李承秀， 程甜甜， 燕語， 孫忠奎， 喬謙,3， 于永暢,4， 張林*

(1.泰安市泰山林業(yè)科學研究院，山東 泰安 271000； 2.泰安時代園林科技開發(fā)有限公司，山東 泰安 271000；3.山東省果樹研究所，山東 泰安 271000； 4.泰山學院，山東 泰安 271000)

流蘇(Chionanthusretusus)為木犀科流蘇屬落葉喬木，又名糯米條、糯米茶，樹形高大優(yōu)美，枝葉茂盛，初夏滿樹白花，如覆霜蓋雪，清麗宜人，秋季滿樹金黃，別有一番景致，適宜在園林綠地觀賞，同時具有入藥和制茶等多種價值，也常作為嫁接桂花的砧木[1-3]。流蘇是我國珍貴的鄉(xiāng)土樹種，為國家二級保護植物，在我國生態(tài)地理分布廣，主產(chǎn)黃河中下游及以南地區(qū)，遍布甘肅、陜西、山西、河北、山東、河南、云南、四川、廣東、福建、臺灣等地[1,4-6]，潛在種質(zhì)資源豐富，自然變異類型多，但目前開展的現(xiàn)代育種工作較少，選育的園藝品種較少，主要有春雪[7]、扭葉流蘇[8]，以及產(chǎn)于臺灣的變種齒葉流蘇[9]。由此可見，加強種質(zhì)資源創(chuàng)制與新品種培育對于流蘇相關研究與產(chǎn)業(yè)發(fā)展尤為迫切。

多倍體育種受到廣大育種家的重視，多倍化可以增強植物的適應性和競爭力，表現(xiàn)出粗大、健壯、抗逆性強等特性。1937年秋水仙素誘導植物多倍體之后，有關多倍體誘導成功的報道層出不窮[10-11]，在蔬菜、作物、果樹、花卉[12-15]中應用較廣，也逐步應用到楊樹、橡膠樹、桑樹等林木倍性育種工作中[10]，但在園林綠化樹種中應用較少，尚未見到關于流蘇多倍體育種的研究報道。因此，本研究以前期紫薇[16]、青檀[17]等樹種的多倍體育種研究為基礎，開展流蘇多倍體育種試驗，以期獲得流蘇的優(yōu)異種質(zhì)資源，拓寬培育流蘇新品種的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2015—2017年在泰山林業(yè)科學研究院溫室內(nèi)進行。供試材料來自泰安市鄉(xiāng)土觀賞樹種國家林木種質(zhì)資源庫的流蘇L-7單株種子。

1.2 方法

1.2.1 多倍體誘導

試驗采用化學誘變與負壓相結(jié)合的形式。將上年秋季收集的流蘇種子沙藏，于翌年春季挑取剛露芽的幼苗，將其置于裝有秋水仙素的培養(yǎng)皿中，并將培養(yǎng)皿置于負壓泵內(nèi)，在95 kPa負壓條件下處理一定時間，處理結(jié)束后種植于50孔的穴盤中，待幼苗長到4～5片葉時移栽上盆。秋水仙素濃度設為0.2%、0.6%、1.0%、1.4%，負壓時間設為5、10、15 min，每處理100株，重復3次。

1.2.2 多倍體鑒定

參照青檀多倍體鑒定方法[17]。摘取待測流蘇葉片，采用流式細胞儀對樣品染色體倍性進行鑒定，采用常規(guī)莖尖壓片法對二倍體及疑似四倍體流蘇幼苗莖尖染色體數(shù)目進行鑒定，在ZEISS光學顯微鏡下觀察并成像。

1.3 統(tǒng)計

統(tǒng)計幼苗死亡數(shù)與形態(tài)變異株數(shù)，以未處理為對照，將葉片粗糙、變厚、葉色加深、植物矮小[14,17]視為變異植株。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素對流蘇幼苗的誘導效果

不同濃度秋水仙素和負壓時間處理對流蘇的成活率和形態(tài)變異率產(chǎn)生不同程度的影響。表1顯示，0.2%秋水仙素濃度處理的死亡率與對照間無顯著差異，隨著濃度的升高，死亡率明顯升高，濃度大于1.0%時各處理的死亡率相比對照均呈顯著性差異，其中，1.4%濃度、負壓15 min處理下的死亡率達到最高。

與死亡率的規(guī)律不同，形態(tài)變異率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在1.0%濃度、負壓10 min處理下達到最高值，隨著濃度的升高，變異率降至與對照相同的水平。

就負壓時間來看，在相同秋水仙素濃度處理下，死亡率與負壓時間未表現(xiàn)出明顯的變化關系，而10 min負壓處理時的形態(tài)變異率最大。綜合考慮認為，流蘇多倍體誘導應以0.6%～1.0%濃度的秋水仙素及負壓10 min為宜。

