周俊威， 王強(qiáng)強(qiáng)， 蔡賢雷,3,4， 鄧歡歡,3,4， 李淑娟， 葛利云,3,4*

(1.溫州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院,浙江 溫州 325035； 2.浙江中藍(lán)環(huán)境科技有限公司,浙江 溫州 325000；3.浙南水科學(xué)研究院,浙江 溫州 325035； 4.溫州醫(yī)科大學(xué) 浙江省流域水環(huán)境與健康風(fēng)險(xiǎn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 溫州 325035)

濕地是一種過渡性地帶，處于陸生生態(tài)和水生生態(tài)兩種系統(tǒng)之間[1]。而人工濕地則是指通過人為手段建造的、可以調(diào)節(jié)的工程化濕地系統(tǒng)[2], 因其具有調(diào)節(jié)生態(tài)、效果可靠、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水質(zhì)凈化領(lǐng)域。

人工濕地根據(jù)運(yùn)行中不同的水力方式，分為表面流人工濕地、垂直潛流人工濕地和水平潛流人工濕地。表面流人工濕地存在占地面積大、水力負(fù)荷小、處理能力弱、夏季易滋生蚊蟲等缺點(diǎn)[3]。垂直潛流人工濕地的水質(zhì)凈化能力在這三種類型的人工濕地中是最強(qiáng)的，但是污水的水力流程較短，反硝化作用較弱，且建造成本高、運(yùn)行管理復(fù)雜[4]。水平潛流人工濕地則擁有水力和污染物負(fù)荷大、處理效果好、造價(jià)及管理難度適中等優(yōu)點(diǎn)。

濕地里的植物主要起固定基質(zhì)表面、提供良好過濾條件、防止?jié)竦囟氯蜑槲⑸锾峁┝己酶凯h(huán)境等功能[5]。在我國南方地區(qū),濕地植物選擇范圍大,美人蕉、再力花等很多常見植物在富營養(yǎng)化治理生態(tài)工程中都有被應(yīng)用[6],張韻[7]通過黃菖蒲、石菖蒲、梭魚草、再力花、美人蕉和風(fēng)車草這6種濕地植物對(duì)受污染水體凈化能力的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn), 風(fēng)車草生長(zhǎng)快速、耐寒性好且去除率最高，更適合用于水污染治理。因此，本研究選取風(fēng)車草做為實(shí)驗(yàn)植物。

綜合考慮后本次實(shí)驗(yàn)以人工水平潛流濕地作為研究對(duì)象，比較種植風(fēng)車草和未種植風(fēng)車草對(duì)人工濕地礫石表面基質(zhì)微生物的影響。由于被采集樣品所處環(huán)境的不同，各組別間的微生物種類和組成可能存在部分差異[8]。微生物群落的不同也許會(huì)影響人工濕地的凈化過程，從而導(dǎo)致不同的凈化表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)細(xì)菌16S rDNA基因進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，比對(duì)不同人工濕地環(huán)境下微生物的多樣性，研究其菌群結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)菌種，挑選出合適的人工濕地類型，并為今后的人工濕地方案設(shè)計(jì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 處理與樣品采集

人工水平潛流濕地由PVC板搭建而成，內(nèi)部填充礫石(直徑4～6 mm)構(gòu)成填料基質(zhì)。風(fēng)車草的種植密度約為25株每平方米，該設(shè)備已運(yùn)行3 a以上[9]。依照隨機(jī)均衡的原則，在人工濕地選取4個(gè)采樣點(diǎn)，采集樣品為礫石表面基質(zhì)，同時(shí)依據(jù)是否種植風(fēng)車草分別建組，將未種植風(fēng)車草的人工濕地組命名為B組，樣品名為B1、B3、B7、B9，將種植風(fēng)車草的人工濕地組命名為C組，樣品名為C1、C3、C7、C9。

1.2 樣品分析

取1 g樣本，采用DNA 提取試劑盒(OMEGA E.Z.N.A.?Soil DNA Kit)根據(jù)使用說明進(jìn)行DNA提取，同時(shí)利用微型熒光計(jì)(Turner Biosystems,TBS380) 結(jié)合DNA檢測(cè)試劑盒(Solarbio，PicoGreen)檢測(cè)提取 DNA 的濃度和純度。然后根據(jù)濃度檢測(cè)結(jié)果，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA 樣品的完整性，電壓為 120 V，電泳時(shí)間約為 20 min。

