孫 慧，付 千，戴晨曦，阿爾斯拉·玉蘇甫，舒廣文，鄧旭坤

（中南民族大學(xué)藥學(xué)院，民族藥學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，湖北 武漢 430074）

馬兜鈴酸I（aristolochic acids I，AAI）是一種能夠?qū)е履I損傷的天然化合物[1]。一般認(rèn)為，AAI所致腎毒性發(fā)生的主要原因是含有AAI的中草藥或中成藥的濫用[2]。在AAI的作用下，腎臟內(nèi)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-6水平提高[3-4]。這將進(jìn)一步導(dǎo)致腎臟內(nèi)氧化應(yīng)激、腎臟顯微結(jié)構(gòu)改變和腎功能異常[5]。由此可見，AAI的腎毒性與該化合物所致的腎內(nèi)炎癥反應(yīng)緊密相關(guān)。

鞣花酸（ellagic acid，EA）是一種廣泛存在于石榴、樹莓、葡萄等水果中的天然多酚類化合物[6-7]。樹莓不同部位中的EA含量差異較大，在10～1 000 μg/g之間[8]。健康人食用800 mg石榴提取物后，血漿中EA的平均質(zhì)量濃度為（33.8±12.7）ng/mL[9]。研究發(fā)現(xiàn)，EA可下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)，降低腎損傷動(dòng)物血清中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子水平并呈現(xiàn)明顯的腎臟保護(hù)活性[10]。EA亦可降低二型糖尿病大鼠體內(nèi)的IL-6、TNF-α、核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor，NF）-κB等炎癥相關(guān)因子的水平并表現(xiàn)出對(duì)胰島素抵抗的改善作用[11]。EA也可以抑制脂肪性肝病小鼠體內(nèi)NF-κB、TNF-α、IL-6和環(huán)氧合酶-2等炎癥相關(guān)因子的表達(dá)并發(fā)揮肝臟保護(hù)活性[12]。不僅如此，EA還可以抑制硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxininteractingprotein，TXNIP）、IL-1β炎癥信號(hào)并起到保護(hù)糖尿病小鼠胰腺的作用[13]。以上研究結(jié)果提示，EA能有效緩解各種病理性臟器內(nèi)炎癥反應(yīng)。另一方面的研究則發(fā)現(xiàn)，EA對(duì)順鉑或四氯化碳誘導(dǎo)的急性腎損傷具有很好的保護(hù)作用[14-15]。然而，目前關(guān)于EA干預(yù)AAI腎毒性的實(shí)驗(yàn)研究還比較缺乏。因此，本研究旨在探討EA對(duì)AAI所致小鼠急性腎損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)昆明小鼠40 只，體質(zhì)量18～22 g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可號(hào)：SCXK（鄂）2016-0003。

EA（純度≥98%） 寶雞市辰光科技有限公司；AAI（純度≥99%） 江蘇永健科技醫(yī)藥有限公司。

尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒、肌酐（creatinine，Cr）試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物技術(shù)研究所； TNF-α、IL-1β試劑盒 武漢貝萊茵生物科技有限公司。蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）和Masson染色試劑盒 南京森貝伽生物科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）、半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-1、IL-1β抗體 武漢愛博泰克生物科技有限公司；NF-κB p65、磷酸化NF-κB（phospho-NF-κB，p-NF-κB）p65、NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）α、磷酸化IκBα（phospho-IκBα，p-IκBα）抗體 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑盒武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TD4型低速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PB100-SP04型組織勻漿器 北京蘭博康斯科技有限公司；熒光顯微鏡 上海光學(xué)儀器廠；7500實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（quantitative polymerase chain reaction，qPCR） 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司；Western blot顯影儀 上海天能公司；電泳儀 北京市六一儀器廠；低溫高速離心機(jī) 美國SCILOGEX公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

