師大亮， 郭敏明， 張偉， 敖存， 崔宏春， 趙蕓， 余繼忠

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 茶葉研究所，浙江 杭州 310024)

隨著人們健康意識的逐步增強(qiáng)和消費理念的不斷改變，茶葉的健康屬性和口感風(fēng)味得到不斷強(qiáng)化，具有不同特色的功能型茶葉日益受到業(yè)內(nèi)專家和廣大消費者的青睞。結(jié)合杭州市茶產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與消費者的需求，圍繞方便化、功能化、特色化開展利用夏秋茶原料加工紅茯茶的工藝研究將是一個具有前瞻性的重要發(fā)展趨勢和迫切需要解決的難題，也是杭州市未來茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展實現(xiàn)擴(kuò)大增強(qiáng)消費需求、茶資源增值增效、茶農(nóng)增產(chǎn)增收的亮點，同時又可為今后夏秋茶資源的綜合利用提供技術(shù)支撐[1-2]。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮葉原料于2020年6月采自杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院茶葉研究所大清谷基地，品種為龍井群體種，采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽二葉及同等嫩度的對夾葉；接種菌液為茶學(xué)實驗室提供的金花茶原料，由本所實驗室純化擴(kuò)繁。接種茯磚原茶來自于安化友福記茶業(yè)有限公司2012年8月生產(chǎn)的手筑茯磚茶，其菌種純化擴(kuò)繁由本所實驗室完成，采用工夫紅茶的加工工藝，烘干和傳統(tǒng)曬干的2種干燥方式，結(jié)合菌液、原茶以及純凈水對照的3種接種方式，完成8只茶樣，以期比較篩選出較優(yōu)的工藝流程及參數(shù)。

1.2 方法

1.2.1 夏秋季紅茶制作工藝

原料→萎凋→揉捻→發(fā)酵→干燥→紅茯茶原料[3]。

1.2.2 菌種的純化與擴(kuò)繁

PDA培養(yǎng)基的制作。稱取馬鈴薯300g，加入純水1 000 mL，煮沸15 min，趁熱雙層紗布過濾，濾液補(bǔ)足1 000 mL，自然pH值。在所得濾液中加入葡萄糖20g、瓊脂15～20 g，攪拌加熱至完全溶解后分裝于錐形瓶中，高壓滅菌鍋121 ℃，20 min滅菌。滅菌完成后分裝至平板，待冷卻凝固得到固體PDA培養(yǎng)基待用。

菌種分離。用無菌接種針挑取茶葉碎片接入PDA培養(yǎng)基中，置28 ℃培養(yǎng)72 h，進(jìn)一步純化后置于28 ℃培養(yǎng)。

菌種純化。將分離菌種進(jìn)一步劃線法培養(yǎng)于PDA培養(yǎng)基，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落生長6～8 d后，挑取孢子繼續(xù)劃線培養(yǎng)于PDA培養(yǎng)基。

菌液制備。無菌條件下刮取平板培養(yǎng)7 d的菌絲體于無菌水中，經(jīng)脫脂棉過濾后得到孢子懸浮液。用血球記數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子懸浮液濃度，使其達(dá)到(1～10)×107個·mL-1。

接種菌液。將裝有紅茶原料的培養(yǎng)瓶在121 ℃條件下滅菌20 min，冷卻后向瓶中接入孢子懸浮液4 mL，封口并搖動培養(yǎng)瓶，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵[4-5]。

1.2.3 夏秋茶原料加工紅茯茶的工藝流程

紅茶原料稱量→汽蒸(0.2 mPa，1 min)→滅菌(高壓滅菌鍋121 ℃，20 min)→接種→封口培養(yǎng)(28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱)→烘干(50 ℃)。

1.2.4 茶樣常規(guī)成分檢測、感官評審、菌種及黃曲霉毒素檢測

菌種鑒定。菌種基因組DNA的提取(刮取菌絲研缽中研碎成粉，用植物基因組試劑盒提取總DNA)；基因擴(kuò)增及測序(采用通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增菌種的ITS區(qū)，25 μL反應(yīng)體系，擴(kuò)增程序為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性50 s，53 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收測序)[6]。

感官審評。按國家茶葉審評標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行審評[7]。

生化成分測定。茶葉氨基酸總量測定采用茚三酮比色法；茶葉水浸出物檢測采用全量法；茶葉咖啡堿測定采用紫外分光光度法；茶葉可溶性糖測定采用蒽酮-硫酸比色法；茶色素測定采用系統(tǒng)分析法[7-9]；黃曲霉毒素檢測采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》(GB 5009.22—2016)第一法。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官審評

由表1可以看出，QSS和QHS金花較顯，具有明顯的菌花香，且總分最高，分別為88.90和88.00；QSC和QHC略有或稍有金花，有較為純正的陳香，總分分別為87.45和86.05；QHCK和QSCK對照的總分分別為83.35和82.70；QSS、QHS、QSC和QHC均明顯優(yōu)于對照；QHJ和QSJ無金花，有明顯的霉味，觸手發(fā)黑，疑似黑曲霉為優(yōu)勢菌，總分分別為74.35和75.75，比對照差。

