李思錦，宋春麗，王欣卉，任 健,*

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省玉米主食工業(yè)化工程技術研究中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

近年來，隨著人們生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，嚴重威脅人類健康。該病的病理生理機制雖尚未完全闡明，但高糖高脂飲食習慣形成的肥胖、胰島素耐受等問題被認為是造成非酒精性脂肪性肝病的重要因素[1]。非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生是由膽固醇和甘油三酯含量的增加所引起的，促炎轉錄因子的表達和脂質代謝的改變也參與其病理過程。此外，多項研究已經證實氧化應激是促進非酒精性脂肪性肝病發(fā)展的主要因素。因此，減輕肝臟脂質代謝和氧化應激對于非酒精性脂肪性肝病的預防和治療至關重要[2]。目前，對于調節(jié)脂質平衡相關的報道多集中在食源性活性肽方面。洋蔥多肽能夠起到降血糖作用[3]，大豆肽具有明顯的降血脂功能[4]，玉米肽對高糖高脂誘導的大鼠具有保護作用[1]。

黑豆肽作為一種植物源活性肽，其體外抗炎活性和抗氧化活性的研究已取得一定進展[5-6]。例如，黑豆肽能降低血清和肝臟中丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量，顯著提高肝臟中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性以及血清和肝臟中谷胱甘肽超氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的活性[7]。黑豆肽疏水性較高的Leu殘基表現(xiàn)出輔助降血脂的功效[8]。然而，黑豆肽能否修復高脂飲食造成的脂肪性肝損傷的研究鮮見報道。

本研究以雄性小鼠建立高脂性肝損傷模型，從生理生化指標和肝臟組織形態(tài)角度探究黑豆肽對小鼠高脂性肝損傷的修復作用，為拓展黑豆肽的功能特性和研發(fā)高效修復肝損傷的天然產品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

ICR雄性小鼠80 只（SPF級），體質量（20±2）g，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，動物生產許可證號為SCXK（吉）2018-0007。

黑豆購于黑龍江省齊齊哈爾市北大荒綠野食品有限公司。

谷丙轉氨酶（cerealthirdtransaminase，ALT）試劑盒、谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒、MDA試劑盒和微量還原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒 南京建成生物工程研究所；白細胞介素（interleukin，IL）-6試劑盒、IL-1β試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒和核轉錄因子（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）試劑盒 上海江萊生物科技有限公司；辛伐他汀 北京默飛生物科技有限公司；高血脂模型飼料II沈陽茂華生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LXJ-2B型臺式低速離心機 上海安亭科學儀器廠；Enspire型全波長多功能酶標儀 美國珀金埃爾默有限公司；DF-II型集熱式磁力攪拌器 金壇市華峰儀器制造有限公司；UV5100型紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑豆蛋白的提取

黑豆?jié)穹撈?，烘干?00 目過篩。準確稱取黑豆粉100 g，加入500 mL石油醚，磁力攪拌2.5 h后4 000 r/min離心10 min，取下層沉淀繼續(xù)脫脂，重復3 次，在室溫下晾干待用。取一定量黑豆粕，按1∶10（m/V）加入蒸餾水，調節(jié)pH值至8.5，50 ℃水浴攪拌2 h，4 000 r/min離心10 min，取上清液，沉淀復溶，重復上述操作，合并兩次上清液，用1 mol/L HCl溶液調節(jié)上清液pH值為4.5，4 000 r/min下離心10 min，棄去上清液，保留沉淀。向沉淀中按1∶10（m/V）加入去離子水（pH 4.5），4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，重復水洗3 次，沉淀即黑豆分離蛋白，于沉淀中加入少量去離子水，調其pH值為7，采用真空冷凍干燥法凍干黑豆分離蛋白，研磨成粉，密封保存。

1.3.2 黑豆肽的制備

將水與黑豆蛋白以9∶1（V/m）的比例均勻混合，調節(jié)pH值至（8.5±0.1），添加3%堿性蛋白酶（1 g/100 g蛋白質），在60 ℃條件下酶解70 min。酶解結束后，將酶解物置于90 ℃水中滅酶10 min，然后快速使其冷卻至室溫，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，經噴霧干燥得黑豆肽[9]。

