李紅陽，唐詩聰，趙公芳，牛英杰，李喬亞

1昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院肝膽外科，昆明 650000；2昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，昆明 650000；3昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，昆明 650000

射頻消融(radiofrequency ablation，RFA)是無創(chuàng)性治療中晚期肝癌的新方法，其優(yōu)點(diǎn)包括原位滅活腫瘤、創(chuàng)傷小、恢復(fù)快、僅需局部麻醉、無瘢痕、并發(fā)癥少等，但同時(shí)也存在一些缺陷：由于肋骨遮擋，導(dǎo)致RFA的治療效率降低；肝癌血供豐富，造成RFA熱沉積效率低，聚焦點(diǎn)能量低，從而導(dǎo)致治療效果較差；肝臟隨呼吸運(yùn)動，可能導(dǎo)致射頻定位不準(zhǔn)確，從而出現(xiàn)治療盲區(qū)，造成殘癌的存在[1-3]。超聲波靶向爆破攜藥物/基因納泡技術(shù)(ultrasound targeted nanobubble destruction，UTND)是指當(dāng)攜藥物/基因的納泡造影劑經(jīng)靜脈注射進(jìn)入腫瘤組織時(shí)，可通過超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)及機(jī)械效應(yīng)，擊碎攜藥物/基因的納泡造影劑，使外源性藥物/基因進(jìn)入腫瘤組織，從而徹底殺滅殘余癌細(xì)胞，目前該技術(shù)已成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)[4-5]。從理論上講，載藥的納泡治療系統(tǒng)聯(lián)合RFA可彌補(bǔ)射頻治療的不足，在肝癌治療方面具有較好的應(yīng)用前景，但目前研究尚少。本研究構(gòu)建了RFA治療后殘余肝癌裸鼠模型，并合成包裹5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)的納泡，采用低強(qiáng)度低頻超聲輻照載5-FU的納泡，靶向治療殘余肝癌，分析其對RFA不完全肝癌細(xì)胞的抑制作用，以期為肝癌的無創(chuàng)或微創(chuàng)治療提供新方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞 60只6～8周齡BALB/c裸鼠，體重(18±2) g，雌雄不限，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，混合飼料，隔籠喂養(yǎng)；人肝癌HepG2細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。實(shí)驗(yàn)過程符合國家及單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物的管理和使用規(guī)定。

1.2 主要儀器及試劑 DZC型低頻超聲輻照儀(重慶醫(yī)科大學(xué)超聲研究所研制)；普通超聲儀(德國Siemens公司)；752型紫外分光光度儀(日本島津公司)；Cool-tip射頻消融系統(tǒng)(美國Valleylab公司)；CKX41倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；3000SSA型Malvern激光粒徑測量儀、Zata電位檢測儀(英國Malvern公司)；二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰膽堿、多聚賴氨酸(美國Sigma公司)；二棕櫚酰磷脂酰磷脂酸(瑞士Genzyme公司)；RPMI 1640(美國HyClone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；1:50鼠抗人CD34單克隆抗體(北京中杉生物公司)；SP免疫組化試劑盒(上海碧云天試劑公司)；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(瑞士Roche公司)。

1.3 方法

1.3.1 合成包裹5-FU的納泡 將二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰磷脂酸按合適的濃度混合，加0.5 ml PBS稀釋，制成納泡造影劑。采用親和素-生物素技術(shù)將納泡與5-FU有效結(jié)合，制成包裹5-FU的納泡。

1.3.2 裸鼠移植瘤模型的建立 使用RPMI 1640培養(yǎng)基將處于對數(shù)生長期的人肝癌HepG2細(xì)胞稀釋成濃度為1×108/ml的細(xì)胞懸液，通過臺盼藍(lán)拒染試驗(yàn)檢測其細(xì)胞活性＞90%。于60只裸鼠右側(cè)背部皮下注射0.2 ml的細(xì)胞懸液，密切觀察腫瘤生長情況，6 d后腫瘤形成，直徑達(dá)0.5～1.0 cm，超聲檢查成瘤率為100%。

