王霆，贠建民，畢陽(yáng)，艾對(duì)元，趙風(fēng)云，張紊瑋

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，以良好的風(fēng)味和保健功效在全球食用菌生產(chǎn)和消量中占比非常高[1-2]。但在采后流通環(huán)節(jié)中因環(huán)境變化等因素造成其生理失調(diào)和代謝紊亂的現(xiàn)象，使其風(fēng)味劣變，嚴(yán)重影響其商品價(jià)值，已成為制約鮮菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸[3-4]。

目前，食用菌風(fēng)味物質(zhì)方面的研究多集中于對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味成分的研究，例如FANG等[5]通過(guò)固相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(solid phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry technology，SPME/GC-MS)對(duì)納米包裝和普通聚乙烯包裝金針菇揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行比較，結(jié)果表明納米包裝能更好地維持金針菇原有的風(fēng)味；何奎等[6]通過(guò)對(duì)真姬菇的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)真姬菇采后貯藏過(guò)程中1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、正辛醛是其主要的特征風(fēng)味物質(zhì)。食用菌的風(fēng)味品質(zhì)主要由揮發(fā)性的風(fēng)味物質(zhì)和非揮發(fā)性呈味物質(zhì)共同組成，其中風(fēng)味物質(zhì)主要是由含有8個(gè)碳的化合物及其衍生物以及醇、酮、醛等揮發(fā)性風(fēng)味成分組成，這些化合物主要是由其內(nèi)部的脂氧合酶和氫過(guò)氧化物裂解酶催化亞油酸形成的產(chǎn)物，具有濃郁的蘑菇味[7-8]；TSAI等[9]在研究姬松茸、茶樹(shù)菇和牛肝菌中非揮發(fā)性風(fēng)味成分過(guò)程中發(fā)現(xiàn)游離氨基酸、呈味核苷酸和有機(jī)酸等非揮發(fā)性風(fēng)味成為蘑菇提供特有的鮮味和甘甜味，而核苷酸和有機(jī)酸可為其采后的呼吸作用提供所需的能量。但有關(guān)雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和非揮發(fā)性的呈味物質(zhì)的變化規(guī)律鮮有報(bào)道。

為此，本研究基于雙孢蘑菇采后工廠化流通技術(shù)體系，運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)動(dòng)態(tài)跟蹤分析雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程風(fēng)味變化規(guī)律，以期從風(fēng)味品質(zhì)的角度為雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變進(jìn)程進(jìn)行判斷，為雙孢蘑菇采后的品質(zhì)快速檢測(cè)和風(fēng)味鑒定提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢蘑菇：試驗(yàn)所用雙孢蘑菇(A.bisporusA15)，甘肅金沃森生物科技有限公司(中國(guó) 甘肅 靈臺(tái))種植的一潮菇。

試劑：5′-呈味核苷酸(5′-CMP、5′-UMP、5′-GMP、5′-IMP和5′-AMP)標(biāo)品，有機(jī)酸(檸檬酸、蘋(píng)果酸、富馬酸、琥珀酸)標(biāo)準(zhǔn)品均分析純，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

雙孢蘑菇采后挑選蓋3～5 cm，大小均勻，顏色潔白，無(wú)機(jī)械損傷的子實(shí)體置于溫度為(17±1) ℃、相對(duì)濕度為85%～90%的環(huán)境菇房中在放置6 d，用于取樣和檢測(cè)。分別于0、3和6 d進(jìn)行取樣。

1.2.2 揮發(fā)性風(fēng)味測(cè)定

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)參照裴斐[10]的方法進(jìn)行測(cè)定；定性與定量分析參照何奎等[6]的方法進(jìn)行分析；特征揮發(fā)性物質(zhì)的評(píng)價(jià)參照劉登勇等[11]的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.3 非揮發(fā)性風(fēng)味檢測(cè)

游離氨基酸和呈味核苷酸參考馬寧等[12]的方法進(jìn)行測(cè)定；有機(jī)酸參考LI等[13]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010和Origin 9.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和繪制圖表，利用Heatmap 軟件進(jìn)行風(fēng)味熱圖可視化，SPSS 19.0 進(jìn)行顯著性差異及主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性化合物種類(lèi)及含量變化

雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)、總離子流圖及含量如圖1、表1所示。由圖1-a可知，醛類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)隨著采后時(shí)間的延長(zhǎng)先減少后增加；醇類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)逐漸增加；酮類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)逐漸增加，酯類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)在采后品質(zhì)劣變前保持不變，品質(zhì)開(kāi)始發(fā)生劣變后逐漸增加；呋喃類(lèi)的種類(lèi)在整個(gè)品質(zhì)劣變過(guò)程中期保持不變；由圖1-b可知，在雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中，在同一保留時(shí)間，其離子強(qiáng)度(峰高)是不同的，表明同一種揮發(fā)性物質(zhì)在采后品質(zhì)劣變過(guò)程中的含量不同；在同一時(shí)期，不同保留時(shí)間的離子強(qiáng)度(峰高)不同，表明不同的揮發(fā)性物質(zhì)在同一時(shí)期的含量也不同。由表1可知，在雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中共檢測(cè)出38種揮發(fā)性物質(zhì)，其中醛類(lèi)9種、醇類(lèi)13種、酮類(lèi)9種、酯類(lèi)6種、及呋喃類(lèi)1種。雙孢蘑菇中揮發(fā)性物質(zhì)含量與種類(lèi)的多少并不能決定其對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)度的大小，而是由揮發(fā)性物質(zhì)的濃度及感覺(jué)閾值共同決定[14]。

2.2 雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)熱圖分析

為了更進(jìn)一步明確雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化，我們對(duì)香氣含量取以10為底的對(duì)數(shù)，進(jìn)行熱圖聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖2所示。圖中列表示不同揮發(fā)性物質(zhì)，行表示雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變的不同時(shí)期，顏色由綠色到紅色表示揮發(fā)性物質(zhì)的含量由低到高，3個(gè)時(shí)期的揮發(fā)性物質(zhì)的含量差異明顯，根據(jù)采后不同時(shí)期的聚類(lèi)分析可知，第3天和第6天在最小距離水平首先發(fā)生聚類(lèi)，說(shuō)明第3天和第6天的揮發(fā)性物質(zhì)的含量相似度較高，隨著歐氏距離的增加，0 d的才開(kāi)始聚類(lèi)在一起。在雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中，3-辛酮、苯甲醇、辛醇、苯甲醛、1-辛烯-3-醇的顏色較深，說(shuō)明這幾種物質(zhì)在雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中含量均高于其他物質(zhì)。

a-揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)變化；b-揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流圖圖1 雙孢蘑菇采后衰老進(jìn)程中揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)變化和揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流圖Fig.1 Changes of volatile substances in the postharvest aging process of A.bisporus and total ion current diagram of volatile substances

2.3 揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)氣味活度值(relative odor activity value，ROAV)分析

香氣主要取決于揮發(fā)性物質(zhì)成分濃度的高低與閾值的大小，若只是以揮發(fā)性物質(zhì)含量的高低定義該物質(zhì)對(duì)香氣的貢獻(xiàn)是不準(zhǔn)確的[12]，因此，本研究基于揮發(fā)性成分濃度的大小和閾值的高低對(duì)雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中的揮發(fā)性物質(zhì)組分進(jìn)行了ROAV分析，評(píng)分在0.1～1的物質(zhì)對(duì)風(fēng)味起修飾作用，而評(píng)分在1～100的物質(zhì)是影響風(fēng)味的關(guān)鍵性物質(zhì)，結(jié)果如表2所示。雙孢蘑菇采后整個(gè)衰老過(guò)程中ROAV值在1～100的成分共有6種，在0.1～1的共有3種；在整個(gè)衰老過(guò)程中，(E)-2-庚烯醛、異戊醇、1-辛烯-3-醇、3-辛酮、2-十一酮、1-辛烯-3-酮的ROAV評(píng)分均在1～100，因此可以說(shuō)明這些物質(zhì)是雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中的特征性風(fēng)味物質(zhì)；1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、3-辛酮，在雙孢蘑菇采后整個(gè)品質(zhì)劣變過(guò)程中含量增加明顯(ROAV值在1～100)，因此，這幾種物質(zhì)可以作為雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)劣變的關(guān)鍵性揮發(fā)性物質(zhì)。

表1 雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中揮發(fā)性成分的GC-MS檢測(cè)結(jié)果Table 1 GC-MS detection results of volatile components in the quality deterioration of A.bisporus during postharvest

圖2 雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)含量熱圖Fig.2 Heat map of the content of volatile substances in the quality deterioration of A.bisporus during postharvest注：熱圖中藍(lán)紫色表示風(fēng)味物質(zhì)含量為零；顏色由綠色向紅色表示風(fēng)味物質(zhì)含量由低到高的變化

表2 雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)確定Table 2 Determination of key volatile flavor compounds in the process of postharvest quality deterioration of A.bisporus