結(jié)果表明，群體種原料加工的曬青、烘青紅毛茶，采用市面茯磚茶純化菌液和市面茯磚茶的接種方式，參照茯磚的發(fā)花工藝技術(shù)和參數(shù)得出的產(chǎn)品，均可實現(xiàn)具有紅茶及金花菌特有的香氣特征的紅茯茶產(chǎn)品的預(yù)期目標(biāo)，接種市面上購買的茯磚茶提純擴(kuò)繁的菌液優(yōu)于茯磚原茶接種方式；同時對于不同干燥方式的紅毛茶采用不同的接種方式，結(jié)果表明，曬青紅毛茶接種得到的紅茯茶產(chǎn)品優(yōu)于烘青紅毛茶接種產(chǎn)品。究其原因，可能是與烘青毛茶的含水量較曬青毛茶低有關(guān)，不利于金花的生長繁殖。

2.2 常規(guī)成分

由表2可以看出，8只茶樣的水浸出物、咖啡堿、游離氨基酸和茶黃素含量差異不大；可溶性糖含量方面，除茶樣QSS較高外，其余差異不大；茶紅素方面，對照QHCK、QHS和QSCK較高，QHJ和QSJ較低；茶褐素方面，對照QHCK和QSCK含量較低，其他參接種的茶樣的茶褐素含量較高，且其間差異不大。初步研究結(jié)果表明，紅茯茶產(chǎn)品常規(guī)成分檢測中的茶紅素含量與產(chǎn)品品質(zhì)具有較高的相關(guān)性，且呈現(xiàn)正相關(guān)，同時也說明接種菌液與茶紅素的進(jìn)一步氧化聚合形成茶褐素具有一定的相關(guān)性。

表2 紅茯茶茶樣的常規(guī)成分檢測結(jié)果

2.3 黃曲霉毒素含量

對8只茶樣采用GB 5009.22—2016第一法均未檢出黃曲霉毒素B1，表明群體種原料加工的曬青、烘青紅毛茶，采用不同的接種方式，參照茯磚的發(fā)花工藝技術(shù)和參數(shù)得出的產(chǎn)品，均具有相對的安全性。

2.4 菌種

S為市面購買的茯磚茶及純化菌液，該菌株被鑒定為Aspergillus(曲霉屬)，疑似為Aspergilluschevalieri(謝瓦曲霉)。

J為實驗室提供的菌花茶及純化菌液，該菌株被鑒定為Aspergillus(曲霉屬)，推測為Aspergillusniger(黑曲霉)。

對所制茶樣進(jìn)行菌種分離、純化鑒定得出，不同干燥方式的紅茶原料接種市面所購茯茶的菌種參照發(fā)花工藝所制的紅茯茶優(yōu)勢菌種為冠突散囊菌的1種——謝瓦曲霉(Aspergilluschevalieri)，而接種實驗室提供的菌液所制茶樣的優(yōu)勢菌為黑曲霉(Aspergillusniger)。

3 小結(jié)與討論

群體種原料加工的曬青、烘青紅毛茶，采用市面茯磚茶純化菌液和市面茯磚茶的接種方式，參照茯磚的發(fā)花工藝技術(shù)和參數(shù)得出的產(chǎn)品，均可實現(xiàn)具有紅茶及金花菌特有香氣特征的紅茯茶產(chǎn)品的預(yù)期目標(biāo)，接種市面上購買的茯磚茶提純擴(kuò)繁的菌液優(yōu)于茯磚原茶接種方式；同時對于不同干燥方式的紅毛茶采用不同的接種方式，結(jié)果表明，曬青紅毛茶接種得到的紅茯茶產(chǎn)品優(yōu)于烘青紅毛茶接種產(chǎn)品。紅茯茶產(chǎn)品常規(guī)成分檢測中的茶紅素含量與產(chǎn)品品質(zhì)具有較高的相關(guān)性，且呈現(xiàn)正相關(guān)，同時也說明接種菌液與茶紅素的進(jìn)一步氧化聚合形成茶褐素具有一定的相關(guān)性。對所制茶樣采用GB 5009.22—2016第一法均未檢出黃曲霉毒素B1，表明采用不同的接種方式參照茯磚的發(fā)花工藝技術(shù)和參數(shù)得出的產(chǎn)品均具有相對的安全性。對所制茶樣進(jìn)行菌種分離、純化鑒定得出，不同干燥方式的紅茶原料接種市面所購茯茶的菌種參照發(fā)花工藝所制的紅茯茶優(yōu)勢菌種為冠突散囊菌的一種：謝瓦曲霉(Aspergilluschevalieri)。

本項目實施年限僅1年，菌種的純化擴(kuò)繁、試驗小試、工藝優(yōu)化及驗證歷時較長，時間較為倉促，完成了樣品感官評審、黃曲霉毒素、常規(guī)成分及茶樣菌種鑒定的相關(guān)檢測，無法進(jìn)行其他的急性毒性和遺傳毒性等相關(guān)的安全性評價分析，故分析結(jié)果具有一定的局限性。所有的實驗樣品均在實驗室操作完成，如何從實驗室走向車間實現(xiàn)規(guī)?；?、用于指導(dǎo)生產(chǎn)和示范推廣還需一定的過程。另外，本項目主要是以夏秋季原料加工的紅茶散茶作為備用接種材料，對于緊壓茶和陳化茶的接種及相關(guān)工藝參數(shù)缺乏全面系統(tǒng)的研究，因此，圍繞夏秋茶原料和陳化茶的再利用尚有更大的研發(fā)空間。