吳 婷，李萬(wàn)敏，李勛章，邸 學(xué)，王海波

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)是一種進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，易發(fā)于老年人群。該病臨床主要表現(xiàn)為記憶力衰退、認(rèn)知功能障礙、行為障礙、判斷能力及性格行為異常等。目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制包括β淀粉樣蛋白沉積、tau蛋白過(guò)度磷酸化、炎癥反應(yīng)、膽堿能缺失、氧化應(yīng)激、金屬離子紊亂、胰島素抵抗、粒體功能障礙及菌群-腸-腦軸失調(diào)等[1-2]。

在中醫(yī)學(xué)中，AD歸屬于“癡呆”“呆病”等范疇，常以“益氣健脾、化痰開竅”“活血化瘀、豁痰開竅”等治法進(jìn)行治療，常用方劑包括地黃飲子、開心散及當(dāng)歸芍藥散等[3]。經(jīng)典方劑開心散、地黃飲子等古方中以茯苓、石菖蒲配伍使用，而現(xiàn)代腦腸軸理論為其應(yīng)用機(jī)制提供了新闡述。腦腸軸是腦-腸相互作用雙向調(diào)節(jié)軸，其上行調(diào)節(jié)的途徑包括神經(jīng)途徑、體液途徑和免疫途徑[4]，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)在很多方面與胃腸道神經(jīng)系統(tǒng)互相鏈接的表現(xiàn)[5]。腸道可以參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制，如益生元、益生菌等可引起tau蛋白過(guò)度磷酸化、β-淀粉樣蛋白沉積等與神經(jīng)系統(tǒng)病變相關(guān)反應(yīng)[6]。因此，分析常配伍使用的調(diào)理胃腸藥物茯苓與醒神開竅藥物石菖蒲的聯(lián)合作用機(jī)制，有助于AD治療創(chuàng)新藥物的研發(fā)。

石菖蒲屬開竅藥，為天南星科植物石菖蒲(AcortwtatarinowiiSchott)的干燥根莖，其味苦，微辛，入心、胃經(jīng)，具有化濕開胃、開竅豁痰、醒神益智之功效，對(duì)心腎失養(yǎng)所致的耳鳴、失眠、健忘有療效，常作為治療腦病的必備藥物[7]。茯苓為多孔菌科真菌茯苓(Poriacocos(Schw.) Wolf)的干燥菌核，其性平，味甘、淡，入心、肺、脾、腎經(jīng)，具有利水滲濕、健脾、寧心之功效，還具有利尿、抗腫瘤、抗菌、改善記憶及抗氧化的藥理作用[8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合多學(xué)科技術(shù)及內(nèi)容，構(gòu)建、整合“疾病-表型-基因-藥物”多層次網(wǎng)絡(luò)[9]，與中藥多組分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同調(diào)節(jié)的作用模式極為相關(guān)[10]。因此，基于腦腸軸理論，以石菖蒲醒神開竅作用于“腦”及茯苓利水滲濕健脾功效為探討對(duì)象，開展網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，分析石菖蒲-茯苓合用治療AD疾病的中樞神經(jīng)系統(tǒng)與胃腸道作用的綜合機(jī)制，為今后治療AD疾病提供新參考。

1 材料

數(shù)據(jù)庫(kù)：中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/443027)，SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//swisstargetprediction.ch/)，STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//string-db.org)，DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.disgenet.org/search)，DrawVen nDiagram數(shù)據(jù)庫(kù)(bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.kegg，jp)，DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//david.ncifcrf.gov)，Omicshare在線平臺(tái)(https：//www.omicshare.com/)。

2 方法與結(jié)果

2.1 石菖蒲-茯苓活性成分篩選

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“石菖蒲”和“茯苓”化學(xué)成分，得到石菖蒲的化合物105個(gè)，茯苓的化合物34個(gè)。以口服生物利用度(OB)值≥30%，類藥性(DL)值≥0.1為條件進(jìn)行篩選，得到31個(gè)候選化合物，見表1。

