(yǎng)學(xué)探究的重要方向。本實(shí)驗(yàn)基于這一理念，旨在研究以牛肉（紅肉）為蛋白來源的飲食對小鼠腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的不良影響，以及菊粉和大豆膳食纖維對牛肉飲食導(dǎo)致的負(fù)面影響的改善作用。并通過腸道微生態(tài)特征明確不同飲食組合與疾病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，探討兩種膳食纖維降低牛肉飲食罹患相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)的可能性。為合理膳食和未來個(gè)性化精準(zhǔn)營養(yǎng)提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

4 周齡SPF級雄性C57BL/6Cnc小鼠，體質(zhì)量14～16 g，購自北京維通利華試驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。

酪蛋白（純度93%） 武漢諾梵生物科技有限公司；牛里脊肉（剔除脂肪和筋膜） 市售；菊粉（純度94.3%） 卡爾迪克（上海）貿(mào)易有限公司；大豆膳食纖維（純度87.9%） 西安恒基化工有限公司；依照AIN-93G標(biāo)準(zhǔn)定制飼料混合粉 南通特洛菲飼料科技有限公司；小鼠氧化三甲胺酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 上海江萊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S型分析天平 德國Sartorius公司；BPG-9070A鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；3K15高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；VD-1320型無菌操作臺北京東聯(lián)哈爾儀器制造廠；RLE30086V型－80 ℃超低溫冰箱 美國賽默飛世爾科技有限公司；Nexis GC2030/QP2020NX氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；HBS-1096A酶標(biāo)儀 南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分組及飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)小鼠以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周后，根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對照組、牛肉組、牛肉與菊粉組和牛肉與大豆膳食纖維組，每組14 只，連續(xù)飼喂8 周。其中空白對照組飼喂含有20%酪蛋白的AIN-93G標(biāo)準(zhǔn)飼料，其他實(shí)驗(yàn)組同樣依照AIN-93G標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)行配方設(shè)計(jì)，飼喂20%牛肉蛋白代替20%酪蛋白，牛肉蛋白通過添加牛肉里脊獲得。各實(shí)驗(yàn)組飼料含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的不同種類膳食纖維，空白對照組和牛肉組為纖維素，牛肉與菊粉組為菊粉，牛肉與大豆膳食纖維組為大豆膳食纖維。所有小鼠均處于室內(nèi)溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%、12 h晝夜循環(huán)采光的適宜環(huán)境中，且自由進(jìn)食、飲水。

1.3.2 樣品采集

實(shí)驗(yàn)8 周后，斷頸脫臼處死小鼠，取出腎臟并去除脂肪等其他雜質(zhì)，放入離心管置于－80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)檢測。再于紫外無菌操作臺解剖小鼠腹腔，完整分離腸道，取結(jié)腸末端2、3 顆內(nèi)容物于滅菌后的EP管中，經(jīng)液氮速凍后立即保存在－80 ℃冰箱用作后續(xù)高通量測序及SCFAs含量檢測。

1.3.3 16S rRNA高通量測序

將小鼠結(jié)腸內(nèi)容物樣品進(jìn)行基因組DNA抽提，利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提后的基因組DNA，通過引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)，使用Agencourt AMPure XP試劑盒純化PCR產(chǎn)物，再利用Real-Time PCR定量分析。構(gòu)建MiSeq PE文庫，在Illumina MiSeq PE 300平臺上進(jìn)行高通量測序。

使用QIIME和R語言軟件對97%相似水平下聚類而成的操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析及作圖[19]，得到OTU數(shù)目Venn圖、稀釋性曲線、物種數(shù)目飽和度曲線、α-多樣性指數(shù)、主成分分析（principal component analysis，PCA）圖及門屬水平物種組成。采用QIIME和Python軟件分析并繪制線性判別分析效應(yīng)量（linear discriminant analysis effect size，LefSe）圖，其分析過程分為3 步：首先在多組樣本中采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)組間豐度差異顯著的物種，閾值為0.05；接著在所獲得的顯著差異物種中采用成組的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異分析，閾值為0.05；最后通過線性判別分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，并評估差異顯著物種的影響力分?jǐn)?shù)，閾值設(shè)定2，即得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)志物。