表1 不同秋水仙素濃度和負壓時間對流蘇 幼苗的誘導效果

2.2 變異植株DNA含量和細胞染色體數(shù)目的鑒定

采用流式細胞儀對二倍體流蘇植株和疑似四倍體的植株進行細胞DNA含量檢測。

圖1顯示，二倍體植株在相對熒光強度為40時達最高峰，疑似四倍體植株在相對熒光強度為80時具有最高峰，表明其細胞中DNA含量較普通二倍體增加1倍，由此可初步判定該植株為四倍體流蘇。

圖1 不同倍性流蘇流式細胞儀鑒定

為進一步確定疑似四倍體植株的倍性，采用常規(guī)壓片法對流蘇普通二倍體植株和誘導產(chǎn)生的疑似四倍體植株進行莖尖染色體檢測(圖2)。經(jīng)染色體計數(shù)鑒定，普通二倍體植株染色體數(shù)目為2n=2x=46，疑似四倍體植株為2n=4x=92。通過2種方法，從109株形態(tài)變異植株中鑒定出4個四倍體植株，其余均為二倍體，四倍體變異成功率僅3.67%。

圖2 不同倍性流蘇莖尖染色體觀察

2.3 變異植株形態(tài)特征差異

將誘導產(chǎn)生的四倍體流蘇與普通二倍體流蘇同時移栽至保護地種植。圖3顯示，兩者在外部形態(tài)上具有明顯差異。四倍體植株整體表現(xiàn)為植株高大、葉片變厚、葉色加深、莖稈粗壯等特點。同一葉位，四倍體植株的葉片明顯大于二倍體植株，葉色明顯變深，葉片也明顯變厚，革質(zhì)化程度高。二年生植株的同一位置上，四倍體植株莖粗為1.1 cm，而二倍體植株僅0.5 cm；四倍體植株的芽鱗明顯膨大，皮孔較二倍體變得大而稀疏。

圖3 不同倍性流蘇形態(tài)特征

3 小結(jié)與討論

大量研究表明，利用秋水仙素可成功誘導多倍體的產(chǎn)生，且已廣泛應用于植物新品種培育中，尤其是農(nóng)作物的倍性育種中，也是林木與花卉新種質(zhì)創(chuàng)制的重要手段，如紅掌、彩色馬蹄蓮、非洲菊、楊樹、桑樹、橡膠、刺槐、榿木、樺木、相思、枸杞、杜仲等[10-11,15,18-19]。本課題組前期采用秋水仙素處理青檀[16]、紫薇[17]也均成功獲得多倍體植株。目前，秋水仙素人工誘導多倍體多采用莖尖連續(xù)點藥的方法[20-21]，表明此法較大程度降低了幼苗成活率，且需連續(xù)多次點藥，費時費工。基于前期工作的經(jīng)驗，本試驗采用化學誘變與負壓相結(jié)合的方法處理流蘇幼苗，結(jié)果表明，可有效降低幼苗死亡率，流蘇死亡率最高僅為12%，且時間短，僅需10 min負壓即可有效獲得變異植株?？赏茝V應用于植物倍性育種工作中，尤其適用于野生珍稀瀕危植物的種質(zhì)創(chuàng)制。

本試驗也存在不足之處。通過對變異率的計算認為，秋水仙素適宜濃度為0.6%～1.0%，需對施藥區(qū)間進一步細化，探索最佳濃度。同時，本試驗所得最高變異率(6.67%)遠低于紫薇(40%)[16]、青檀(34.2%)[17]、茶樹(40%)[22]、山楊(33.3%)[23]等林木普通點藥處理，與香樟(12%)[24]、皺皮木瓜(9.09%)[25]、棗樹(4.33%)[26]等相當，物種類別與施藥方法是否為導致差異之大的主導因素還需深入探究，并提出相應的解決措施，從而提升此方法誘導多倍體的成功率。

與普通二倍體相比，多倍體常具有巨大性的特點，如莖稈粗壯，葉片、果實、種子等比較大。本試驗所得四倍體流蘇也具有巨大性特點，同時期四倍體流蘇植株在外部形態(tài)上明顯大于二倍體植株，且長勢旺。據(jù)Frary等[27-28]報道，一些基因具有等位劑量效應，這些基因的高水平表達會導致植物葉、花、果的增大，四倍體流蘇的巨大性可能與其內(nèi)部某些基因的高水平表達有關，具體還需進一步研究確定。同時，四倍體常表現(xiàn)出優(yōu)于二倍體的抗逆性。流蘇作為一種珍貴的鄉(xiāng)土樹種，常應用于荒山造林中，若四倍體流蘇能體現(xiàn)出更強的抗逆性，可極大的提高造林成活率與綠化率，降低造林成本，對四倍體流蘇的生長發(fā)育、生理特性、抗逆性等展開全面細致的研究將是下一步的工作方向。