1.3.3 分組及治療 裸鼠處于仰臥位，用18G穿刺針垂直腫瘤長軸方向刺入腫瘤中心，超聲引導(dǎo)下采用Cool-tip射頻消融系統(tǒng)進(jìn)行冷循環(huán)RFA(射頻功率30 W，持續(xù)消融時(shí)間10 s)，消融后用超聲探查肝癌平均消融約80%。按隨機(jī)數(shù)字表法將60只荷瘤裸鼠均分為生理鹽水組、載5-FU納泡(5-FU)組、非低頻超聲輻照載5-FU納泡(非低頻超聲+5-FU)組、低頻超聲輻照載5-FU納泡(低頻超聲+5-FU)組4組，每組15只。后3組裸鼠經(jīng)尾靜脈注入包裹5-FU的納泡(0.1 μg/μl)，每次200 μl，每3 d注射1次，連續(xù)注射3次。生理鹽水組注入等體積生理鹽水；非低頻超聲+5-FU組輻照頻率為2.5 MHz，聲強(qiáng)為5 W/cm2，輻照時(shí)間5 min；低頻超聲+5-FU組注入納泡后采用超聲監(jiān)測微泡到達(dá)靶組織的情況，調(diào)整輻照頻率為1.0 MHz，聲強(qiáng)為2 W/cm2，輻照時(shí)間5 min。

1.3.4 TUNEL法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡情況 整個(gè)治療結(jié)束后第5天，每組各處死5只荷瘤裸鼠，取其腫瘤組織，固定后常規(guī)石蠟包埋，切片4 μm；經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化等操作后，加入TUNEL反應(yīng)混合液，置于37 ℃孵育1 h。按照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，采用TUNEL法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)。凋亡率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)×100%。陽性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色。

1.3.5 CD34-MVD法檢測腫瘤內(nèi)新生血管密度 按1.3.4中的步驟處理腫瘤組織切片，用檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)處理，于121 ℃環(huán)境中高壓滅菌18 min，自然冷卻后用PBS沖洗3次，每次5 min；用3%H2O2保持5 min，PBS沖洗3次，每次5 min；然后將切片用抗CD34抗體免疫染色并用DAB處理；洗滌、復(fù)染、脫水等。用免疫組化Elivison二步法觀察CD34陽性微血管：首先使用低倍(40～100倍)物鏡觀察染色最強(qiáng)的區(qū)域(熱點(diǎn))，然后使用高倍(200～400倍)物鏡對染色的血管進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算平均微血管密度(MVD)。

1.3.6 荷瘤裸鼠生長情況觀察 除去處死的荷瘤裸鼠，觀察各組剩余荷瘤裸鼠(每組各10只)的生長情況，包括日?；顒忧闆r，進(jìn)食及飲水情況，毛發(fā)、營養(yǎng)及腫瘤轉(zhuǎn)移情況等。在治療后的第7、14、21、28天，通過二維超聲測量各組移植瘤的最長徑(L)及最短徑(W)，并計(jì)算腫瘤體積(V)。V=(L×W2)/2。按如下公式計(jì)算實(shí)體瘤生長抑制率(TGIR)。TGIR(%)=(1－治療組平均腫瘤體積/生理鹽水組平均腫瘤體積)×100%。同時(shí)記錄各組裸鼠的存活時(shí)間，繪制Kaplan-Meier生存曲線。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法分析各組的生存時(shí)間。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組荷瘤裸鼠生長情況 經(jīng)治療后，各組荷瘤裸鼠均表現(xiàn)出不同程度的體重減輕、活動減少、食欲減退等，其中低頻超聲+5-FU組的荷瘤裸鼠生長情況明顯優(yōu)于其他3組。

2.2 各組荷瘤裸鼠腫瘤大小比較 各組裸鼠腫瘤體積均隨時(shí)間延長而逐漸增大，但低頻超聲+5-FU組的腫瘤生長速度明顯低于其他3組，生長抑制率亦明顯低于5-FU組與非低頻超聲+5-FU組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。

