吳睿婷，付王威，萬(wàn) 敏，吳 偉，姚于飛，李文娟,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006）

隨著社會(huì)的迅速發(fā)展，高糖分高脂肪含量的飲食結(jié)構(gòu)已成為快節(jié)奏生活中常見的飲食模式，使得肥胖和糖尿病患者人數(shù)激增并呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。目前，肥胖被公認(rèn)是誘發(fā)2型糖尿病的獨(dú)立因素之一，在高糖高脂飲食長(zhǎng)期誘導(dǎo)下形成高血糖高脂水平，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能受損。同時(shí)，宿主飲食習(xí)慣的變化可直接導(dǎo)致宿主腸道微生物菌譜的改變，有研究顯示，腸道菌群和2型糖尿病之間存在一定聯(lián)系，腸道菌群失調(diào)可能參與到2型糖尿病發(fā)病機(jī)制中[1]。人體腸道內(nèi)寄居有數(shù)以百萬(wàn)億計(jì)微生物，正常狀態(tài)下菌群間相互依存、制約、共生，形成相對(duì)穩(wěn)定的腸道微生態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期的高糖高脂飲食作用下，可能會(huì)打破這種微生態(tài)平衡，失調(diào)的腸道菌群會(huì)通過(guò)代謝、炎癥、免疫等途徑促進(jìn)2型糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生[2]。Larsen等[3]通過(guò)對(duì)比糖尿病男性患者和正常男性間腸道微生物組成，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者腸道內(nèi)厚壁菌門（Firmicutes）豐度減少，擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度增加，有益的共生菌如乳酸桿菌和雙歧桿菌豐度降低。有文獻(xiàn)將這種改變與血糖和體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）聯(lián)系起來(lái)，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門/擬桿菌門（Firmicutes/Bacteroidetes，F(xiàn)/B）比值的變化在糖尿病患者中存在普遍性，并且與血糖和BMI呈線性關(guān)系[4]。隨后腸道菌群被報(bào)道可以通過(guò)產(chǎn)生細(xì)菌素，抗生素和其代謝產(chǎn)物改變宿主的生理功能。短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）主要由腸道微生物利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生，包括乙酸、丙酸和丁酸等，它們具有不同的生理功能，在多個(gè)器官和組織中發(fā)揮作用。研究證明SCFAs能通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)、胰島素敏感性和宿主炎性內(nèi)環(huán)境來(lái)改善2型糖尿病[5]。

黑靈芝（Ganoderma atrum）作為藥食兩用的天然真菌，素有“仙草”之稱，是我國(guó)自古以來(lái)的傳統(tǒng)藥材和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，含有多種活性物質(zhì)，如多糖、三萜類化合物、氨基酸多肽類等。Chen Yi等[6]通過(guò)熱水提法從黑靈芝中分離獲得了一種水溶性黑靈芝多糖（Ganoderma atrumpolysaccharides，PSG），并開展了大量的研究工作。本課題組前期研究表明，黑靈芝多糖是黑靈芝中最主要的活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、降血糖和調(diào)節(jié)免疫功能等多方面的活性功能[7]。Li Lu等[8]發(fā)現(xiàn)黑靈芝多糖對(duì)鏈脲佐菌素（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠胰腺損傷具有保護(hù)作用，可以通過(guò)降低血糖，抑制線粒體凋亡通路和激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路來(lái)降低胰島細(xì)胞凋亡。Zhu Kexue等[9]報(bào)道了黑靈芝多糖對(duì)2型糖尿病大鼠具有降血糖和降血脂的功能，同樣也減少了胰島細(xì)胞凋亡?；谝陨涎芯?，黑靈芝多糖已經(jīng)初步被證實(shí)具有抗糖尿病作用，但國(guó)內(nèi)關(guān)于黑靈芝多糖對(duì)糖尿病腸道菌群的影響研究鮮有報(bào)道。腸道部分微生物能選擇性利用飲食中的特定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)自身的生長(zhǎng)與富集，進(jìn)而在宿主中發(fā)揮其有益或有害的作用。結(jié)合前期研究基礎(chǔ)[6-9]，黑靈芝多糖作為水溶性膳食纖維是否能被微生物選擇性利用進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)及其抗糖尿病的關(guān)聯(lián)仍需進(jìn)一步研究。因此，本實(shí)驗(yàn)建立大鼠糖尿病模型，引入高通量測(cè)序技術(shù)，旨在探究糖尿病發(fā)病機(jī)制與腸道微生物間的聯(lián)系，以及黑靈芝多糖作為食品對(duì)宿主腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，評(píng)估其對(duì)腸道菌群組成結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物的影響，初步探討黑靈芝多糖抗糖尿病作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

清潔級(jí)Wistar雄性大鼠60 只（150～200 g）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（贛）2018-0003。大鼠飼養(yǎng)于干燥、通風(fēng)、安靜的環(huán)境中，水和飼料無(wú)限供應(yīng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。高糖高脂飼料：66.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，后同）基礎(chǔ)飼料、10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、1%膽酸鈉。