1.3.4 小鼠結(jié)腸內(nèi)容物SCFAs含量的測定

取50 mg小鼠結(jié)腸內(nèi)容物，加5 mL超純水，13 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，加10 μL體積分?jǐn)?shù)50%硫酸溶液、0.5 g無水硫酸鈉用于酸化鹽析，再加無水乙醚定容至5 mL后，6 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，采用外標(biāo)法進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測，根據(jù)稀釋倍數(shù)按式（1）計(jì)算得到小鼠結(jié)腸內(nèi)容物SCFAs含量[20]。

式中：ρ為儀器檢測到的樣品質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為定容后的體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為小鼠結(jié)腸內(nèi)容物的質(zhì)量/g。

色譜條件：色譜柱：DB-FFAP；升溫程序：柱溫起始溫度為80 ℃，保持1 min，然后以10 ℃/min升溫至170 ℃，再以20 ℃/min升溫至200 ℃，維持2 min。載氣為氦氣，進(jìn)樣量為1 μL，分流比為50∶1。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源，離子源溫度180 ℃，接口溫度200 ℃，選擇離子監(jiān)測（selected ions monitoring，SIM）掃描方式，m/z分別為41、42、43、45、57、60、73，溶劑延遲1 min。

1.3.5 小鼠腎臟TMAO質(zhì)量濃度的測定

用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.4）沖洗組織，去除殘留血液，放入玻璃勻漿器中，按照1∶9（m/V）加入磷酸鹽緩沖液，于冰上充分研磨。將勻漿液在5 000×g下離心5～10 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒進(jìn)行檢測。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度和吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按式（2）計(jì)算樣品TMAO質(zhì)量濃度。

式中：A1為樣品吸光度；A2為標(biāo)準(zhǔn)品吸光度；ρ為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度/（ng/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 9.5軟件作圖，SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并運(yùn)用鄧肯檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異顯著并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 組間OTU分布比較

OTU與物種之間呈映射關(guān)系，是所有腸道菌群分析的基礎(chǔ)。根據(jù)OTU聚類結(jié)果，可以進(jìn)一步分析α-多樣性、β-多樣性、物種組成及差異性分析。不同分組之間OTU的相似性及重疊情況可以用Venn圖展示。

由圖1可知，各組共有OTU數(shù)目為172 個(gè)。牛肉與大豆膳食纖維組的OTU總數(shù)最多，達(dá)到544 個(gè)，特有OTU數(shù)目125 個(gè)；牛肉與菊粉組的OTU總數(shù)為465 個(gè)，特有85 個(gè)；空白對照組的OTU總數(shù)為371 個(gè)，特有20 個(gè)；牛肉組的OTU總數(shù)最少，為251 個(gè)，特有3 個(gè)。說明牛肉的攝入減少了腸道微生物的種類，而大豆膳食纖維與菊粉的添加分別促進(jìn)了不同物種的增長，使物種豐富度明顯提升。

圖1 不同組別OTU數(shù)目的Venn圖Fig. 1 Venn diagram showing unique and shared OTUs between different groups

2.1.2 物種多樣性比較

腸道菌群多樣性的降低，常伴隨兼性厭氧菌比例上升及有害代謝物增多，與炎癥性腸病、肝病、2型糖尿病和腹腔疾病多種疾病顯著相關(guān)[21]。因此，物種多樣性能夠作為預(yù)測疾病的潛在指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用α-多樣性和β-多樣性來展示不同樣本或組別中的物種多樣性。