表1 各組荷瘤裸鼠治療后腫瘤體積變化(±s，n=10)Tab.1 Comparison of tumor volume after treatment among four groups (±s, n=10)

表1 各組荷瘤裸鼠治療后腫瘤體積變化(±s，n=10)Tab.1 Comparison of tumor volume after treatment among four groups (±s, n=10)

與生理鹽水組比較，(1)P＜0.05；與5-FU組比較，(2)P＜0.05；與非低頻超聲+5-FU組比較，(3)P＜0.05

組別腫瘤體積(mm3)生長抑制率(%)治療后第7天治療后第14天治療后第21天治療后第28天生理鹽水組744.5±49.9870.9±72.01062.5±122.11467.2±127.9-5-FU組618.5±48.4(1)705.9±57.9(1)895.1±90.1(1)1204.0±112.2(1)18.06±2.93非低頻超聲+5-FU組568.2±43.8(1)(2)672.4±53.2(1)830.6±77.2(1)1142.3±101.7(1)22.20±3.69(2)低頻超聲+5-FU組411.1±32.6(1)(2)(3)496.5±36.3(1)(2)(3)618.3±59.6(1)(2)(3)833.3±70.6(1)(2)(3)43.24±2.23(2)(3)F 97.48975.02242.08761.626462.482 P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 荷瘤裸鼠生存時(shí)間比較 低頻超聲+5-FU組荷瘤裸鼠生存時(shí)間明顯長于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

圖1 各組荷瘤裸鼠生存曲線Fig.1 The survival time of tumor-bearing in nude mice

2.4 各組腫瘤細(xì)胞凋亡情況比較 T U N E L法結(jié)果顯示，低頻超聲+5-F U 組腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)(4 3.2%±4.4%)＞非低頻超聲+5-F U 組(31.3%±4.3%)＞5-FU組(20.7%±2.9%)＞生理鹽水組(10.8%±2.4%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=74.549，P＜0.05，圖2)。

圖2 各組殘留肝癌細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis of residual tumor cell in each group

2.5 各組腫瘤內(nèi)新生血管密度比較 低頻超聲+5-FU組瘤體中無明顯CD34染色陽性區(qū)，其余各組瘤體中見多個(gè)CD34染色陽性區(qū)，陽性染色的腫瘤組織較多。低頻超聲+5-FU組MVD[(8.9±1.3)個(gè)/HP]＜非低頻超聲+5-FU組[(20.1±3.2)個(gè)/HP] ＜5-FU組[(25.0±4.2)個(gè)/HP] ＜生理鹽水組[(29.9±2.0)個(gè)/HP]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=48.667，P＜0.05，圖3)。

圖3 各組殘留肝癌組織內(nèi)新生血管密度比較Fig.3 Comparison of neovascularization density in residual tumor tissues of each group

3 討 論

我國肝癌發(fā)病率居全球之首，每年新發(fā)及死亡患者約占全球總數(shù)的一半[6-7]。盡管近年來肝癌根治性切除術(shù)得到了長足發(fā)展[8]，且術(shù)中嚴(yán)格遵循了無瘤原則，但由于術(shù)中擠壓、搬動、腫瘤細(xì)胞微轉(zhuǎn)移及肝癌本身進(jìn)展等多種因素的作用，術(shù)后復(fù)發(fā)往往無法避免，多數(shù)肝癌患者死于腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[9]，即使是完全規(guī)范的治療，5年生存率也僅為47%[10]。小肝癌的5年生存率僅為70%，而復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率卻高達(dá)64%[11]。Shah等[12]認(rèn)為，血管侵犯是肝癌根治性切除術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)的最高危因素，主要包括肝內(nèi)大血管及微血管的侵犯。李傳紅等[13]發(fā)現(xiàn)，術(shù)前甲胎蛋白高水平、乙型肝炎病毒陽性、腫瘤數(shù)目多及吲哚氰綠15 min儲留率(ICGR15)高是肝癌行根治性切除術(shù)后復(fù)發(fā)的高危因素。Melcher等[14]認(rèn)為，腫瘤分化程度及血管侵犯也是肝癌患者行肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)及生存率的獨(dú)立影響因素。