1.3.3 黑豆肽的氨基酸組成分析

稱取60 mg黑豆肽粉置于容積為20 mL的安瓿管中，加入9 mL 6.67 mol/L HCl溶液進行酸水解，充氮封管后在110 ℃下水解24 h。用pH 2.2的檸檬酸緩沖液定容至100 mL并過水系膜，然后使用氨基酸自動分析儀進行分析[10]。

1.3.4 高脂性肝損傷小鼠模型的建立

雄性健康的ICR小鼠80 只，小鼠飼養(yǎng)于實驗專用鼠籠，飼喂標準飼料，室溫（24±2）℃，相對濕度（45±3）%，光照12 h/d，小鼠適應性喂養(yǎng)一周后，將80 只小鼠隨機分為2 組，模型組（60 只）飼喂高脂飼料（每只5 g/d，定量添加）、對照組（20 只）飼喂普通飼料，自由攝食、飲水。連續(xù)喂養(yǎng)5 周后，正常對照組和脂肪肝模型組分別處死10 只小鼠，比較2 組小鼠的血清和肝臟生化指標，以及觀察肝臟組織病理切片，判斷高脂性肝損傷小鼠模型是否建立成功。

1.3.5 分組與給藥

將50 只造模成功小鼠隨機分為5 組，每組10 只，分別為模型組、陽性藥物組（辛伐他汀100 mg/kgmb）、黑豆肽低、中、高劑量組（400、800、1 000 mg/kgmb）。連續(xù)給藥5 周，空白對照組（10 只）和模型組分別給予等量生理鹽水。給藥期間，除空白對照組標準鼠料飼養(yǎng)外，其余各組繼續(xù)給予高脂飼料，直到實驗結束。所有小鼠在末次給藥后，禁食不禁水12 h，小鼠眼球取血，分離血清，檢測小鼠血清相應生化指標（AST、ALT、TG、TC、HDL-C、LDL-C、IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平）。取血后處死小鼠，取出肝臟，左肝葉用體積分數(shù)4%多聚甲醛溶液固定，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，切片，供組織病理學檢查；右肝葉制備成10%肝組織勻漿，測定相應生化指標（MDA和GSH水平）。

1.3.6 指標檢測

1.3.6.1 小鼠體質量、肝臟指數(shù)的測定

小鼠取血前稱質量，處死后完整取出肝臟，稱其肝臟濕質量。按下式計算肝臟指數(shù)。

1.3.6.2 小鼠生化指標的測定

使用ELISA試劑盒測定血清ALT、AST、LDL-C、HDL-C、TG、TC、IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平以及肝臟GSH和MDA水平，具體方法嚴格按照相應試劑盒說明書進行。

1.3.6.3 HE染色觀察小鼠肝臟組織形態(tài)學變化

取肝組織于體積分數(shù)4%多聚甲醛浸泡固定，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片處理，常規(guī)HE組織化學染色，在光學顯微鏡下觀察肝組織的病理變化情況[11]，采集倍數(shù)200×。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示，采用Excel和SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用Duncan進行方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 黑豆肽的氨基酸組成分析

蛋白質的品質由其氨基酸的種類和含量決定[12]。黑豆肽的氨基酸種類齊全，必需氨基酸含量占34.62%，支鏈氨基酸含量占14.79%（表1），黑豆肽必需氨基酸和支鏈氨基酸含量高于大豆蛋白水解物[13]。已有研究提出支鏈氨基酸含量異?？梢詫е赂鞣N形式的肝損傷的發(fā)展和惡化，在慢性肝病，特別是肝硬化中支鏈氨基酸含量減少[14]。支鏈氨基酸為主再配以其他氨基酸組成常用于治療肝硬化、慢性肝病等[15]。由此可推測黑豆肽具有保肝護肝的作用。