黑靈芝（Ganoderma atrum）購(gòu)自江西尋烏縣東江源珍稀食用菌廠，從黑靈芝菌種中分離得到黑靈芝多糖。

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ） 美國(guó)Sigma公司；鹽酸二甲雙胍片 中美上海施貴寶制藥有限公司；10%中性福爾馬林固定液、無(wú)水乙醇、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胰島素試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

血糖儀 德國(guó)Roche公司；3K15高速冷凍離心機(jī)美國(guó)Sigma公司；全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；超純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司；組織脫水機(jī)、冷凍包埋機(jī)、轉(zhuǎn)式切片機(jī)、攤烤片機(jī) 金華科迪儀器設(shè)備有限公司；分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 黑靈芝多糖的制備

按照Chen Yi等[6]方法制備黑靈芝精制多糖，將黑靈芝子實(shí)體進(jìn)行粉碎，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液室溫下脫脂48 h，過(guò)濾；濾渣中加入蒸餾水，100 ℃下提取2 h，過(guò)濾、濃縮；將體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液加入濃縮液中至乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，4 ℃下沉淀多糖，醇沉后，4 000×g下離心20 min，加水復(fù)溶，Sevag法去除游離蛋白，透析、濃縮、凍干，得黑靈芝精多糖。

1.3.2 建立糖尿病大鼠模型

隨機(jī)分10 只作為正常對(duì)照組（control group，CN）飼喂普通飼料，其余50 只作為造模組，給予高糖高脂飼料，飼養(yǎng)8 周后禁食12 h。禁食結(jié)束后每千克體質(zhì)量大鼠進(jìn)行尾靜脈注射含30 mg STZ的溶液，正常組大鼠尾靜脈注射等體積的檸檬酸緩沖液。72 h后用血糖儀檢測(cè)空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）濃度，在造模后的第3、7天測(cè)得FBG濃度不小于11.1 mmol/L視為造模成功。剔除血糖不符合標(biāo)準(zhǔn)和造模死亡的大鼠，成模率約為67%。

1.3.3 動(dòng)物分組、劑量設(shè)置及給藥方法

將造模成功的糖尿病大鼠隨機(jī)分為以下6 組：模型組（diabetes mellitus group，DM）、陽(yáng)性對(duì)照組（metformin group，MET）、黑靈芝多糖低劑量組（PSG low dose group，PSGL）、黑靈芝多糖中劑量組（PSG middle dose group，PSGM）、黑靈芝多糖高劑量組（PSG high dose group，PSGH）和CN組。黑靈芝多糖組和MET組分別采用黑靈芝多糖水溶液（25、50、100 mg/kgmb）與150 mg/kgmb二甲雙胍水溶液進(jìn)行灌胃，CN組和DM組大鼠通過(guò)灌胃的方式給予相同體積的去離子水，灌胃劑量為0.2 mL/10 gmb，持續(xù)干預(yù)30 d。

1.3.4 FBG及胰島素水平測(cè)定

給藥前及給藥期間每周測(cè)定1 次FBG濃度，監(jiān)測(cè)各組FBG濃度，采血當(dāng)天各組大鼠禁食（不禁水）12 h，以采血針刺破大鼠尾尖毛細(xì)血管采血，使用血糖儀測(cè)定大鼠FBG濃度。

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定血清胰島素水平，具體操作方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。根據(jù)血清胰島素值計(jì)算大鼠胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment insulin resistance index，HOMA-IR），如公式（1）所示。

1.3.5 血脂水平測(cè)定

收集血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL）水平。

1.3.6 腸道收集及形態(tài)病理學(xué)觀察

大鼠解剖后，迅速取出小腸組織，選擇約5 cm空腸，盡量避免如鑷子、剪刀使用不當(dāng)?shù)热藶閾p壞行為，生理鹽水輕輕清洗后，使用干凈濾紙吸去水分，放入體積分?jǐn)?shù)4%中性甲醛溶液固定24 h以上。隨后，將組織塊從固定液中取出，脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片、貼片、脫蠟與復(fù)水，經(jīng)HE染色后，在顯微鏡下觀察空腸組織形態(tài)的變化。

1.3.7 盲腸內(nèi)容物的SCFAs濃度測(cè)定

參照實(shí)驗(yàn)已建立的色譜分析條件和方法[10]，稱取適量乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸等標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，定容混勻，配制成梯度混合溶液。氣相色譜重復(fù)測(cè)定3 次，根據(jù)對(duì)應(yīng)濃度的色譜圖，計(jì)算數(shù)據(jù)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取大鼠結(jié)腸內(nèi)容物按1∶7（m/V）加入超純水，渦旋后超聲處理，然后置于冰浴中20 min，4 800×g離心20 min，取上清液過(guò)0.22 μm水相濾膜后進(jìn)氣相色譜分析，利用Hu Jielun等[10]的色譜方法測(cè)得對(duì)應(yīng)SCFAs峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程按公式（2）計(jì)算上清液中各SCFAs濃度。