納米載藥系統(tǒng)具有良好的靶向性、可控釋性、生物相容性及物理穩(wěn)定性，已成為當(dāng)今臨床醫(yī)學(xué)研究最熱門的方向之一[15-17]。UTND技術(shù)是攜藥物的納泡經(jīng)靜脈注入體內(nèi)后，當(dāng)超聲儀監(jiān)測到微泡到達(dá)靶組織時(shí)，以超聲波爆破微泡產(chǎn)生“空化效應(yīng)”“聲孔效應(yīng)”，提高細(xì)胞膜的通透性，促使更多藥物通過細(xì)胞膜進(jìn)入靶組織，從而達(dá)到藥物的治療效果[18-19]。目前UTND技術(shù)使用的超聲儀主要是普通超聲儀，其發(fā)出的連續(xù)波并不利于載藥微泡在靶組織器官的灌注，從而導(dǎo)致達(dá)到靶向部位的藥物量較低，而且對正常組織也會產(chǎn)生一系列的生物學(xué)效應(yīng)[20-22]。此外，通過普通超聲儀對載藥微泡進(jìn)行輻照不能從真正意義上保證體內(nèi)定位的精確性，在很大程度上降低了載藥微泡的治療效果。低強(qiáng)度聚焦超聲遵循聚焦超聲原理，其能量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于高強(qiáng)度聚焦超聲，不會產(chǎn)生破壞性的致熱反應(yīng)[23-25]。

本研究選用重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所自制的低強(qiáng)度聚焦超聲作為超聲觸發(fā)設(shè)備，通過低強(qiáng)度聚焦超聲爆破載藥納泡，提高藥物在靶組織的靶向性沉積，并通過降低正常組織的不良反應(yīng)來提高治療效果(圖4)。本研究結(jié)果顯示，低頻超聲+5-FU組的腫瘤生長體積明顯小于其他3組，生存時(shí)間及凋亡指數(shù)也明顯高于其他3組，腫瘤MVD值明顯低于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其機(jī)制可能是低頻超聲波爆破納泡產(chǎn)生的“機(jī)械效應(yīng)”使內(nèi)皮細(xì)胞膜發(fā)生損傷，導(dǎo)致微血栓形成，栓塞腫瘤血管的血液供應(yīng)，使MVD降低，引起局部腫瘤細(xì)胞壞死。此外低頻超聲爆破納泡產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”可增加血管膜通透性，促進(jìn)5-FU的吸收，使5-FU更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)殺滅腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)更多的肝癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而使腫瘤體積縮小，控制腫瘤的生長，從而達(dá)到治療效果。

圖4 低頻超聲輻照載5-氟尿嘧啶的納泡Fig.4 Low frequency ultrasound radiation 5-fluorouracil loaded nanobubbles

綜上所述，低頻超聲輻照載5-FU的納泡治療RFA后裸鼠殘留肝癌時(shí)，可明顯降低肝癌組織內(nèi)的MVD，抑制腫瘤生長。隨著低頻超聲輻照載藥納泡靶向藥物釋放技術(shù)在腫瘤治療方面研究的深入，有望為肝癌提供更加安全、高效，靶向性更強(qiáng)的局部定位控釋治療方法。此外，本研究雖然在一定程度上證實(shí)了低頻超聲輻照載5-FU的納泡對RFA殘留肝癌細(xì)胞的抑制作用，有望為肝癌無創(chuàng)或微創(chuàng)治療提供新方案，但低頻超聲輻照載5-FU納泡的最佳時(shí)間參數(shù)，以及低頻超聲輻照載5-FU的納泡對RFA殘留的肝癌細(xì)胞的具體作用機(jī)制等仍需進(jìn)一步深入研究。