小鼠每天給予充足的水和飼料，適應(yīng)性飼喂1 周后開始實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均通過中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查（批文號(hào)：2018-SCUEC-AEC-014）。將40 只昆明小鼠隨機(jī)分為健康組（10 mL/kgmb生理鹽水）、模型組（10 mg/kgmbAAI）、EA低劑量組（10 mg/kgmbAAI＋10 mg/kgmbEA）和EA高劑量組（10 mg/kgmbAAI＋30 mg/kgmbEA），每組10 只，雌雄各半。小鼠按照10 mL/kgmb的給藥體積進(jìn)行給藥，健康組小鼠每天灌胃生理鹽水，持續(xù)12 d。EA不同劑量組小鼠每天灌胃不同劑量的EA，持續(xù)12 d。從第7天開始，模型組和EA組每天腹腔注射AAI，連續(xù)5 d。最后一次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h，然后收集小鼠尿液。麻醉小鼠，眼眶靜脈叢采血并離心得到血清，－80 ℃保存用于生化檢測(cè)。頸椎脫臼處死小鼠，取出其兩側(cè)腎臟，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈、拭干并測(cè)定質(zhì)量，計(jì)算腎臟指數(shù)（腎臟質(zhì)量占體質(zhì)量的百分比）。左腎放入組織固定液中，用于組織病理學(xué)等檢查，右腎儲(chǔ)存在－80 ℃下，用于后續(xù)各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。AAI造模和EA干預(yù)的給藥劑量參考已有的文獻(xiàn)報(bào)道[16-18]。

1.3.2 生理生化指標(biāo)測(cè)定

取小鼠尿液，用Bradford法檢測(cè)尿蛋白質(zhì)量濃度。參考相應(yīng)的試劑盒說明書測(cè)定血清中Cr、BUN、TNF-α和IL-1β的水平以及腎組織中T-SOD、MDA和GSH的水平。

1.3.3 腎組織HE和Masson染色

取小鼠左腎按照HE和Masson染色試劑盒說明書描述的方法操作，在顯微鏡下觀察拍照。

1.3.4 腎組織蛋白的提取及免疫印跡檢測(cè)

取小鼠右腎進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，分析特定蛋白表達(dá)情況。采用蛋白抽提試劑盒按說明提取小鼠腎組織蛋白。免疫印跡的實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[19]。使用p-IκBα、IκBα、p-NF-κB p65、NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、和GAPDH一抗室溫孵育2 h。二抗采用山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗室溫下孵育1 h，然后進(jìn)行顯色，用Image J分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行半定量分析。

1.3.5 qPCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)

取小鼠右腎進(jìn)行特定蛋白的基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)。采用TRIzol試劑盒提取總RNA，然后參考文獻(xiàn)[20]進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光qPCR，擴(kuò)增引物的序列如表1所示。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有顯示的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代表或統(tǒng)計(jì)了至少3 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過單因素方差比較組間差異，通過Dunnett檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 EA對(duì)AAI誘導(dǎo)的腎損傷小鼠腎功能的影響

如表2所示，與健康組相比，模型組小鼠腎臟指數(shù)、尿蛋白以及血清中BUN和Cr水平顯著或極顯著升高（P＜0.05、P＜0.01），說明AAI能夠誘導(dǎo)小鼠腎臟腫大和引起小鼠腎功能異常。與模型組相比，EA預(yù)處理后，小鼠腎臟指數(shù)顯著或極顯著降低（P＜0.05、P＜0.01），尿蛋白以及血清中BUN和Cr水平顯著或極顯著下降（P＜0.05、P＜0.01）。

表2 EA對(duì)AAI誘導(dǎo)的腎損傷小鼠腎功能的影響Table 2 Effect of EA on renal function in mice with AAI-induced renal injury

2.2 EA對(duì)AAI誘導(dǎo)的腎損傷小鼠腎組織病理學(xué)的影響

如圖1A所示，HE染色結(jié)果表明，健康小鼠的腎臟組織結(jié)構(gòu)致密，無充血或水腫，鮮見炎性細(xì)胞浸潤。模型組小鼠腎臟可見明顯的充血與炎性細(xì)胞浸潤。如圖1B所示，Masson染色結(jié)果表明，模型組小鼠腎臟內(nèi)可見明顯的纖維增生。EA可改善AAI所致腎損傷小鼠的腎臟組織病理學(xué)變化。

圖1 EA對(duì)AAI誘導(dǎo)的腎損傷小鼠腎組織病理學(xué)的影響（200×）Fig. 1 Effect of EA on renal histopathology in mice with AAI-induced renal injury (200 ×)

2.3 EA對(duì)AAI誘導(dǎo)的腎損傷小鼠腎臟內(nèi)氧化應(yīng)激的影響

如表3所示，與健康組相比，模型組小鼠腹腔腎內(nèi)的GSH和T-SOD水平較健康小鼠均極顯著降低（P＜0.01），而MDA含量則極顯著升高（P＜0.01），說明在AAI的作用下，小鼠腎內(nèi)發(fā)生了氧化應(yīng)激。與模型組相比，EA高劑量組小鼠腎中MDA含量顯著下降（P＜0.05），GSH和T-SOD水平極顯著升高（P＜0.01）。