1.3.8 16S rDNA高通量測(cè)序及微生物多樣性分析

收集大鼠糞便樣本，寄送至上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建和Illumina MiSeq測(cè)序。通過(guò)基因組DNA抽提，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，熒光定量，Illumina PE250測(cè)序得到的DNA雙端測(cè)序讀段（pairedendsequencing reads，PE reads），采用DADA（divisive amplicon denosing algorithm）2方法進(jìn)行降噪，拼接及去嵌合體，以100%相似度閾值進(jìn)行分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，進(jìn)一步采用Alpha多樣性分析（Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Faith_pd指數(shù)、Good’s coverage），Beta多樣性分析（主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）、非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析），分類學(xué)組成分析、物種差異性分析（韋恩圖、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）、LDA差異貢獻(xiàn)分析（LDA effect size，LEfSe）、隨機(jī)森林分析）等分析方法獲得微生物相關(guān)信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，采用ANOVA法進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示極顯著差異，采用GraphPad prism 6.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑靈芝多糖對(duì)大鼠FBG濃度及胰島素水平的調(diào)節(jié)

HOMA-IR用于評(píng)價(jià)個(gè)體的胰島素抵抗水平，隨著胰島素抵抗水平升高而升高。由圖1可知，與CN組相比，糖尿病大鼠的FBG濃度顯著升高（P＜0.05），同時(shí)胰島素抵抗明顯。高糖高脂飲食能夠破壞部分胰腺組織，造成模型動(dòng)物胰島素分泌相對(duì)不足，從而引發(fā)高血糖，高血糖能反饋性促進(jìn)胰島素分泌，高脂飼養(yǎng)后造成模型大鼠胰島素抵抗，進(jìn)一步加重高胰島素血癥。使用糖尿病傳統(tǒng)治療藥物二甲雙胍干預(yù)后，能顯著抑制糖尿病大鼠血糖濃度及胰島素抵抗水平的升高。與未經(jīng)處理的糖尿病DM組大鼠相比，灌胃黑靈芝多糖后的FBG濃度顯著降低（P＜0.05），同時(shí)HOMA-IR也顯著減?。≒＜0.05），表明黑靈芝多糖能緩解糖尿病引發(fā)的大鼠血糖升高和胰島素抵抗，改善其胰島素敏感性。數(shù)據(jù)進(jìn)一步顯示，在調(diào)節(jié)血糖水平和胰島素抵抗水平方面，PSGM組治療效果較優(yōu)于PSGL、PSGH組，并不呈現(xiàn)劑量依賴性，為后續(xù)選擇PSGM組研究多糖對(duì)腸道菌群的影響提供一定的數(shù)據(jù)支持。

圖1 黑靈芝多糖對(duì)糖尿病大鼠血糖和胰島素抵抗的影響Fig. 1 Effect of polysaccharide from Ganoderma atrum on FBG and insulin resistance in diabetic rats

2.2 黑靈芝多糖對(duì)大鼠脂代謝的影響

如表1所示，與CN組相比，DM組TC、TG和LDL-C水平顯著升高（P＜0.05），而作為逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇到肝臟代謝的載體——HDL-C，其含量卻略高于正常組，但無(wú)顯著性差異，這可能由于血清中膽固醇含量增高使得HDL-C水平出現(xiàn)伴隨性增加，但其轉(zhuǎn)運(yùn)速率遠(yuǎn)不及膽固醇的攝入速率，從而導(dǎo)致膽固醇的累積。同時(shí)，與DM組相比，PSGL、PSGM、PSGH組的TC、TG、LDL-C水平均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，多糖劑量越高，干預(yù)效果越好，低、中、高劑量對(duì)這3 個(gè)指標(biāo)都表現(xiàn)出顯著的改善作用（P＜0.05）；值得關(guān)注的是，在服用中劑量的黑靈芝多糖水溶液后，糖尿病大鼠血清中HDL-C水平進(jìn)一步升高，與其他組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 黑靈芝多糖對(duì)大鼠脂代謝的影響Table 1 Effect of polysaccharide from Ganoderma atrum on lipid metabolism in rats

2.3 黑靈芝多糖對(duì)糖尿病大鼠腸道組織形態(tài)學(xué)的保護(hù)作用

腸道連接內(nèi)部和外部環(huán)境，不僅調(diào)控營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，還具有免疫、生理和物理屏障功能。腸上皮作為腸道的重要組成部分，由絨毛和隱窩、上皮和內(nèi)皮細(xì)胞組成，能夠阻止外界不良因素的刺激和入侵，發(fā)揮物理屏障作用，腸道屏障可與其他屏障一起共同應(yīng)對(duì)突然出現(xiàn)的應(yīng)激。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)空腸組織進(jìn)行HE染色，如圖2所示，CN組大鼠的空腸黏膜上皮細(xì)胞排列緊密，腸絨毛無(wú)明顯斷裂腫脹等癥狀，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整；DM組部分小腸絨毛上皮斷裂脫落，隱窩深度明顯降低，形態(tài)結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重的破壞，間質(zhì)充血并有炎細(xì)胞浸潤(rùn)；與DM組相比，多糖組和MET組空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)有所改善，絨毛增長(zhǎng)，腫脹程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，表明黑靈芝多糖對(duì)糖尿病大鼠的腸道組織損傷有一定保護(hù)作用。