2.4 揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析

雙孢蘑菇在采后品質(zhì)劣變過(guò)程中形成的香氣成分比較復(fù)雜，因此為了能更直觀地體現(xiàn)此過(guò)程中香氣物質(zhì)間的差異，對(duì)不同時(shí)期的共有組分進(jìn)行了主成分分析(圖3，表3)，以特征值為1進(jìn)行因子抽提，得到PC1和PC2方差貢獻(xiàn)率分別為66.27%、33.73%，完全可以反映原始數(shù)據(jù)的可靠性。其中，PC1中載荷正向最大是B1(異戊醇)，PC1中載荷負(fù)向最大是A1[(E)-2-庚烯醛]，PC2中載荷正向最大是B5(正辛醇)，PC2中載荷負(fù)向最大是B2(2-十一酮)。以上結(jié)果說(shuō)明醇類(lèi)、醛醇和酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)采后雙孢蘑菇品質(zhì)劣變過(guò)程中的風(fēng)味影響最大，其中，異戊醇、(E)-2-庚烯醛、正辛醇、2-十一酮是雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中含量變化最明顯的揮發(fā)性物質(zhì)。因此，可以根據(jù)上述物質(zhì)來(lái)判斷雙孢蘑菇采后品質(zhì)的變化。

圖3 雙孢蘑菇關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分載荷圖Fig.3 Load diagram of principal components of key volatile flavor substances of A.bisporus

表3 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 3 Principal component eigenvalues and variance contribution rates

2.5 雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中非揮發(fā)性物質(zhì)含量的變化

2.5.1 游離氨基酸含量的變化

雙孢蘑菇中游離氨基酸是一類(lèi)非常重要的滋味活性成分，根據(jù)氨基酸的呈味特性，可將其分為鮮味、甜味、苦味和無(wú)味四類(lèi)，其含量的變化會(huì)直接影響雙孢蘑菇的鮮美程度。鮮味氨基酸和甜味氨基酸是蘑菇特殊風(fēng)味的主要組分，而苦味氨基酸是不具有味覺(jué)活性的。隨著雙孢蘑菇子實(shí)體采后品質(zhì)劣變程度的加深，檢測(cè)到雙孢蘑菇中21種游離氨基酸含量的變化，結(jié)果如表4所示。3個(gè)時(shí)期(0、3、6 d)游離氨基酸總量分別為51.65、57.30、54.89 μg/g，由此可知游離氨基酸含量隨雙孢蘑菇子實(shí)體品質(zhì)的劣變呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。

2.5.2 呈味核苷酸含量的變化

雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中的5′-核苷酸含量變化如表5所示。由表5可知，5種5′-核苷酸的含量在采后品質(zhì)劣變過(guò)程中呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，其中5′-CMP的含量最高，變化趨勢(shì)為先升高后降低，在采后第3天時(shí)其含量達(dá)到峰值，5′-UMP、5′-IMP、5′-AMP含量則是呈持續(xù)下降趨勢(shì)，5′-GMP變化趨勢(shì)為先增加后降低。YAMAGUCHI等[21]在食用菌中檢測(cè)到具有呈鮮貢獻(xiàn)的 5′-核苷酸，其中5′-GMP 具有肉香味，是一種風(fēng)味增強(qiáng)劑。對(duì)于呈鮮味核苷酸(5′-GMP、5′-UMP、5′-GMP、5′-IMP、5′-AMP)總含量在0、3、6 d分別為29.05、22.16、13.10 μg/g。由此可見(jiàn)雙孢蘑菇在采后品質(zhì)劣變過(guò)程中的鮮味變化隨采后時(shí)間的延長(zhǎng)，鮮味逐漸降低。

表4 雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中游離氨基酸含量變化 單位：μg/g

表5 雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中呈味核苷酸含量變化 單位：μg/g

2.5.3 有機(jī)酸含量的變化

食用菌中有機(jī)酸是構(gòu)成其風(fēng)味的主要成分之一，也是其他物質(zhì)如氨基酸、揮發(fā)性物質(zhì)等的合成基礎(chǔ)[22]。雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中有機(jī)酸含量變化趨勢(shì)為先升高后降低(表6)，在第3天時(shí)含量達(dá)到峰值(190.26 μg/g)。4種有機(jī)酸中，蘋(píng)果酸、富馬酸、檸檬酸、琥珀酸的變化趨勢(shì)相同，均為先增加后降低，分別在采后第3天含量達(dá)到峰值，分別為 18.51、4.04、37.13、130.58 μg/g。

表6 雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中有機(jī)酸含量變化 單位：μg/g

3 討論

食用菌的風(fēng)味主要由揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分組成，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)如醛類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)物質(zhì)等，對(duì)食用菌的風(fēng)味形成有著重要的作用；非揮發(fā)性物質(zhì)如游離氨基酸、呈味核苷酸、有機(jī)酸等，對(duì)食用菌滋味的形成至關(guān)重要[23]。本研究對(duì)雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中不同時(shí)間樣品的風(fēng)味成分進(jìn)行檢測(cè)分析。