表3 EA對(duì)AAI誘導(dǎo)的腎損傷小鼠氧化應(yīng)激的影響Table 3 Effect of EA on oxidative stress in mice with AAI-induced renal injury

2.4 EA對(duì)AAI誘導(dǎo)的腎損傷小鼠炎癥因子的影響

如圖2A、B所示，與健康組相比，模型組小鼠血清中TNF-α和IL-1β水平極顯著上升（P＜0.01）；而與模型組小鼠相比，不同劑量的EA處理則明顯降低小鼠血清中TNF-α和IL-1β的水平。如圖2C、D所示，與健康組相比，模型組小鼠腎臟內(nèi)TNF-α和IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平極顯著升高（P＜0.01）；而與模型組小鼠相比，不同劑量的EA處理可極顯著降低腎中TNF-α和IL-1β編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.01）。

圖2 EA對(duì)AAI誘導(dǎo)的腎損傷小鼠炎癥因子的影響Fig. 2 Effect of EA on inflammatory factors in mice with AAI-induced renal injury

2.5 EA對(duì)腎損傷小鼠腎內(nèi)NF-κB/NLRP3信號(hào)通路的影響

如圖3A所示，與健康組小鼠相比，模型組小鼠腎臟內(nèi)NF-κB p65亞基和IκBα的磷酸化水平（磷酸化蛋白與該蛋白灰度的比值）均極顯著升高（P＜0.01），提示AAI能激活腎臟內(nèi)的NF-κB通路。與模型組相比，不同劑量EA顯著或極顯著地抑制了AAI對(duì)腎內(nèi)NF-κB的激活作用（P＜0.05、P＜0.01）。NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β是NLRP3炎性小體的主要組分，其表達(dá)受NF-κB調(diào)控[21]。如圖3B、C所示，與健康組小鼠相比，AAI顯著上調(diào)了腎內(nèi)NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的轉(zhuǎn)錄和翻譯（P＜0.05）。而EA則能明顯抑制AAI對(duì)NLRP3炎性小體各組分的表達(dá)誘導(dǎo)作用（P＜0.05）。

圖3 EA對(duì)AAI誘導(dǎo)的NF-κB/NLRP3信號(hào)通路的影響Fig. 3 Effect of EA on NF-κB/NLRP3 signaling pathway in mice with renal injury induced by AAI

3 討 論

血清BUN/Cr和尿蛋白水平是臨床常用的腎功能指標(biāo)[22]。與健康組相比，模型組小鼠血清BUN/Cr和尿蛋白水平明顯升高，提示腎損傷模型建立成功；與模型組相比，EA顯著降低了血清BUN/Cr和尿蛋白水平。腎臟HE及Masson染色顯示，AAI可引起腎臟顯微結(jié)構(gòu)改變和腎間質(zhì)纖維化。這和已有文獻(xiàn)的報(bào)道[23]是一致的。EA能明顯緩解AAI誘導(dǎo)的腎臟病理學(xué)變化。腎臟內(nèi)的氧化應(yīng)激在腎損傷發(fā)生發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵性作用。一項(xiàng)臨床研究顯示，阿托伐他汀聯(lián)合前列地爾可有效改善患者的腎臟氧化應(yīng)激，提升腎功能[24]。本研究中，與健康組相比，模型組小鼠的T-SOD和GSH水平顯著降低，MDA水平顯著升高，提示AAI能誘導(dǎo)腎臟內(nèi)的氧化應(yīng)激。而與模型組相比，EA能顯著提高T-SOD活性和GSH含量，降低MDA水平，改善腎臟內(nèi)的氧化應(yīng)激。以上研究結(jié)果提示，EA能有效緩解AAI誘導(dǎo)的小鼠腎損傷。