選用16S rRNA V4 可變區(qū)的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物分別為563F (5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′)和802R (5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′)，94 ℃預(yù)變性4 min，變性30 s，50 ℃退火30 s，循環(huán)25次，72 ℃延伸30 s，72 ℃最終延伸5 min，10 ℃終止保存。擴(kuò)增結(jié)果用凝膠回收試劑盒來回收片段，委托上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行Illumina高通量測(cè)序。

在派森諾平臺(tái)上用Flash[10]軟件進(jìn)行質(zhì)控，利用QIIME2[11]軟件過濾、拼接和去除嵌合體；利用RDP-classifier[12]貝葉斯算法對(duì)0.97[13]相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析；最后根據(jù)樣品OTU數(shù)據(jù)計(jì)算α多樣性獲得相關(guān)指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用STAMP[14]軟件采用Welch’s t-test進(jìn)行2個(gè)組別間的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，并繪制Extended error bar誤差線圖，分析各分類水平下組間的差異顯著性；用Excel軟件對(duì)B組和C組的多樣性指數(shù)進(jìn)行單因素方差分析；用Past[15]軟件在OTU水平利用UPGMA算法采用Bray-Curtis作為相似性測(cè)度進(jìn)行聚類分析，并通過ANOSIM分析檢測(cè)B組和C組的相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性

在0.97分類水平上，基質(zhì)樣品的α-多樣性指數(shù)如表1所示。所采集的全部樣品的微生物覆蓋率均大于94%，表明樣本內(nèi)基因序列被檢出的概率很高，測(cè)序結(jié)果可靠，可以用來準(zhǔn)確地反映樣品的情況。

表1 B組和C組樣品的多樣性指數(shù)

序列數(shù)據(jù)質(zhì)控后，共獲得304 277條序列長(zhǎng)度大于200 bp的有效序列，其中B組含優(yōu)質(zhì)序列153 952條，C組含優(yōu)質(zhì)序列150 326條，樣品的優(yōu)質(zhì)序列長(zhǎng)度主要分布在223～230 bp。

從表1樣品的多樣性分析結(jié)果看，不同組別的微生物多樣性存在差異。ACE、Chao、Simpson和Shannon指數(shù)均用于描述樣品的細(xì)菌群落多樣性，指數(shù)越大，表明其群落豐富度越高[16]。細(xì)菌的多樣性和豐度指數(shù)基本與OTU數(shù)據(jù)變化相一致，C組樣品中微生物的Chao 指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)皆高于B組，且OTU數(shù)量也更多，表明C組樣品中的菌群物種較多，豐富度較高。

2.2 群落結(jié)構(gòu)

表2展示了不同組別豐度占比排列前13位的門水平微生物群落分布情況。將門水平相對(duì)豐度小于0.5%的菌門歸類為其他。其中變形菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、綠菌門等相對(duì)豐度較高，為優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)豐度占比分別是37.32%、16.66%、10.95%、8.68%，占總量的73.61%。

表2 B組和C組樣品微生物門水平的相對(duì)豐度

在門和屬水平層次上對(duì)B組和C組的同類OTU聚類，進(jìn)行組間顯著性差異分析并繪圖，P值小于0.05的認(rèn)定為存在顯著差異，其中前15個(gè)優(yōu)勢(shì)屬及優(yōu)勢(shì)門詳見圖1及圖2。由圖可知，在門水平上，變形菌門的相對(duì)豐度最高，放線菌門和衣原體門具有顯著差異性；在屬水平上，綠菌屬的相對(duì)豐度最高，紅游動(dòng)菌屬具有顯著差異性。

*—差異顯著(P<0.05)。圖2 同。圖1 B組和C組門水平的豐度差異性分析

圖2 B組和C組屬水平的豐度差異性分析

2.3 聚類

基于OTU數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析后得到圖3。樹枝的長(zhǎng)度以及寬度分別表示不同樣品之間的距離和遠(yuǎn)近，在相似度接近的情況下，距離會(huì)越小[17]。通過樣品的聚集樹可以表明，種植風(fēng)車草組與未種植風(fēng)車草組基質(zhì)菌落都具有明顯的聚類特征。B組與C組OTU經(jīng)相似性分析得出R值為0.458 3，P值為0.033?？傮w上看，種植風(fēng)車草組和未種植風(fēng)車草組存在差異，聚集成了2個(gè)互相獨(dú)立的大組。