表1 黑豆肽氨基酸含量Table 1 Amino acid composition of black soybean peptides

2.2 高脂性肝損傷模型的建立

模型組小鼠經連續(xù)5 周飼喂高脂飼料后，小鼠的體質量、肝指數(shù)以及小鼠肝臟形態(tài)均發(fā)生改變。與對照組相比，模型組小鼠毛色欠鮮亮，毛發(fā)更為雜亂。隨著飼喂時間的延長，模型組小鼠活動度減少，體質量、肝臟質量及肝臟指數(shù)增加（但無統(tǒng)計學意義），呈現(xiàn)體態(tài)肥胖的狀態(tài)（表2）。對照組小鼠肝臟呈鮮紅色，而模型組小鼠肝臟顏色彌散，肝臟明顯呈脂肪肝化（圖1），表明高脂性肝損傷小鼠模型建立成功。

表2 高脂性肝損傷小鼠5 周后體質量及肝臟指數(shù)的變化（n＝10）Table 2 Changes in body mass and liver index in mice induced by high-fat diet continuously for 5 weeks (n = 10)

圖1 高脂性肝損傷小鼠肝臟的形態(tài)Fig. 1 Appearance of liver tissues in mice with liver injury induced by high-fat diet

本研究測定了小鼠血清生化指標，結果如表3所示。與對照組相比，高脂飼料飼喂的模型小鼠血清中TG、TC和LDL-C濃度均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），其中TC和LDL-C濃度分別提高了238.4%和296.1%；血清中HDL-C濃度顯著降低（P＜0.05）。有研究表明，高脂飲食導致的非酒精脂肪肝損傷，能夠增加體內TG的分泌，引起TC和LDL-C水平的升高，以及HDL-C水平降低[16]。本研究結果進一步表明高脂性肝損傷小鼠模型建立成功。

表3 高脂性肝損傷小鼠生化指標的影響（n＝10）Table 3 Effect of high-fat diet on biochemical indexes in mice (n = 10)

2.3 黑豆肽對高脂性肝損傷小鼠肝臟組織形態(tài)學影響

經黑豆肽灌胃至第8周的小鼠肝臟組織形態(tài)學變化結果見圖2。對照組小鼠肝組織結構和肝細胞間隙均未見明顯異常，肝索走向正常；模型組小鼠肝細胞內存在大量脂滴，胞質內可見圓形空泡，炎細胞浸潤，肝索紊亂，大部分細胞壞死；相比于模型組，黑豆肽組（400～1 000 mg/kgmb）及陽性藥物組小鼠肝內空泡細胞明顯減少，炎細胞浸潤均較模型組有不同程度的改善；黑豆肽組（800～1 000 mg/kgmb）小鼠部分肝臟細胞保存完整，有突出的細胞核和脈絡膜以及清晰的細胞邊界。

圖2 黑豆肽對高脂性肝損傷小鼠肝臟組織形態(tài)學變化的影響Fig. 2 Effects of black soybean peptides on hepatic histomorphological changes in mice with liver injury induced by high-fat diet

2.4 黑豆肽對高脂性肝損傷小鼠生化指標的影響

高脂飲食誘導的非酒精性脂肪性肝病能夠引起大量脂肪變性，造成脂質積累，導致血液中ALT與AST活力升高。而HDL是一種能夠防止膽固醇積累的脂蛋白，LDL是一種氧化后易誘發(fā)脂肪性肝病的脂蛋白，生化指標（ALT、AST、TC、TG、LDL-C、HDL-C）水平的變化是反映肝臟損害與否的重要依據(jù)[17-18]。

持續(xù)灌胃黑豆肽4 周后小鼠血清生化指標分析結果見表4。與模型組相比，黑豆肽（800～1 000 mg/kgmb）能夠顯著降低小鼠AST、ALT、TG、TC和LDL-C的水平，并極顯著升高HDL-C水平（P＜0.01）。黑豆肽組（800～1 000 mg/kgmb）與陽性藥物組相比，TG濃度極顯著降低（P＜0.01），對AST、ALT、TC、LDL-C和HDL-C水平的影響無顯著性差異（P＞0.05）。經黑豆肽干預后，肝細胞的通透性發(fā)生變化，導致血液中ALT與AST含量降低[17]。并且減緩了脂肪變性，減輕脂質積累，減少體內游離的脂肪酸[19]，體現(xiàn)在TC、TG或LDL-C水平降低，HDL-C水平升高[20-21]。結果表明，黑豆肽通過提高抗氧化能力和降低脂質過氧化，起到良好的降脂保肝作用，能夠減輕高脂飲食誘導的肝損傷。