α-多樣性是度量單個(gè)樣本內(nèi)微生物物種多樣性的指標(biāo)，包含樣品中的物種類別的多樣性（豐富度）和每個(gè)物種所占比例（均勻度）兩個(gè)因素。本實(shí)驗(yàn)采用基于OTU數(shù)據(jù)分析的稀釋性曲線、物種數(shù)目飽和度曲線和α-多樣性指數(shù)3 個(gè)方法評估α-多樣性。稀釋性曲線用來比較不同樣本中物種的豐富度及評估樣品的測序深度。由圖2A可知，小鼠腸道菌群的稀釋曲線趨于平坦，更多的測序數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，說明測序結(jié)果可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。在測序深度相同的情況下，牛肉與大豆膳食纖維組與牛肉與菊粉組的豐富度高于其他組，牛肉組的豐富度明顯低于空白對照組。說明牛肉減少了小鼠腸道菌群的物種類別，而大豆膳食纖維和菊粉的添加提高了物種多樣性。

物種數(shù)目飽和度曲線能從豐富度和均勻度兩個(gè)方面來解釋物種多樣性，曲線的寬度反映物種豐富度，曲線的平滑程度反映物種均勻度。由圖2B可知，在水平方向上，不同樣品曲線在橫軸上的范圍不同，體現(xiàn)出各樣品物種豐富度差異較大。其中牛肉組豐富度最低，牛肉與大豆膳食纖維組與牛肉與菊粉組豐富度更高。此外，牛肉組與其他組曲線相比坡度較大，物種分布均勻度較差。其他各組曲線平滑程度較好，整體趨勢平緩，物種分布均勻。說明牛肉使小鼠腸道菌群的豐富度及均勻度降低，大豆膳食纖維和菊粉的添加有效改善了菌群的α-多樣性，減少患病風(fēng)險(xiǎn)。

圖2 腸道菌群的稀釋性曲線（A）和物種數(shù)目飽和度曲線（B）Fig. 2 Rarefaction curves (A) and rank abundance curves (B) of intestinal flora

α-多樣性指數(shù)包括一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)，本實(shí)驗(yàn)采用Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)及PD whole tree指數(shù)來評估各組的α-多樣性。Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù)與物種豐富度呈正相關(guān)；PD whole tree指數(shù)和Shannon指數(shù)越大，表明物種的豐富度和均勻度越好。由圖3綜合可知，4 種指數(shù)變化趨勢相似，牛肉與大豆膳食纖維組和牛肉與菊粉組多樣性顯著高于牛肉組（P＜0.05），牛肉與大豆膳食纖維組多樣性顯著高于空白對照組（P＜0.05），空白對照組多樣性顯著高于牛肉組（P＜0.05），牛肉與大豆膳食纖維組與牛肉與菊粉組之間差異不顯著（P＞0.05），牛肉與菊粉組與空白對照組之間差異不顯著（P＞0.05）。20%的牛肉蛋白水平飼糧導(dǎo)致小鼠腸道菌群多樣性降低，這與Zhang Zhimin等[22]研究結(jié)果相似。而大豆膳食纖維和菊粉的添加能有效提高腸道菌群物種的豐富度和均勻度，更有利于維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)。

β-多樣性是度量不同樣本間菌群組成與分布相似度大小的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用PCA來評估β-多樣性，其通過分析不同樣本OTU組成對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，找出數(shù)據(jù)中最“主要”的元素和結(jié)構(gòu)，用于反映樣本間的差異和距離，如樣本組成越相似，則在PCA圖中的距離越近。

由圖4可知，橫縱主坐標(biāo)成分的貢獻(xiàn)率分別是44.27%和24.24%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)68.51%，能很好地解釋原樣本中的信息。各組樣本點(diǎn)之間分離明顯，說明實(shí)驗(yàn)組和對照組之間腸道菌群構(gòu)成存在較大差異，且菊粉和大豆膳食纖維的添加明顯改變了牛肉飲食的腸道菌群組成和分布。由于兩種膳食纖維的來源、結(jié)構(gòu)等不同，故對腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變存在差異。

