董小艷，劉達(dá)越，徐靈博，顧鈴毓，馬勝超，楊安寧，楊勇，劉云，姜怡鄧*

1寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)代謝性心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川750004；3寧夏血管損傷與修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；4寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；5寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，銀川 750004；6寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院放射科，銀川 750004

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一種含硫氨基酸，在多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4)為脂肪酸結(jié)合蛋白家族的成員，是一種將脂質(zhì)代謝與炎癥緊密聯(lián)系起來(lái)的中間遞質(zhì)[2]，其作用體現(xiàn)在各種脂質(zhì)代謝[3]和心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化[4]中。研究發(fā)現(xiàn)，在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和心外膜脂肪組織中FABP4的表達(dá)升高可抑制心肌細(xì)胞收縮，使心臟收縮和舒張功能下降，影響心室重構(gòu)，與心力衰竭和肥厚性心肌病等心臟疾病的產(chǎn)生和進(jìn)展密切相關(guān)，是評(píng)估心臟疾病的一項(xiàng)潛在的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4過(guò)表達(dá)可引起心肌細(xì)胞損傷、肥大，而沉默F(xiàn)ABP4后可激活PI3K/AKT信號(hào)通路，改善心肌細(xì)胞損傷情況[6]。焦亡是由炎性小體觸發(fā)的炎癥顆粒NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)釋放到細(xì)胞外的細(xì)胞死亡。細(xì)胞焦亡為細(xì)胞炎性壞死，是一種程序性死亡，表現(xiàn)為細(xì)胞不斷脹大直至細(xì)胞膜破裂，其過(guò)程主要依靠炎性小體激活caspase家族的部分蛋白。有研究顯示，F(xiàn)ABP4可激活炎性小體NLRP3，而NLRP3與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[7]。目前關(guān)于細(xì)胞焦亡對(duì)心血管疾病影響的研究主要集中于動(dòng)脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷方面，而對(duì)其他疾病如心律失常、心力衰竭、心肌炎等的研究較少，其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。此外，抑制FABP4可預(yù)防心血管疾病的發(fā)展[8]，但FABP4調(diào)節(jié)心血管疾病的病理生理機(jī)制仍不明確。因此，本研究觀察了FABP4在Hcy誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞焦亡中的作用，旨在為探討Hcy引起心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 恒溫CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司，Hcy(優(yōu)級(jí)純，貨號(hào)：STBJ0903)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司，微量臺(tái)式離心機(jī)(5415D型)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，細(xì)胞全蛋白提取試劑盒(貨號(hào)：P0013F)購(gòu)自上海貝博生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)ABP4引物購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：AJ90851A)、熒光定量PCR試劑盒(貨號(hào)：AJE1566A)購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，F(xiàn)ABP4(12802-1-AP)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，NLRP3(#10151)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，caspase-1(AF5418)、IL-1β(AF5103)購(gòu)自美國(guó)Affinity公司，BMS-309403(HY-101903)抑制劑購(gòu)自美國(guó)MCE公司，內(nèi)參抗體β-actin(AC028)購(gòu)自武漢ABclonal公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇心肌細(xì)胞(H9C2)，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基換液，當(dāng)細(xì)胞密度增長(zhǎng)到70%～80%時(shí)按實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⒓?xì)胞進(jìn)行分組，繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.2 Western blotting檢測(cè)FABP4和焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 將細(xì)胞分為對(duì)照組(0 mmol/L Hcy)和Hcy組(3 mmol/L Hcy)[9]，分別處理24 h。采用總蛋白提取試劑盒提取心肌細(xì)胞總蛋白，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，上樣30 μg，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，100V 1.5 h后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃孵育兔抗鼠FABP4(1:1000)、兔抗鼠NLRP3抗體(1:500)、兔抗鼠caspase-1抗體(1:500)、兔抗鼠IL-1β抗體(1:500)過(guò)夜，第2天洗膜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:5000)，室溫孵育2 h，洗膜3次，加ECL混合溶液，曝光、顯影，以β-actin作為內(nèi)參，保存FABP4、NLRP3、caspase-1與IL-1β實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞中FABP4 mRNA的表達(dá) 細(xì)胞分組同1.2.2，根據(jù)RNA提取試劑盒提取心肌細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件為：37 ℃ 15 min、37 ℃ 5 s，4 ℃保存。通過(guò)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。正向引物序列：3＇-TGTGCAGAAGTGGGATGGAAAGTC-5＇；反向引物序列：3＇-GCAGCATAACTCACCACCACCAG-5＇。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線按照公式2-ΔΔCt計(jì)算FABP4的含量[ΔΔCt=(Ct待測(cè)樣品-CtGAPDH待測(cè)樣品)-(Ct校正樣品-CtGAPDH校正樣品)]。