圖2 HE染色觀察腸道組織病理學(xué)變化（×40）Fig. 2 Histological change in intestine of rats (× 40)

2.4 黑靈芝多糖對(duì)大鼠盲腸內(nèi)容物中SCFAs的影響

以上有關(guān)血糖水平與胰島素抵抗水平研究中，數(shù)據(jù)顯示PSGM組相關(guān)指標(biāo)略優(yōu)于PSGH組，黑靈芝多糖在機(jī)體內(nèi)的有效作用與劑量之間沒(méi)有呈現(xiàn)預(yù)期的正相關(guān)依賴關(guān)系，結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)（脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)中PSGH組大鼠指標(biāo)均優(yōu)于PSGM組大鼠），提示了黑靈芝多糖體內(nèi)作用模式較為復(fù)雜。大量研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)劑量-效應(yīng)關(guān)系的作用方式一般呈現(xiàn)拋物線形式，通常隨著劑量的增加，效應(yīng)或反應(yīng)率的變化先迅速，之后相對(duì)緩慢，形成拋物線形狀。藥物效應(yīng)強(qiáng)度是實(shí)驗(yàn)劑量選擇的重要參數(shù)，是指能引起等效反應(yīng)（一般采用50%效應(yīng)量）的相對(duì)濃度或劑量，反映藥物與受體的親和力，其值越小則強(qiáng)度越大。藥物的最大效能與效應(yīng)強(qiáng)度含意有本質(zhì)區(qū)別，二者并不平行。因此在同等活性功能（或差距接近）的情況下，選取劑量小的作為進(jìn)一步研究，有利于探尋到更多的實(shí)驗(yàn)可能。謝瑛[11]發(fā)現(xiàn)多糖的體內(nèi)作用模式呈現(xiàn)出一種非線性關(guān)系，且高劑量組未出現(xiàn)預(yù)期的最佳活性功能。因此本實(shí)驗(yàn)選擇的PSGM組（50 mg/kgmb）進(jìn)行盲腸內(nèi)容物中SCFAs和腸道微生物檢測(cè)分析。

腸道菌群參與機(jī)體生命活動(dòng)的主要方式之一是產(chǎn)生SCFAs，SCFAs是腸道菌群發(fā)酵膳食纖維的主要產(chǎn)物，還可以通過(guò)外源攝入獲取，其分子結(jié)構(gòu)小且不穩(wěn)定，主要包括了乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸6 種，其中乙酸、丙酸和丁酸約占所有SCFAs的95%以上[12]。本研究檢測(cè)了大鼠糞便樣本中以上6 種SCFAs濃度，組間變化如圖3所示，與CN組相比，DM組大鼠糞便中乙酸、異丁酸、戊酸、異戊酸濃度顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），丁酸濃度有降低趨勢(shì)；相反，丙酸濃度在DM組中極顯著升高（P＜0.01）。經(jīng)過(guò)二甲雙胍治療和黑靈芝多糖灌胃干預(yù)后，MET組和PSGM組大鼠糞便中丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸濃度相較于DM組有所增加，丙酸濃度極顯著降低（P＜0.01），與CN組無(wú)顯著性差異；PSGM組的異丁酸、戊酸和異戊酸3 種代謝產(chǎn)物濃度與DM組對(duì)比具有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 黑靈芝多糖對(duì)短鏈脂肪酸的影響Fig. 3 Effect of Ganoderma atrum polysaccharide on intestinal SCFAs

不同SCFAs對(duì)糖尿病的影響存在差異，Sanna等[13]研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群產(chǎn)生的丁酸能調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)，改善人體的胰島素抵抗；而糞便中丙酸鹽含量增加會(huì)提高2型糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)[12]。然而，Lin等[14]給肥胖小鼠膳食中補(bǔ)充丁酸、丙酸和乙酸鹽，發(fā)現(xiàn)丁酸和丙酸可以通過(guò)減少攝入量預(yù)防飲食引起的肥胖和胰島素抵抗的作用。這些相關(guān)性的證據(jù)表明SCFAs積極參與到在糖尿病發(fā)展中。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠糞便中丙酸濃度增加，與FBG濃度和HOMA-IR成正比，說(shuō)明丙酸異常與糖尿病密切相關(guān)，但其在糖尿病中的作用還存在爭(zhēng)議，需要進(jìn)一步研究。黑靈芝多糖抗糖尿病作用可能通過(guò)降低丙酸含量，促進(jìn)丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸分泌，差異性調(diào)節(jié)SCFAs水平來(lái)發(fā)揮作用。

2.5 黑靈芝多糖對(duì)腸道菌群的物種多樣性及組成的影響

2.5.1 OTU數(shù)及Alpha多樣性分析

基于OTU數(shù)分別在門、綱、目、科、屬、種分類等級(jí)進(jìn)行分析，不同分組的注釋情況如圖4所示。Venn圖結(jié)果顯示4 組重疊部分代表組間共有的OTUs，共655 個(gè)；DM組、MET組和PSGM組與CN組單獨(dú)重合OTU個(gè)數(shù)分別為244、384、637 個(gè)，說(shuō)明黑靈芝多糖組與正常組OTU相似度高于DM組與正常組。