圖3 腸道菌群的α-多樣性指數(shù)Fig. 3 Alpha-diversity indexes of intestinal flora

圖4 小鼠腸道菌群的PCA圖Fig. 4 PCA plot of intestinal flora of mice

2.1.3 物種組成和差異分析

本實(shí)驗(yàn)通過門、屬水平的物種組成及LefSe進(jìn)一步比較各組間群落構(gòu)成的具體差異。LEfSe分析方法綜合了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析和該差異物種對分組結(jié)果的影響力得分，能得出各組在不同生物學(xué)水平上有顯著差異的物種（即生物標(biāo)志物）（圖5）。

基于門水平的物種組成及差異分析如圖6和表1所示，所有樣品共注釋4 個(gè)主要細(xì)菌門類，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。牛肉組與空白對照組相比，厚壁菌門相對豐度提高32.05%，是牛肉組中的差異物種。牛肉與菊粉組與空白對照組的門水平結(jié)構(gòu)較為相似，且與牛肉組相比，牛肉與菊粉組放線菌門相對豐度升高24.09%。牛肉與大豆膳食纖維組與其他3 組相比，增加了5%左右相對豐度的疣微菌門，使菌群結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。另外，相較于牛肉組，牛肉與菊粉組和牛肉與大豆膳食纖維組都降低了厚壁菌門的相對豐度，提高了擬桿菌門的相對豐度。說明牛肉攝入導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)，但菊粉和大豆膳食纖維的添加則改善了這種不良影響，更利于腸穩(wěn)態(tài)的保持，與多樣性分析結(jié)果相符。

圖6 小鼠腸道菌群門水平物種組成分析柱狀圖Fig. 6 Composition of intestinal flora in mice at the phylum level

如圖7所示，本實(shí)驗(yàn)中牛肉組的厚壁菌門與擬桿菌門相對豐度之比（Firmicutes/Bacteroidetes，F(xiàn)/B）顯著大于其他3 組（P＜0.05）。Kembra等[23]的研究也表明，牛肉攝入使變形菌門和厚壁菌門豐度增加，擬桿菌門豐度降低。有研究認(rèn)為，F(xiàn)/B值與肥胖、腸易激綜合癥等疾病相關(guān)聯(lián)[24-25]；但也有研究認(rèn)為，腸道菌群對肥胖的影響遠(yuǎn)比想象復(fù)雜，可能是由于某些細(xì)菌誘導(dǎo)了與脂質(zhì)及碳水化合物代謝相關(guān)的基因表達(dá)導(dǎo)致體質(zhì)量增加，因此F/B值很難被視為判別肥胖的標(biāo)志[26]。但牛肉攝入引起的這種腸道菌群失調(diào)現(xiàn)象仍應(yīng)該引起重視。

圖7 各組厚壁菌門/擬桿菌門相對豐度比值Fig. 7 Relative abundance ratio between Firmicutes and Bacteroidetes in each group

屬水平的物種組成及差異分析如圖8及表2所示。屬水平上牛肉與大豆膳食纖維組與空白對照組菌群組成更為相近，而牛肉組與其他3 組的菌群組成差距較大。說明大豆膳食纖維和菊粉的添加改善了牛肉飲食的屬水平菌群構(gòu)成，使其與常規(guī)飲食的菌群結(jié)構(gòu)更加接近，與先前的多樣性分析結(jié)果相印證。