1.2.4 激光共聚焦觀察焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 為進(jìn)一步證實(shí)Hcy使心肌細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)升高，對(duì)心肌細(xì)胞中NLRP3、caspase-1進(jìn)行雙染，對(duì)IL-1β進(jìn)行單染，觀察心肌細(xì)胞中NLRP3、caspase-1的蛋白表達(dá)和共定位及IL-1β的表達(dá)情況，其中雙染時(shí)綠色代表NLRP3，紅色代表caspase-1，藍(lán)色代表細(xì)胞核，單染時(shí)紅色代表IL-1β，藍(lán)色代表細(xì)胞核。將心肌細(xì)胞接種于激光共聚焦小皿，待細(xì)胞密度達(dá)80%后，用3 mmol/L Hcy處理心肌細(xì)胞，將細(xì)胞分為對(duì)照組(0 mmol/L Hcy)和Hcy組(3 mmol/L Hcy)，24 h后棄去培養(yǎng)基，冷PBS清洗心肌細(xì)胞5 min；4%多聚甲醛固定30 min，10% H2O2作用10 min，PBS洗3次，每次5 min；山羊血清封閉1 h，4 ℃搖床過(guò)夜孵育一抗，第2天回收一抗，PBS 洗3次，每次5 min；室溫孵育二抗2 h，DAPI染色5 min，PBS洗3次；抗熒光淬滅劑封片，采集圖像并保存。

1.2.5 加入FABP4抑制劑(BMS-309403)后焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 將細(xì)胞分為三組：對(duì)照組(0 mmol/L Hcy)、Hcy組(3 mmol/L Hcy)及Hcy+BMS-309403組(3 mmol/L Hcy和50 μmol/L BMS-309403)。培養(yǎng)心肌細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，待細(xì)胞融合達(dá)60%～80%時(shí)，用2.1 ml DMSO溶解BMS-309403制備成5 mmol/L儲(chǔ)備液，分裝保存。在50 ml離心管中將0.25 ml儲(chǔ)備液加入25 ml配好的Hcy培養(yǎng)基，混勻，加入4 ml含抑制劑的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，24 h后取出用于實(shí)驗(yàn)。Western blotting檢測(cè)FABP4和焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，步驟同1.2.2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。測(cè)量結(jié)果均為計(jì)量資料，以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞中NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白的表達(dá)情況 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Hcy組NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05，圖1)。

圖1 Western blotting法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞中NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白的表達(dá)(n=3)Fig.1 Protein expression of NLRP3 (A), caspase-1 (B) and IL-1β (C) in cardiomyocytes of rats (Western blotting, n=3)

2.2 心肌細(xì)胞中FABP4 mRNA和蛋白的表達(dá)情況分別采用qRT-PCR及Western blotting檢測(cè)心肌細(xì)胞中FABP4 mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Hcy組FABP4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯升高(P＜0.05，圖2)。

圖2 兩組大鼠心肌細(xì)胞中FABP4蛋白(A)及mRNA(B)的表達(dá)情況(n=3)Fig.2 Expression of FABP4 protein (A) and mRNA (B) in cardiomyocytes of rats detected with Western blotting and qRT-PCR respectively (n=3)

2.3 大鼠心肌細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Hcy組心肌細(xì)胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)水平均明顯升高(圖3)。

圖3 免疫熒光檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞中NLRP3、caspase-1及IL-1β的表達(dá)情況(激光共聚焦顯微鏡，n=3)Fig.3 Immunofluorescence detection of the expression of NLRP3, caspase-1 and IL-1β in myocardial cells of rats (Laser scanning confocal microscope, n=3)

2.4 抑制FABP4后心肌細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Hcy組及Hcy+BMS-309403組FABP4、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.01或P＜0.05)；與Hc y組比較，Hc y+BMS-309403組FABP4、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)(圖4)。

圖4 BMS-309403對(duì)大鼠心肌細(xì)胞FABP4(A)、NLRP3(B)、caspase-1(C)和IL-1β(D)蛋白表達(dá)的影響(Western blotting, n=3)Fig.4 Effect of inhibitor (BMS-309403) on the protein expression of FABP4 (A), NLRP 3(B), caspase-1 (C) and IL-1β (D) in cardiomyocytes of rats (Western blotting, n=3)