生態(tài)學(xué)中通常用Alpha多樣性來(lái)衡量個(gè)體內(nèi)菌群的多樣性，通過(guò)多個(gè)指標(biāo)反映出生境下的物種豐富度、多樣性和均勻度等方面。腸道菌群的物種多樣性主要由Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Faith_pd指數(shù)和Good’s coverage反映。如圖4所示，DM組的Chao1、Faith_pd指數(shù)較CN組均有降低，MET組呈回升趨勢(shì)；Shannon指數(shù)組間無(wú)明顯變化。與DM組的糖尿病大鼠相比，黑靈芝多糖具有抑制腸道菌群豐富度下降的能力，使Chao1指數(shù)趨近于CN組；并能增加菌群的物種多樣性?？偠灾?，患有糖尿病的大鼠腸道微生物豐富度遭到破壞，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，而黑靈芝多糖干預(yù)可以一定程度上平衡失調(diào)的腸道菌群。

圖4 大鼠腸道菌群Venn圖和Alpha多樣性指數(shù)Fig. 4 Venn diagram and alpha-diversity indexes of gut microbiota in mice

2.5.2 Beta多樣性分析

使用QIIME軟件計(jì)算Beta多樣性，通過(guò)分析Beta多樣性指數(shù)比較各組間微生物組成相似度?；跇颖局形锓N豐度信息進(jìn)行PCoA，采用非加權(quán)UniFrac距離算法，結(jié)果如圖5A所示，CN組與DM組分開聚集，微生物群落的差異明顯，PC1為26.3%，PC2為15.4%。與DM組相比，多糖組微生物群落沿第一主坐標(biāo)（PCo1）向CN組偏移，組內(nèi)中心連接點(diǎn)與正常組中心點(diǎn)的距離小于DM組與CN組的距離，在一定程度上能改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)分布；MET組沿著PC1和PC2遠(yuǎn)離DM組，更接近CN組，能顯著改變腸道菌群的分布，改善腸道菌群失調(diào)。使用NMDS分析進(jìn)一步驗(yàn)證不同組之間的物種多樣性差異，結(jié)果如圖5B所示，CN組和DM組之間發(fā)生明顯的分離；多糖組組內(nèi)個(gè)體間雖然不明顯聚集，但都表現(xiàn)出偏離DM組向CN組靠近的趨勢(shì)，與DM組比較，其中心連接點(diǎn)與CN組間的距離縮短。以上結(jié)果表明DM組和CN組腸道微生物的物種組成存在顯著性差異，黑靈芝多糖可以調(diào)節(jié)腸道菌群物種結(jié)構(gòu)組成，減小由STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠與正常大鼠腸道菌群物種組成間的差異。

圖5 Beta多樣性變化Fig. 5 Variation in Beta-diversity

2.5.3 腸道微生物菌落組成分析

通過(guò)與Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)OTU進(jìn)行物種分類，重點(diǎn)分析門水平和屬水平上大鼠菌群結(jié)構(gòu)組成。

圖6A為門水平上各組的物種組成分類柱狀聚類圖，大鼠腸道微生物主要由10 個(gè)門構(gòu)成，分別為Firmicutes、Bacteroidetes、變形桿菌（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、糖細(xì)菌門（TM7）、螺旋體門（Spirochaetes）、軟壁菌門（Tenericutes）、藍(lán)藻細(xì)菌門（Cyanobacteria）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、迷蹤菌門（Elusimicrobia）。其中Firmicutes和Bacteroidetes均為優(yōu)勢(shì)菌門，是豐度最高的兩個(gè)菌門。比較組間豐度變化發(fā)現(xiàn)，由于STZ的干預(yù)，DM組較CN組的Firmicutes相對(duì)豐度顯著降低，而Bacteroidetes相對(duì)豐度明顯上升；相比于DM組，MET組和多糖組的Firmicutes相對(duì)豐度呈現(xiàn)不同程度的增加，Bacteroidetes相對(duì)豐度減少，說(shuō)明黑靈芝多糖可以緩解由糖尿病引發(fā)的菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)，但干預(yù)效果低于二甲雙胍。F/B可以在一定程度上作為反映腸道菌群紊亂的重要指標(biāo)，并且與BMI和血糖有關(guān)。對(duì)比各組F/B平均值變化（圖6B），發(fā)現(xiàn)與CN組比較，DM組F/B平均值極顯著減小（P＜0.01），與血糖值呈負(fù)相關(guān)；MET組可以讓糖尿病大鼠菌群F/B恢復(fù)正常水平；多糖組相較于DM組，F(xiàn)/B平均值有一定程度的上升，與CN組相比沒(méi)有顯著性差異。