表1 石菖蒲(A)-茯苓(P)的活性化合物

2.2 候選化學(xué)成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

經(jīng)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)及TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析得到化合物的基因靶點(diǎn)，對(duì)比、去重，得到486個(gè)基因靶點(diǎn)。

2.3 獲取AD相關(guān)靶點(diǎn)

通過(guò)DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Alzheimer’s disease”為關(guān)鍵詞，檢索到AD相關(guān)靶點(diǎn)3 397個(gè)。

2.4 中藥藥對(duì)-疾病靶點(diǎn)構(gòu)建

將“2.2”項(xiàng)中所得化合物預(yù)測(cè)基因靶點(diǎn)與“2.3”項(xiàng)中的疾病基因靶點(diǎn)導(dǎo)入DrawVennDiagram數(shù)據(jù)庫(kù)，繪制韋恩圖，獲得石菖蒲-茯苓藥對(duì)作用于AD疾病的潛在基因靶點(diǎn)，確定石菖蒲-茯苓藥對(duì)作用于AD疾病的潛在作用基因靶點(diǎn)為286個(gè)，見圖1。

圖1 中藥藥對(duì)-疾病靶點(diǎn)

2.5 靶點(diǎn)KEGG通路分析

將“2.4”項(xiàng)中交集靶點(diǎn)分別輸入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)和STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行KEGG通路富集及靶點(diǎn)基因的相互作用分析。

富集到通路為130條，以基因數(shù)為篩選條件，選擇癌癥通路(Pathways in cancer)、刺激神經(jīng)組織的配體受體交互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)通路及PI3K-Akt信息通路(PI3K-Akt signaling pathway)等10條通路，見表2。利用Omicshare在線平臺(tái)繪制前10條KEGG網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。Degree>4的主要通路為PI3K-Akt signaling pathway和Calcium signaling pathway。而4條以上通路出現(xiàn)基因互擾作用有32個(gè)，其中有MAPK3、CHRM1、MAPK8及ADORA2A等7個(gè)基因是石菖蒲與茯苓化合物共同通過(guò)不同通路作用于AD疾病的主要基因靶點(diǎn)，見表3。

圖2 KEGG網(wǎng)絡(luò)分析

表2 石菖蒲-茯苓治療AD潛在基因靶點(diǎn)的主要通路

表3 石菖蒲-茯苓作用通路共同基因

靶點(diǎn)基因相互作用分析，選擇Homo sapiens，設(shè)置參數(shù)值high confidence(0.70)，見圖3。其中Degree>5有10個(gè)，分別為HSP90AA1、EGFR、HSP90AB1、JAK2、EP300、ESR1、ESR2、FKBP4、ITGB3、LYN，見圖4。

圖3 潛在靶點(diǎn)基因的相互作用

圖4 核心靶點(diǎn)相互作用

2.6 成分-核心靶點(diǎn)-通路網(wǎng)狀模型構(gòu)建

利用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建“成分-潛在靶點(diǎn)-通路”之間的網(wǎng)絡(luò)模型圖，進(jìn)一步觀察候選成分、潛在作用靶點(diǎn)及所涉及通路的關(guān)系，見圖5。

圖5 成分-核心靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

石菖蒲-茯苓活性成分的核心作用靶點(diǎn)分布于不同代謝通路，相互協(xié)調(diào)作用，涉及多種機(jī)制，這體現(xiàn)了藥對(duì)抗AD的作用。通過(guò)度的均值，選擇大于均值的藥對(duì)化合物有19個(gè)，見圖6。其中Degree>35有Cerevisterol(啤酒甾醇)和kaempferol(山柰酚)，預(yù)測(cè)兩化合物為石菖蒲-茯苓治療AD主要化合物，其次為2′-O-Methylisoliquiritigenin(2′-O-甲基異甘草素)、8-Isopentenyl-kaempferol(8-異戊烯基-山柰酚)及trametenolic acid(栓菌酸)等17個(gè)。