3 討 論

Hcy是維持生命活動(dòng)所必需的生物硫醇，在細(xì)胞內(nèi)具有氧化應(yīng)激和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用[10]。Hcy為半胱氨酸的同系物，是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，可作為多種疾病如心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥、血栓形成和神經(jīng)精神疾病等的標(biāo)志物[1]。既往研究表明，Hcy可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)途徑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞造成不可逆的損傷。也有研究表明，與無(wú)心力衰竭患者相比，慢性心力衰竭患者血中Hcy水平明顯升高，且隨患者病情加重而劇烈增加，可作為慢性心力衰竭診斷及心功能評(píng)價(jià)的依據(jù)[11]。Hcy水平升高不僅可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞損傷，也可直接損傷心肌細(xì)胞，但其具體機(jī)制仍不明確，因此，本研究探討了Hcy對(duì)心肌細(xì)胞焦亡的影響。

焦亡是一種通過(guò)caspase-1介導(dǎo)、以細(xì)胞質(zhì)膜破壞及細(xì)胞成分和促炎性介質(zhì)釋放至胞外為特征的細(xì)胞程序性死亡[12]。細(xì)胞焦亡由細(xì)胞損傷反應(yīng)誘導(dǎo)，是依賴caspase-1活性的炎性程序性死亡。當(dāng)caspase-1蛋白酶活化時(shí)，切割并激活特定的細(xì)胞靶點(diǎn)，包括消皮素D、促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18。消皮素D的N端片段形成質(zhì)膜小孔，引起細(xì)胞質(zhì)的滲漏和細(xì)胞的破裂，釋放IL-1β和IL-18，使炎癥加劇。焦亡引起的過(guò)度炎癥反應(yīng)可加重細(xì)胞損傷，除細(xì)胞凋亡、壞死和自噬之外，其在心肌缺血再灌注損傷中也起著至關(guān)重要的作用[13-14]。有研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死模型中心臟組織中caspase-1酶活性增加、梗死區(qū)域心肌細(xì)胞內(nèi)炎性小體組成成分含量升高，提示利用體外模型的炎性小體經(jīng)典激活方法可使心肌細(xì)胞caspase-1活化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生[15]。本研究發(fā)現(xiàn)Hcy處理后心肌細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白(NLRP3、caspase-1、IL-1β)表達(dá)明顯升高，提示Hcy可明顯促進(jìn)心肌細(xì)胞焦亡的發(fā)生。

目前已在不同組織中發(fā)現(xiàn)了12種FABP，分別為脂肪細(xì)胞型(adipocyte-FABP，A-FABP)、心肌型(heart-FABP，H-FABP)、肝型(liver-FABP，L-FABP)等[16]。FABP4是冠心病穩(wěn)定患者冠狀動(dòng)脈介入治療后復(fù)合心血管事件的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子之一[17]。FABP4是脂質(zhì)代謝的中樞調(diào)節(jié)劑，它作為一種將脂質(zhì)代謝與炎癥聯(lián)系起來(lái)的遞質(zhì)而發(fā)揮作用。據(jù)報(bào)道，心包脂肪組織、脂肪細(xì)胞中的FABPs水平明顯升高，且與肥胖人群的心臟功能障礙相關(guān)[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4可通過(guò)調(diào)節(jié)環(huán)氧合酶2(COX2)和白三烯A4(LTA4)的活性來(lái)調(diào)節(jié)二十烷類化合物的平衡，最終影響巨噬細(xì)胞的功能[18]。也有研究發(fā)現(xiàn)，抑制FABP4可減少脂多糖誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活及IL-17A產(chǎn)生[19]。沉默F(xiàn)ABP4可使脂多糖誘導(dǎo)的caspase-3和caspase-9活性明顯降低，并減少促炎細(xì)胞因子的釋放[20]。本研究結(jié)果顯示，Hcy干預(yù)后，心肌細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、caspase-1及IL-1β表達(dá)水平明顯升高，F(xiàn)ABP4表達(dá)水平也明顯升高。NLRP3是一種新的蛋白復(fù)合體，能適應(yīng)大量的內(nèi)源性和外源性危險(xiǎn)信號(hào)，誘導(dǎo)瞬時(shí)產(chǎn)生IL-18和IL-1β。NLRP3作為代謝紊亂的傳感器，可被FABP4激活，從而促進(jìn)caspase-1、IL-1β的分泌[7]。本研究還發(fā)現(xiàn)，使用FABP4抑制劑BMS-309403后，心肌細(xì)胞中NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯降低，提示FABP4表達(dá)降低可能會(huì)減少心肌細(xì)胞的焦亡，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，抑制FABP4對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。心肌細(xì)胞焦亡參與了多種心血管疾病的進(jìn)程，為干預(yù)心血管疾病尋找可能的靶點(diǎn)提供了新思路。未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步探討抑制FABP4減輕心肌細(xì)胞焦亡的具體機(jī)制。