圖6C是各組在屬水平上分類學(xué)結(jié)果，乳酸菌（Lactobacillus）和普雷沃菌屬（Prevotella）在各組中均為優(yōu)勢(shì)菌屬；與CN組相比，DM組普雷沃菌屬（Prevotella）、布勞特氏菌屬（Blautia）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、梭菌屬（Clostridium）和鏈球菌屬（Streptococcus）相對(duì)豐度增加；Lactobacillus、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、顫螺菌屬（Oscillospira）、擬桿菌屬（Bacteroides）豐度明顯降低；與DM組比較，黑靈芝多糖灌胃后大鼠糞便中Prevotella、Blautia、Phascolarctobacterium、CF231的相對(duì)豐度降低，而Clostridium、糞球菌屬（Coprococcus）、Turicibacter、Bacteroides相對(duì)豐度增加；柯林斯氏菌屬（Collinsella）、Bifidobacterium、羅斯伯里氏菌屬（Roseburia）、Allobaculum主要出現(xiàn)在PSGM組和MET組中。

圖6 各組大鼠腸道微生物菌落組成Fig. 6 Composition of gut microbiota in mice from each group

2.5.4 門水平和屬水平組間差異物種分析

基于LEfSe篩選出CN、DM和PSGM組組間豐度差異顯著物種，柱長(zhǎng)越長(zhǎng)代表該分類單元的差異越顯著，本次實(shí)驗(yàn)分析的LDA閾值為2.0。同時(shí)，應(yīng)用隨機(jī)森林分類算法進(jìn)行篩選，圖7分別為門分類水平和屬分類水平的評(píng)分結(jié)果。結(jié)合兩種分析方法，篩選出重要性評(píng)分高并且具有明顯組間差異物種，并選出DM組與PSGM組間具有顯著差異的物種，觀察其相對(duì)豐度變化情況。

圖7 大鼠腸道菌群組間差異顯著性分析Fig. 7 Significance analysis of differences in gut microbiota between groups

門水平上顯著差異物種相對(duì)豐度變化如圖8所示，DM組大鼠Firmicutes和Cyanobacteria的相對(duì)豐度極顯著降低，而Bacteroidetes的相對(duì)豐度要高于CN組。Cyanobacteria在腸道中占比較少，屬于革蘭氏陰性菌。Pandurangan等[15]通過(guò)STZ刺激大鼠建立糖尿病模型，使用Cyanobacteria灌胃進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其可以降低糖尿病大鼠的血糖、血脂水平，增加血漿胰島素，具有抗氧化、抗糖尿病作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)灌胃黑靈芝多糖后，大鼠腸道內(nèi)的Cyanobacteria相對(duì)豐度極顯著增加（P＜0.01），與CN組無(wú)明顯差異。個(gè)體間腸道菌群組成往往存在著很大差異，然而在門水平上物種組成又呈現(xiàn)出相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，個(gè)體間差異主要表現(xiàn)在物種豐度變化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3 個(gè)差異物種，雖然Firmicutes、Bacteroidetes和Cyanobacteria中還包含了許多不同的菌屬，但認(rèn)為其組間相對(duì)豐度變化可以看作一種趨勢(shì)性變化，具有代表性，可能與疾病以及多糖作用機(jī)制密切相關(guān)，并且從以往的研究中可以知道這種趨勢(shì)具有較好的重復(fù)性，易于比較和解讀。

圖8 大鼠腸道菌群組間門水平差異物種Fig. 8 Difference in gut microbiota between groups at phylum level

屬水平上顯著差異物種相對(duì)豐度變化如圖9所示，F(xiàn)irmicutes中Lactobacillus、Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira的相對(duì)豐度在糖尿病大鼠腸道中都表現(xiàn)出不同程度的下降，其中DM組的Lactobacillus和Oscillospira與CN組相比具有極顯著性差異（P＜0.01）。Bacteroidetes中Prevotella、CF231在DM組中富集，其中CF231未在CN組大鼠糞便內(nèi)檢出，Bifidobacterium相對(duì)豐度相比于CN組有所增加。黑靈芝多糖干預(yù)可顯著上調(diào)Lactobacillus、Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira、Bifidobacterium相對(duì)豐度，下調(diào)Prevotella、CF231相對(duì)豐度，使之趨于正常。并且檢測(cè)到Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira4 個(gè)菌屬在多糖組大鼠糞便中非常豐富，高于CN組和MET組。猜測(cè)這4 個(gè)菌種可能是黑靈芝多糖發(fā)揮其腸道調(diào)節(jié)功能的目標(biāo)菌屬，雖然在腸道中所占比例較少，但個(gè)別物種豐度的變化可能是疾病治療的關(guān)鍵。