圖6 核心化合物-度值

3 討論

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，探索石菖蒲-茯苓的藥效作用，分析潛在的有效成分作用于生物網(wǎng)絡(luò)中多條通路、多個(gè)靶點(diǎn)的情況，解析其干預(yù)疾病發(fā)生發(fā)展的作用過(guò)程。本研究篩選出石菖蒲與茯苓主要作用于AD的化合物為異菖蒲烯二醇(Isocalamendiol)、土青木香酮(Aristolone)、菖蒲烯二醇(Calamendiol)、山柰酚(Kaempferol)、2′-O-甲基異甘草素(2′-O-Methylisoliquiritigenin)、呋喃香豆素(Marmesin)、8-異戊烯基-山柰酚(8-Isopentenyl-kaempferol)、常春藤皂苷元(hederagenin)、栓菌酸(trametenolic acid)、啤酒甾醇(Cerevisterol)及齒孔菌酸(3beta-Hydroxy-24-methylene-8-lanostene-21-oicacid)11種。石菖蒲活性成分主要是揮發(fā)油、萜類及黃酮類化合物。石菖蒲揮發(fā)油可以改善學(xué)習(xí)記憶能力，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用[11-12]。異菖蒲烯二醇、土青木香酮及菖蒲烯二醇是石菖蒲揮發(fā)油的活性成分，菖蒲烯二醇是進(jìn)入腦組織中的脂溶性去癡靈成分[13]。黃酮類化合物山柰酚具有抗氧化，抗炎及預(yù)防腦I/R誘導(dǎo)的腦損傷的作用[14]。茯苓的主要化學(xué)成分是三萜類和多糖類，萜類成分具有抗炎、降血糖、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[15]，常春藤皂苷元、栓菌酸及齒孔菌酸即為三萜類化合物，可能是其活性成分。

石菖蒲與茯苓的有效活性成分通過(guò)多條通路作用的相同基因靶點(diǎn)有MAPK3、MET、ADORA2A、CHRM1、CHRM2、KDR、MAPK8等。文獻(xiàn)資料表明，MAKP3、CHRM1、ADORA2A及MAPK8靶點(diǎn)與神經(jīng)功能作用有關(guān)，MAKP3(絲裂原激活的蛋白激酶3)是一種抗凋亡基因，參與神經(jīng)元的可塑性，對(duì)于用外皮素治療后大鼠海馬中的Mapk3表現(xiàn)出明顯的下調(diào)作用[16]。而CHRM1(膽堿能受體M1)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的毒蕈堿受體，在神經(jīng)元中高度表達(dá)，對(duì)CHRM1基因的敲除可減少NREM睡眠[17]，其減少也可影響手術(shù)絕經(jīng)期惡化的記憶功能[18]及CHRM1基因表達(dá)被抑制后會(huì)削弱表達(dá)突變亨廷頓舞蹈病(HD)蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系中Ca2+依賴的神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]。ADORA2A(腺苷受體亞型A2a)是一種G蛋白偶聯(lián)的腺苷受體，與海馬體積變化具有顯著關(guān)系[20]。因此，可推測(cè)這些基因可以作為今后治療神經(jīng)退行性疾病和認(rèn)知能力下降的潛在靶標(biāo)。

經(jīng)通路富集分析可知，石菖蒲-茯苓藥物作用以PI3K-Akt 信息通路和Ca2+信息通路2條通路為主，這2條通路與神經(jīng)保護(hù)相關(guān)[21-23]。如山柰酚，可通過(guò)降低PI3K/Akt信號(hào)通路磷酸化水平進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24]，同時(shí)其對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞的PI3K-Akt信號(hào)通路具有劑量相關(guān)的雙向調(diào)節(jié)作用[25]。

綜上，分析石菖蒲-茯苓不同成分、基因靶點(diǎn)和通路的不同作用方式，可為石菖蒲-茯苓合用干預(yù)AD疾病的研究與治療提供參考。