與空白對照組相比，牛肉組中乳桿菌屬、狹義梭菌屬和Romboutsia豐度顯著高于其他3 組。研究表明，常被認(rèn)為是益生菌的乳桿菌同時(shí)亦是腸道菌群多樣性較低時(shí)的主導(dǎo)細(xì)菌[27]，肥胖者的腸道菌群中乳桿菌科的豐度顯著高于正常人[28]，某些乳桿菌屬能促進(jìn)肥胖的發(fā)生[29]。且乳桿菌屬及梭菌屬在胃癌患者中更加豐富，表現(xiàn)為胃癌特征性細(xì)菌[30]。狹義梭菌屬與血壓上升和壞死性腸炎相關(guān)[31]。Romboutsia能提高高密度脂蛋白膽固醇和超氧化物歧化酶水平[32]；本實(shí)驗(yàn)牛肉組中乳桿菌屬的豐度過高可能會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，從而增大患病風(fēng)險(xiǎn)，且乳桿菌屬和狹義梭菌屬的相對豐度遠(yuǎn)高于Romboutsia相對豐度，意味著牛肉對菌群的負(fù)面影響會占據(jù)主導(dǎo)地位。且相較于空白對照組，牛肉組中雙歧桿菌、糞桿菌屬、瘤胃球菌科成員（Ruminococcaceae_UCG_014）、擬桿菌屬、擬普雷沃菌屬以及毛螺菌科成員（Lachnoclostridium、Lachnospiraceae_UCG_006和羅斯氏菌）的豐度降低。研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并增加阿克曼氏菌的豐度，與低度炎癥、肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病負(fù)相關(guān)[33-34]；糞桿菌屬是丁酸鹽產(chǎn)生菌，在腸道炎癥和肥胖個(gè)體中含量較低[35]；瘤胃球菌科和擬普雷沃菌屬具有抗炎作用，且Ruminococcaceae_UCG_014與血糖水平降低相關(guān)[36]；而一些擬桿菌屬表達(dá)的整合酶能模擬胰腺β-細(xì)胞上的抗原表位，召集相應(yīng)的T細(xì)胞到腸道，從而抑制炎癥發(fā)生[37]；毛螺菌科與抗炎細(xì)胞數(shù)量正相關(guān)，能反轉(zhuǎn)結(jié)腸炎的菌群失調(diào)和易感性[38]。其成員羅斯氏菌能抑制白細(xì)胞介素17（interleukin 17，IL-17）的表達(dá)并起到抗炎作用，在潰瘍性結(jié)腸炎患者和高血壓患者中豐度明顯降低[39-40]；Kembra等[23]研究表明，不同處理方式的牛肉可分別導(dǎo)致梭狀芽胞桿菌、乳酸菌屬和大腸桿菌豐度提高，毛螺菌科、雙歧桿菌、阿克曼氏菌屬、擬桿菌屬和羅斯氏菌等有益菌豐度下降，對腸屏障產(chǎn)生不利影響。綜上可知，牛肉飲食會對腸道菌群產(chǎn)生負(fù)面影響，引起輕度炎癥、肥胖、結(jié)腸炎、高血壓和2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的提高。

牛肉與菊粉組相較于牛肉組，乳桿菌屬和狹義梭菌屬的豐度降低，明顯提高了雙歧桿菌、Ruminococcaceae_UCG_014、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae_UCG_006、羅斯氏菌、擬桿菌屬、擬普雷沃菌屬和理研菌屬的豐度。理研菌屬是牛肉與菊粉組特有的一種黏蛋白降解菌，該菌與抑制肥胖功能正相關(guān)[28]。因此，菊粉的添加改善了牛肉飲食導(dǎo)致的有害菌增加及有益菌減少，具有降低低度炎癥、2型糖尿病、結(jié)腸炎、高血壓和肥胖風(fēng)險(xiǎn)的作用。