Bacteroidetes以產(chǎn)乙酸和丙酸為主，F(xiàn)irmicutes以產(chǎn)丁酸為主，其包含的Prevotella、Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira都可將多糖發(fā)酵成SCFAs。糖尿病作為一慢性代謝性疾病，因持續(xù)的高血糖刺激，機(jī)體往往伴隨著復(fù)雜的慢性炎癥表現(xiàn)。前期研究結(jié)果顯示黑靈芝多糖的抗糖尿病作用與其抗炎作用相關(guān)[8,16]。有研究報(bào)道腸道內(nèi)擁有較高水平的Roseburia細(xì)菌的小鼠可以減少炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化患病風(fēng)險(xiǎn)及高血糖并發(fā)癥的危害，Roseburia是產(chǎn)丁酸的主力；Oscillospira通過(guò)降解利用多糖產(chǎn)生丁酸鹽參與炎癥預(yù)防[17-19]；而Prevotella主要分泌琥珀酸和乙酸，在有胰島素抵抗的妊娠期糖尿病女性腸道內(nèi)含量豐富，并且被證明與2型糖尿病胰島素抵抗增加有關(guān)，可能是2型糖尿病患者的腸道微生物中的特征菌[20-21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明，在DM組中，Prevotella富集的同時(shí)大鼠胰島素抵抗情況加重。經(jīng)過(guò)黑靈芝多糖的治療，Prevotella豐度降低，血清胰島素抵抗水平降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明黑靈芝多糖可以通過(guò)調(diào)節(jié)不同菌的豐度，緩解糖尿病癥狀，并且通過(guò)調(diào)節(jié)產(chǎn)酸菌的豐度來(lái)影響糖尿病大鼠糞便中SCFAs含量，對(duì)宿主發(fā)揮進(jìn)一步的保護(hù)作用。

因此，黑靈芝多糖可能下調(diào)Bacteroidetes和Prevotella、CF231，通同時(shí)上調(diào)Lactobacillus、Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira、Bifidobacterium，進(jìn)而調(diào)節(jié)不同SCFAs分泌來(lái)發(fā)揮治療作用。

圖9 大鼠腸道菌群組間屬水平差異物種Fig. 9 Difference in gut microbiota between groups at genus level

3 討 論

黑靈芝多糖是黑靈芝中水溶性膳食纖維組分，本實(shí)驗(yàn)以黑靈芝菌蓋為原材料提取到靈芝多糖，其主要由核糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，按照0.20∶0.28∶1.00∶4.32∶2.21物質(zhì)的量比組成[22-23]。黑靈芝多糖被認(rèn)為是黑靈芝的主要活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖及腸道保護(hù)等多種生理功能調(diào)節(jié)作用?；诤陟`芝多糖的降血糖功能，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該多糖具有2型糖尿病保護(hù)作用，其作用機(jī)制與腸道菌群密切相關(guān)。

腸道細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)的改變可能導(dǎo)致代謝紊亂的發(fā)展，如2型糖尿病和肥胖癥。當(dāng)長(zhǎng)期攝入高糖高脂飲食，可能會(huì)改變腸道細(xì)菌特征和菌群結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致SCFAs減少，有益菌降低，而脂多糖等內(nèi)毒素分泌增加并進(jìn)入人體，從而參與炎癥、胰島素抵抗和與肥胖相關(guān)的2型糖尿病的發(fā)生[24-25]。本實(shí)驗(yàn)預(yù)先采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠8 周，造成胰島素抵抗，然后使用STZ尾靜脈注射誘發(fā)大鼠產(chǎn)生糖尿病。造模成功后，灌胃黑靈芝多糖水溶液干預(yù)大鼠糖尿病發(fā)展，檢測(cè)大鼠腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)的變化。根據(jù)高通量測(cè)序的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)DM組和CN組之間Alpha多樣性和Beta多樣性有顯著性差異。糖尿病大鼠菌群豐富度明顯低于正常大鼠，PCoA顯示CN組大鼠表現(xiàn)出組內(nèi)聚集，個(gè)體間菌群組成相似；相反，糖尿病大鼠遠(yuǎn)離CN組，個(gè)體間較為分散，菌群組成有差異；黑靈芝多糖能一定程度上調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)向CN組靠近，說(shuō)明菌群失調(diào)是伴隨著糖尿病發(fā)生與發(fā)展的，并且個(gè)體間表現(xiàn)出很大差異性，黑靈芝多糖的干預(yù)能改善菌群失調(diào)的狀態(tài)。

接著從兩個(gè)方面去嘗試分析黑靈芝多糖對(duì)糖尿病大鼠腸道微生物改變的影響。第一，對(duì)菌群的物種結(jié)構(gòu)變化的影響。基于LEfSe分析和隨機(jī)森林分類算法篩選出兩個(gè)分類學(xué)水平上的差異菌群，門水平上Firmicutes、Bacteroidetes和Cyanobacteria豐度組間有顯著性差異，糖尿病大鼠中Firmicutes和Cyanobacteria豐度顯著降低。此外，本實(shí)驗(yàn)計(jì)算了F/B，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DM組的F/B比CN組低，多糖組有一定恢復(fù)，但無(wú)顯著性。根據(jù)資料顯示許多糖尿病研究中將F/B改變作為腸道菌群在肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病的標(biāo)志性變化，并與血糖水平和BMI有關(guān)[26]。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果[4]一致，但多糖組似乎沒(méi)有表現(xiàn)出很明顯的上調(diào)F/B的作用。