與健康組相比，模型組小鼠腎臟內(nèi)TNF-α和IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平明顯上升，血清中這兩個(gè)炎癥因子的質(zhì)量濃度也有相應(yīng)的上升。EA則顯著改善了AAI誘導(dǎo)的腎內(nèi)炎癥反應(yīng)。NF-κB是調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)節(jié)因子IκBα的磷酸化有利于NF-κB核心轉(zhuǎn)錄因子p65轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，而NF-κB p65的進(jìn)一步磷酸化則能提高其啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄的能力[25]。在糖尿病腎病小鼠的腎臟中，NF-κB p65、IL-6基因和蛋白的表達(dá)水平異常升高[26]。此外，研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注所致急性腎損傷大鼠的腎組織NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白TNF-α、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達(dá)量顯著上升[27]。以上研究結(jié)果提示，腎臟中NF-κB通路的異常激活與腎損傷的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康組相比，模型組小鼠腎臟內(nèi)IκBα和NF-κB p65亞基的磷酸化水平有明顯提高。提示AAI能激活腎臟內(nèi)的NF-κB通路。有研究表明，關(guān)木通中所含的馬兜鈴酸類化合物能上調(diào)大鼠腎內(nèi)的NF-κB活性[28]，與本研究的結(jié)果一致。與模型組相比，不同劑量的EA干預(yù)后，腎損傷模型小鼠腎內(nèi)NF-κB通路活性明顯下調(diào)。相似地，EA能通過抑制NF-κB減輕炎癥反應(yīng)，從而改善腎缺血再灌注所致的大鼠腎損傷[29]。以上研究結(jié)果提示抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在EA發(fā)揮腎臟保護(hù)活性過程中可能起到了關(guān)鍵性作用。

NF-κB是誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化的關(guān)鍵性上游信號(hào)之一。NLRP3炎癥小體的活化在非病原體感染所致的腎臟內(nèi)炎癥反應(yīng)及其后續(xù)腎損傷過程中起到了重要作用[30]。臨床上糖尿病腎病患者常見外周血NLRP3炎癥小體水平異常[31]。在免疫球蛋白A腎病大鼠血清內(nèi)，也可以檢測(cè)NLRP3的水平顯著升高[32]。給予阿托伐他汀抑制NLRP3炎癥小體的活化則有利于緩解IgA腎病大鼠的腎損傷[33]。相似地，白楊素可抑制NLRP3炎癥小體的活化，減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的小鼠腎損傷[34]；小檗堿可干預(yù)NLRP3炎癥小體活化并改善糖尿病相關(guān)的腎功能低下[35]；降低NLRP3各組分的表達(dá)水平有利于緩解順鉑所致的腎損傷[36]。以上研究結(jié)果提示，抑制NLRP3炎癥小體活化可作為改善腎損傷的一條可行的策略。在小膠質(zhì)細(xì)胞中，EA可抑制NLRP3炎癥小體的激活，緩解細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)毒性[37]。EA還被報(bào)道能夠通過抑制NLRP3炎癥小體活化改善毒物所致的大鼠肺動(dòng)脈高壓[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，在EA的作用下AAI所致腎損傷小鼠腎臟內(nèi)NLRP3炎癥小體各組分的mRNA和蛋白水平均有明顯下降。與此相似的是，有研究表明，細(xì)胞因子IL-22可通過干預(yù)NLRP3炎癥小體的活化緩解AAI所致的腎損傷[39]。以上研究結(jié)果提示，抑制NLRP3炎癥小體可能與EA緩解AAI所致的腎損傷緊密相關(guān)。

綜上所述，從腎臟指數(shù)、尿蛋白水平、血清BUN/Cr水平、腎臟顯微結(jié)構(gòu)、腎臟內(nèi)氧化應(yīng)激程度等多方面指標(biāo)來看，EA能顯著改善AAI引起的小鼠急性腎損傷。進(jìn)一步研究表明，EA能抑制腎損傷模型小鼠腎臟內(nèi)NF-κB通路，下調(diào)NLRP3炎癥小體各組分的表達(dá)，降低炎癥因子TNF-α和IL-1β水平。這提示AAI發(fā)揮腎臟保護(hù)活性的機(jī)制可能與通過靶向NF-κB和NLRP3干預(yù)AAI所致的腎臟內(nèi)炎癥反應(yīng)有關(guān)。有研究表明，EA能顯著降低IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子的水平，從而緩解由D-半乳糖所致衰老大鼠的肝和腦損傷[40]。EA也可以通過干預(yù)環(huán)氧合酶-2炎癥通路緩解酸誘導(dǎo)的急性肺損傷[41]。EA還可以通過抑制MAPK和STAT途徑介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)改善動(dòng)物皮膚損傷[42]。以上研究結(jié)果提示EA對(duì)炎癥性臟器損傷可能具有較為普遍的改善作用。