相較于牛肉組，牛肉與大豆膳食纖維組減少了乳桿菌屬和狹義梭菌屬的豐度，使糞桿菌屬、阿克曼氏菌、戈登氏桿菌屬、擬普雷沃菌屬、安德克氏菌屬、瘤胃球菌科成員（Ruminococcaceae_UCG_014、Ruminiclostridium_6和Ruminococcus_1）以及厭氧原體屬的豐度升高。研究報(bào)道，阿克曼氏菌作為新興益生菌，能夠增強(qiáng)腸道屏障，減輕慢性低水平炎癥，緩解肥胖、炎性腸病、高血壓和糖尿病[41]；厭氧原體屬與血脂的生物標(biāo)志物負(fù)相關(guān)[42]，且可作為治療慢性腸炎的潛在益生菌[43]；糞桿菌屬能夠利用復(fù)雜多糖[35]。戈登氏桿菌屬參與將木脂素轉(zhuǎn)化為具有抗氧化和防治疾病功效的腸道木脂素的過程[44]。安德克氏菌屬是具有免疫調(diào)節(jié)的細(xì)菌，與黃酮醇、黃烷醇的攝入量呈正相關(guān)[45]。因此，可能是大豆膳食纖維中的木脂素及黃酮類物質(zhì)等植物活性成分促進(jìn)了這些菌的生長。說明大豆膳食纖維的添加提高了與植物來源膳食有關(guān)的有益菌豐度，改善了牛肉對腸道菌群的負(fù)面影響。并與菊粉相似，能夠減少肥胖、炎性腸病、心血管疾病和糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，菊粉和大豆膳食纖維的添加分別促進(jìn)了不同種類的益生菌生長，改善了小鼠結(jié)腸菌群屬水平的豐富度，使牛肉引起的患病風(fēng)險(xiǎn)概率降低，與上述多樣性分析相印證。在本次實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)，小鼠未患有任何疾病，但牛肉飲食的小鼠腸道菌群揭示的各種疾病風(fēng)險(xiǎn)增加與流行病學(xué)研究表明的多種疾病風(fēng)險(xiǎn)升高相吻合，為調(diào)節(jié)腸道菌群的個(gè)性化營養(yǎng)療法可行性提供了理論支持。

圖8 小鼠腸道菌群屬水平物種組成分析柱狀圖Fig. 8 Compositions of intestinal flora in mice at the genus level

表2 屬水平差異物種生物標(biāo)志物在各組中的相對豐度Table 2 Relative abundance of biomarkers at the genus level in each group%

2.2 腸道代謝產(chǎn)物分析

2.2.1 小鼠結(jié)腸內(nèi)容物SCFAs含量對比

SCFAs是腸道微生物種群發(fā)酵不易消化多糖形成的主要產(chǎn)物，對維持腸道正常功能和結(jié)腸上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能具有重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，SCFAs可加強(qiáng)腸道屏障功能、參與免疫調(diào)節(jié)、降低膽固醇的合成，改善肥胖、預(yù)防心腦血管疾病、炎性腸病及2型糖尿病等[46]，特別是丁酸具有抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞腫瘤的作用[47]。如表3所示，本實(shí)驗(yàn)中牛肉與大豆膳食纖維組小鼠的結(jié)腸內(nèi)容物總SCFAs含量顯著高于其他3 組（P＜0.05），牛肉與菊粉組小鼠的結(jié)腸內(nèi)容物總SCFAs含量顯著高于牛肉組（P＜0.05）。牛肉與大豆膳食纖維組的乙、丙、丁酸含量顯著高于其他3 組（P＜0.05），異丁酸、異戊酸含量顯著高于牛肉組（P＜0.05）。牛肉與菊粉組的乙酸、丙酸含量顯著高于牛肉組（P＜0.05）。揭示單獨(dú)飼喂牛肉減少了SCFAs的生成，但添加兩種膳食纖維能明顯改善牛肉飲食引起的SCFAs含量降低，其中大豆膳食纖維的效果更好。

表3 小鼠結(jié)腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量Table 3 Concentrations of SCFAs in colon contents