表4 黑豆肽對高脂性肝損傷小鼠生化指標的影響（n＝10）Table 4 Effects of black soybean peptides on biochemical indices in mice with liver injury induced by high-fat diet (n = 10)

2.5 黑豆肽對高脂性肝損傷小鼠肝臟抗氧化指標的影響

氧化應激和脂質過氧化反應是目前公認的非酒精性脂肪性肝病發(fā)病病因[22]，GSH和MDA是評價其損傷程度的指標[23]。經過持續(xù)灌胃黑豆肽4 周后小鼠體內抗氧化活性指標結果見表5。黑豆肽組（400～1 000 mg/kgmb）能夠極顯著降低小鼠MDA水平，并極顯著升高GSH水平（P＜0.01）。黑豆肽組（800～1 000 mg/kgmb）與陽性藥物組相比GSH水平無顯著性差異（P＞0.05）。在黑豆肽的干預下，肝細胞內氧化應激和脂質過氧化反應程度均減輕，減輕了細胞膜的損傷[24-25]。降低MDA濃度、提高GSH濃度，能夠對非酒精性脂肪肝病小鼠起到保護作用[26]，結果表明黑豆肽可減輕脂質過氧化并具有良好的抗氧化能力。

表5 黑豆肽對高脂性肝損傷小鼠肝臟GSH和MDA含量的影響（n＝10）Table 5 Effects of black soybean peptides on GSH and MDA contents in liver tissues of mice with liver injury induced by high-fat diet (n = 10)

2.6 黑豆肽對高脂性肝損傷小鼠血清中炎性因子和NF-κB水平的影響

當機體發(fā)生非酒精性肝損傷時，肝臟細胞功能異常，激活NF-κB的信號通路。NF-κB處于炎癥反應的中心環(huán)節(jié)，通過調控各種急性反應蛋白、細胞黏附分子和細胞因子的轉錄過程，直接參與肝臟急、慢性炎癥反應[27-28]。TNF-α是一種促炎因子，其能通過活化NF-κB信號通路，進一步引發(fā)多種炎性因子（如IL-6和IL-1β）的釋放，造成肝臟炎性損傷，誘導肝細胞調亡，同時這些炎性介質反過來導致NF-κB的活化，造成炎癥反應進一步加劇[29-31]。

經過持續(xù)灌胃黑豆肽4周后小鼠體內血清炎性因子和NF-κB水平結果見表6。黑豆肽組（400～1 000 mg/kgmb）能夠極顯著降低小鼠TNF-α、NF-κB、IL-6和IL-1β的水平（P＜0.01），高劑量組（1 000 mg/kgmb）與陽性藥物組相比，炎性因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）含量無顯著性差異（P＞0.05），但能夠顯著降低核轉錄因子NF-κB含量（P＜0.05）。當黑豆肽進入機體后，減輕了肝細胞的炎癥損傷，降低了炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達與釋放，同時減弱了NF-κB的活化能力，促使炎癥基因表達下調，從而抑制炎癥反應[32]。以上結果表明，黑豆肽可抑制炎癥因子釋放，減輕高脂飲食誘導的肝損傷并改善肝功能。

表6 黑豆肽對高脂性肝損傷小鼠血清炎性因子和核轉錄因子水平的影響（n＝10）Table 6 Effects of black soybean peptides on serum levels of inflammatory factors and nuclear transcription factors in mice with liver injury induced by high-fat diet (n = 10)

3 結 論

黑豆肽能夠通過提高體內的抗氧化能力（提高ALT、AST、GSH水平），減輕脂質過氧化水平（降低TC、TG、LDL-C、MDA水平）和體內炎癥反應（降低TNF-α、NF-κB、IL-6、IL-1β水平），從而有效緩解高脂飲食誘導的肝損傷。黑豆肽有望在保健品或藥品的研究領域中應用，但對于黑豆肽的護肝保肝效應仍需要進行更加深入的研究。