圖3 B組和C組OTU水平的聚類分析

3 討論

人工濕地是城市內(nèi)進(jìn)行水質(zhì)凈化的新興力量，人工濕地基質(zhì)微生物的群落結(jié)構(gòu)與多種因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)比有無種植風(fēng)車草情況下礫石表面基質(zhì)生物膜的群落構(gòu)成差異，運(yùn)用16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)濕地基質(zhì)微生物多樣性進(jìn)行了探究。研究的結(jié)果顯示，風(fēng)車草會(huì)對(duì)濕地基質(zhì)微生物群落的組成產(chǎn)生影響。

3.1 風(fēng)車草對(duì)人工濕地微生物多樣性的影響

本研究結(jié)果表明，種植風(fēng)車草組微生物豐富度和多樣性高于未種植風(fēng)車草組。這和王芬等[18]關(guān)于植物根際與非根際菌群分析的研究結(jié)論相似。濕地是碳氮循環(huán)的重要發(fā)生場(chǎng)所。濕地基質(zhì)表面微生物的群落結(jié)構(gòu)差異除與基質(zhì)有關(guān)，還會(huì)受植物理化性質(zhì)的影響[19-20]。植物作為影響人工濕地微生物群落結(jié)構(gòu)的因素之一，除根際碳沉積作用外，根系泌氧也會(huì)對(duì)微生物碳源代謝活性產(chǎn)生影響[21]。植物通過將光合作用產(chǎn)生的氧氣輸送至根區(qū)，可在根際土壤中創(chuàng)造好氧環(huán)境，為微生物提供氧氣，促進(jìn)微生物生長(zhǎng)繁殖[22]。另外植物根系及其分泌物可以支持微生物的生長(zhǎng)。相關(guān)資料表明，植物根系能釋放多種化合物, 這些物質(zhì)包含高分子量的多聚糖和低分子量的有機(jī)物[23]，而這些有機(jī)物正是微生物生長(zhǎng)繁殖所需的。因此，人工濕地微生物的多樣性與植物存在密切關(guān)聯(lián)，從而形成了不同的微生物群落特性。

3.2 風(fēng)車草對(duì)人工濕地微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2種人工濕地基質(zhì)優(yōu)勢(shì)菌群皆為變形菌門、綠彎菌門、厚壁菌門等，姜磊等[24]在對(duì)植被恢復(fù)的巖溶濕地沉積物細(xì)菌群落的研究中也有相似的結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)中，2個(gè)組別的變形菌門相對(duì)豐度平均都在35%以上且組間差異不明顯，表明變形菌門的菌類在人工濕地生態(tài)環(huán)境構(gòu)筑和物質(zhì)循環(huán)里發(fā)揮了重要功能，也側(cè)面論證了An等[25]關(guān)于不同類型的濕地中菌落結(jié)構(gòu)具有一定相似性的觀點(diǎn)。另外在群落結(jié)構(gòu)中進(jìn)行豐度差異分析時(shí)，在門水平上，放線菌門和衣原體門的豐度在2組間具有顯著差異性。放線菌屬于革蘭氏陽性菌且具有分解纖維素的能力[26]，而植物在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生正常的植株枯死葉片凋落現(xiàn)象，為放線菌提供底物條件，這或是使其相對(duì)豐度顯著高于無植物組的原因。衣原體是一類專性真核細(xì)胞內(nèi)寄生、可以在多種真核生物宿主 (包括人、動(dòng)物、原蟲等) 中繁殖的無運(yùn)動(dòng)能力的細(xì)菌[27]。而根際內(nèi)聚集的大量真菌為土壤動(dòng)物提供了豐富的食物來源[28]，也因此吸引了眾多的土壤動(dòng)物成為衣原體的宿主，使得衣原體門相對(duì)豐度得以提高。在屬水平上，2組間紅游動(dòng)菌屬的豐度具有顯著差異。在關(guān)于裸土和種植有西洋參的根際土壤菌落研究中也存在類似現(xiàn)象[29]，后續(xù)研究中或可以繼續(xù)進(jìn)行關(guān)注。

4 小結(jié)

植物在人工濕地系統(tǒng)內(nèi)扮演著重要角色，且對(duì)人工濕地基質(zhì)微生物組成產(chǎn)生了直接或間接的影響。

種植風(fēng)車草可提高人工濕地基質(zhì)表面微生物群落的α多樣性。

種植風(fēng)車草使得人工濕地基質(zhì)微生物群落組成與無種植風(fēng)車草情況相比差異顯著，群落組成差異比較分析顯示：門水平放線菌門和衣原體門、屬水平紅游動(dòng)菌屬在有無種植風(fēng)車草情況下差異顯著。