采用SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析，共鑒定出38種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括醛類(lèi)9種、醇類(lèi)13種、酮類(lèi)9種、酯類(lèi)6種、及呋喃類(lèi)1種，其中醛類(lèi)、酮類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)的變化最為明顯。在檢測(cè)到的醇類(lèi)物質(zhì)中，1-辛烯-3-醇的含量最高，這與前人的研究結(jié)果一致[12]。揮發(fā)性香氣成分是雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中品質(zhì)變化的一個(gè)重要方面，通過(guò)對(duì)揮發(fā)性香氣的主成分分析得到醇類(lèi)、醛醇和酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)采后雙孢蘑菇品質(zhì)劣變過(guò)程中的風(fēng)味影響最大，其中，異戊醇、(E)-2-庚烯醛、正辛醇、2-十一酮是雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中含量變化最明顯的揮發(fā)性物質(zhì)，因此以上述幾種風(fēng)味物質(zhì)的變化可為雙孢蘑菇采后品質(zhì)的快速檢測(cè)、風(fēng)味鑒定以及為貨架期的預(yù)測(cè)提供一定的理論依據(jù)。

通過(guò)對(duì)雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中的非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果表明游離氨基酸、呈味核苷酸、有機(jī)酸在采后品質(zhì)劣變過(guò)程中均發(fā)生了顯著的變化。隨著雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變的發(fā)生，游離氨基酸的含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，這與TSENG等[24]研究結(jié)果基本一致。在第3天時(shí)游離氨基酸含量上升可能是由于雙孢蘑菇采后呼吸速率加快，加速了蛋白質(zhì)分解，使游離氨基酸不斷積累，隨后游離氨基酸含量緩慢下降，可能是由于采后其強(qiáng)烈的蒸騰作用使菌體失水過(guò)多，導(dǎo)致氨基酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制，為維持菌體正常生理活動(dòng)加快了消耗以保證能量的供給[25]。在雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中呈味核苷酸含量呈緩慢下降的趨勢(shì)，這與LIU等[26]研究的不同保存方法對(duì)雙孢蘑菇在貯藏過(guò)程中呈味核苷酸含量的變化趨勢(shì)一致。雙孢蘑菇中主要的有機(jī)酸是檸檬酸和琥珀酸，其含量在采后品質(zhì)劣變過(guò)程中呈先升后降的趨勢(shì)，雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中風(fēng)味會(huì)隨之發(fā)生逐漸惡化，這是由于采后品質(zhì)劣變過(guò)程中一些風(fēng)味物質(zhì)含量降低或者逐漸消失，有機(jī)酸和游離氨基酸等風(fēng)味組分的代謝發(fā)生紊亂，最終導(dǎo)致雙孢蘑菇的風(fēng)味品質(zhì)發(fā)生改變[27-28]，雙孢蘑菇的風(fēng)味物質(zhì)逐漸變淡甚至喪失的同時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生異味，這可能是由于原有風(fēng)味物質(zhì)已揮發(fā)或是后期無(wú)法合成，也有可能因采后品質(zhì)劣變導(dǎo)致物質(zhì)代謝異常從而產(chǎn)生異味物質(zhì)[29-30]。

雙孢蘑菇的風(fēng)味的形成是多方面因素共同作用的結(jié)果，雙孢蘑菇在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)積累大量次生代謝產(chǎn)物，如酚類(lèi)、聚酮類(lèi)等，在采后品質(zhì)劣變過(guò)程中，貯藏的環(huán)境條件、腐敗微生物的生長(zhǎng)都是影響雙孢蘑菇采后風(fēng)味和品質(zhì)變化的重要因素。因此，要明確雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中風(fēng)味的變化機(jī)制，還需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量變化存在一定的差異。品質(zhì)劣變初期雙孢蘑菇中揮發(fā)性物質(zhì)主要以醇類(lèi)為主，酮類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)次之，品質(zhì)劣變后期醇類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)物質(zhì)含量上升。醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)物質(zhì)含量的升高對(duì)雙孢蘑菇揮發(fā)性風(fēng)味的變化產(chǎn)生一定的不利影響。雙孢蘑菇采后品質(zhì)劣變過(guò)程中非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律因?yàn)榫哂邢嗨菩裕坞x氨基酸、有機(jī)酸的含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)；呈味核苷酸含量呈緩慢下降的趨勢(shì)。因此，可以依據(jù)采后品質(zhì)劣變過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律區(qū)分雙孢蘑菇樣品，研究結(jié)果為實(shí)現(xiàn)雙孢蘑菇品質(zhì)的快速檢測(cè)、風(fēng)味鑒定及貨架期的預(yù)測(cè)提供一定的理論依據(jù)。