進(jìn)一步在屬水平上篩選出了8 個(gè)菌屬，發(fā)現(xiàn)CF231是糖尿病大鼠中富集，在多糖組中豐度顯著降低。CF231是帕拉普氏菌科（Paraprevotellaceae）的一個(gè)屬，Yun等[27]研究發(fā)現(xiàn)CF231在超重患者腸道內(nèi)豐度增加，與BMI正相關(guān)。而Prevotella被報(bào)道發(fā)現(xiàn)與糖尿病胰島素抵抗增加有密切關(guān)系，并且Prevotella產(chǎn)生的琥珀酸通過(guò)一定合成路徑可以生成丙酸，這可能是導(dǎo)致DM組中丙酸異常增加原因之一，進(jìn)而提高2型糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)[20-21,28]。由于丙酸在宿主中的作用是多樣的，其在2型糖尿病中的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步驗(yàn)證和探究。

本實(shí)驗(yàn)觀察到多糖組Lactobacillus、Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira的相對(duì)豐度顯著增加，Bifidobacterium在MET組中增加更為明顯。Lactobacillus和Bifidobacterium是人體腸道內(nèi)重要益生菌，具有降血糖、降血脂、預(yù)防腸道疾病等多種作用[29]。Bauer等[30]發(fā)現(xiàn)高脂飲食會(huì)降低乳酸菌的豐度，二甲雙胍可以通過(guò)增加乳酸桿菌的豐度，部分調(diào)節(jié)小腸菌群，影響腸道吸收葡萄糖的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從而控制血糖水平，這為黑靈芝上調(diào)乳酸菌豐度的作用機(jī)制提供思路。

第二，黑靈芝多糖對(duì)菌群代謝物的影響。膳食纖維經(jīng)過(guò)微生物的發(fā)酵降解產(chǎn)生具有一定生物活性的代謝產(chǎn)物，代謝產(chǎn)物由SCFAs、維生素、氣體等組成[31]。SCFAs部分由結(jié)腸上皮細(xì)胞吸收，部分通過(guò)血液進(jìn)入體循環(huán)，在各組織中發(fā)揮作用。丁酸是腸上皮細(xì)胞的重要能量來(lái)源，同時(shí)在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、保持腸道結(jié)構(gòu)和功能的完整性等方面具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)丁酸對(duì)2型糖尿病的預(yù)防和治療有顯著貢獻(xiàn)，產(chǎn)生丁酸的細(xì)菌豐富度可能與2型糖尿病治療密切相關(guān)[32]。Roseburia是產(chǎn)生丁酸的主要貢獻(xiàn)菌，同時(shí)也是腸道膳食纖維的主要降解劑，膳食纖維木聚糖和甘露聚糖等可以通過(guò)Roseburia在腸道中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[33]。Coprococcus參與丁酸產(chǎn)生途徑包括磷酸/丁酸激酶途徑和丁酰輔酶A/乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移路線[19]。同時(shí)，Ruminococcus和Bifidobacterium是乙酸的主要產(chǎn)生菌。

總之，本研究表明，黑靈芝多糖對(duì)可通過(guò)維系大鼠腸道中微生物的結(jié)構(gòu)及SCFAs分泌水平的正?；瑢?duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血糖血脂和胰島素抵抗具有一定調(diào)控作用。黑靈芝多糖進(jìn)入腸道后可以被腸道菌群利用，通過(guò)下調(diào)腸道微生物中的特征菌增加部分產(chǎn)酸菌的豐度，進(jìn)而促進(jìn)產(chǎn)酸菌SCFAs的分泌。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用STZ尾靜脈注射的方法建立了大鼠2型糖尿病模型，探究了黑靈芝多糖對(duì)2型糖尿病大鼠血糖血脂的調(diào)節(jié)作用，以及對(duì)腸道菌群和其代謝產(chǎn)物SCFAs的影響。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)論如下：1）黑靈芝多糖可以顯著降低糖尿病大鼠血糖血脂水平，并減輕胰島素抵抗；2）黑靈芝多糖能夠通過(guò)改善糖尿病造成的腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷，改變大鼠腸道微生物的數(shù)量和結(jié)構(gòu)，發(fā)揮腸道保護(hù)作用，黑靈芝多糖通過(guò)下調(diào)門水平Bacteroidetes和屬水平Prevotella、CF231相對(duì)豐度，同時(shí)上調(diào)門水平Firmicutes和Cyanobacteria，屬水平Lactobacillus、Roseburia、Oscillospira、Ruminococcus、Coprococcus、Bifidobacterium相對(duì)豐度，改善2型糖尿病大鼠腸道菌群失調(diào)；3）黑靈芝多糖可以差異性調(diào)節(jié)SCFAs含量，抑制丙酸含量異常升高，同時(shí)促進(jìn)丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸分泌，這可能是通過(guò)調(diào)節(jié)相應(yīng)產(chǎn)酸菌豐度實(shí)現(xiàn)的。以上結(jié)果說(shuō)明黑靈芝多糖對(duì)腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用可能是其發(fā)揮抗糖尿病作用的機(jī)制之一。