有研究表明，相較于常規(guī)飲食，飼喂豬肉香腸的大鼠糞便中乙酸、丁酸和丙酸的濃度顯著下降[1]。亦有研究顯示，相比含有酪蛋白的普通飼料，飼喂牛肉蛋白的大鼠盲腸菌群代謝的丁酸和丙酸含量偏低[48]。本研究中牛肉組相比其他實(shí)驗(yàn)組各種SCFA水平均為最低，可能由于該組菌群多樣性偏低，雙歧桿菌屬、糞桿菌屬、瘤胃球菌科、毛螺菌科成員（Lachnospiraceae_UCG_006、羅斯氏菌）等SCFAs產(chǎn)生菌豐度較低。有報(bào)道指出，糖尿病患者服用菊粉可顯著升高糞便中總SCFAs、乙酸和丙酸的濃度[49]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。因?yàn)榫辗鄣臄z入增加了小鼠腸道雙歧桿菌屬、瘤胃球菌科、毛螺菌科、擬桿菌屬、擬普雷沃菌屬等SCFAs產(chǎn)生菌的豐度。目前的體外發(fā)酵研究表明，大豆膳食纖維產(chǎn)生的乙酸、丙酸和丁酸量比燕麥麩皮、玉米麩皮或麥麩纖維多1.5～8.0 倍[50]，這與本研究結(jié)果基本一致。大豆膳食纖維顯著提高了SCFAs產(chǎn)生菌的豐度，如糞桿菌屬、阿克曼氏菌、瘤胃球菌科、擬普雷沃菌屬、擬桿菌屬及羅斯氏菌。

2.2.2 小鼠腎臟TMAO質(zhì)量濃度對比

紅肉中的肉毒堿和膽堿經(jīng)腸道菌群代謝和酶的氧化作用生成有害產(chǎn)物TMAO，主要通過腎臟排出體外。研究表明，大量食用紅肉能顯著升高人體內(nèi)的TMAO含量，降低其腎排泄率，進(jìn)而提高心血管疾病、腎病、糖尿病和肥胖等風(fēng)險(xiǎn)[51-52]。如圖9所示，本研究中牛肉組腎臟TMAO質(zhì)量濃度顯著大于其他3 組（P＜0.05），牛肉與菊粉組和牛肉與大豆膳食纖維組腎臟TMAO質(zhì)量濃度顯著低于牛肉組和空白對照組（P＜0.05）。目前已有的研究證實(shí)，植物乳桿菌可通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)顯著降低TMAO含量，表明益生菌可通過調(diào)控體內(nèi)TMAO進(jìn)而起到預(yù)防心血管等疾病的作用[53]。還有研究報(bào)道，補(bǔ)充丁酸鹽可逆轉(zhuǎn)TMAO促慢性腎病作用[54]。由此證明TMAO和SCFAs都對疾病的發(fā)生有重要影響。

圖9 小鼠腎臟TMAO含量Fig. 9 TMAO content in mouse kidney

3 結(jié) 論

紅肉是目前人類飲食中必不可少的一部分，雖然已有的研究表明其具有促炎、促癌等不良影響。但本研究證實(shí)，通過菊粉和大豆膳食纖維的添加可緩解牛肉（紅肉）對小鼠腸道菌群和代謝產(chǎn)物的負(fù)面影響：菊粉可促進(jìn)小鼠腸道雙歧桿菌、Ruminococcaceae_UCG_014等豐度提升；大豆膳食纖維能增加阿克曼氏菌屬、糞桿菌屬等豐度。兩種膳食纖維的攝入均降低了體內(nèi)TMAO質(zhì)量濃度，提高了結(jié)腸內(nèi)容物的SCFAs含量。兩種膳食纖維能夠降低紅肉飲食增加的肥胖、炎性腸病、心血管疾病和糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。本研究對紅肉飲食增加疾病風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制進(jìn)行了解析，并為未來合理膳食及個(gè)性化營養(yǎng)輔助治療疾病提供了科學(xué)理論支持。