雷經(jīng)緯，周小海，盧 敏，胡志希*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)是近年來老年患者致殘的主要原因之一，其特征是關(guān)節(jié)軟骨退化，關(guān)節(jié)滑膜并伴有不同程度的炎癥，從而出現(xiàn)關(guān)節(jié)僵硬、疼痛甚至喪失功能活動(dòng)[1-2]?？诜晴摅w抗炎藥物是目前治療本病最常見的非手術(shù)療法，但由于其療效有限且存在諸多不良反應(yīng)，患者不可長(zhǎng)期用藥[3]。因此，從尋找可靠、有效的中藥治療KOA成為目前的一大研究熱點(diǎn)。

KOA屬于中醫(yī)“膝痹”“骨痹”等范疇，擅于活血消腫止痛之經(jīng)典藥對(duì)沒藥、乳香，出自經(jīng)典醫(yī)籍《證治準(zhǔn)繩》中收錄的“乳香止痛散”，是治療KOA運(yùn)用頻率最高的處方[4]。乳香性偏溫，長(zhǎng)于行氣活血舒筋，沒藥性偏平，長(zhǎng)于活血散瘀[5]。但中藥成分復(fù)雜，目前的研究尚缺乏有效方法來客觀評(píng)價(jià)中藥多成分的作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種新的研究方式，可結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)，通過網(wǎng)絡(luò)分析探索藥物活性的潛在機(jī)制[6]?；诖耍疚睦镁W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探索乳香、沒藥的潛在有效物質(zhì)，并對(duì)治療KOA靶點(diǎn)及分子機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)研究，以期為進(jìn)一步的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 “乳香-沒藥”活性成分及其靶點(diǎn)的篩選

檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得“乳香-沒藥”的有效成分，設(shè)定類藥性(Drug likeness，DL)≥0.18及口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30進(jìn)行篩選[7]，獲得藥物活性成分及作用靶點(diǎn)，隨后借助Uniprot數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行矯正和轉(zhuǎn)換為靶點(diǎn)基因，限定物種為“人類”[8]，即為“乳香-沒藥”主要活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.2 KOA疾病相關(guān)靶點(diǎn)篩選

以“Knee osteoarthritis”為關(guān)鍵詞在GeneCards、OMIM兩大常用疾病數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，篩選出KOA相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，去除重復(fù)內(nèi)容后，同樣借助Uniprot數(shù)據(jù)庫對(duì)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)換。然后借助R語言相關(guān)程序?qū)ⅰ?.2”項(xiàng)中獲得的藥物靶點(diǎn)與KOA疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集提取交集靶基因，繪制韋恩圖。

1.3 “藥物-成分-疾病-靶標(biāo)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape 3.7.0軟件將“1.3”項(xiàng)中獲得的交集靶基因與藥物、疾病相映射，即“藥物-成分-疾病-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)圖中藥物成分、疾病以及兩者交集靶標(biāo)分別以不同形狀的節(jié)點(diǎn)代表，藥物活性成分的“degree”值通過使用 “CentiScape”插件分析得出，其值大小用以評(píng)估判斷活性成分是否發(fā)揮主要功能。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將交集靶基因?qū)氲絊TRING平臺(tái)設(shè)置最小互作分?jǐn)?shù)值為0.9(最高置信度)，獲取蛋白相互作用數(shù)據(jù)，隨后將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件中用以構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)“degree”值大小進(jìn)行排序，其值越大，成為化合物的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)可能性越大。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將交集靶標(biāo)利用R語言軟件運(yùn)行，得到基因本體論(Gene Ontology，GO)及基因通路富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)結(jié)果，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將得到的KEGG通路分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件進(jìn)行可視化展示。

1.6 活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接認(rèn)證

分子對(duì)接是基于Scripps研究所發(fā)與維護(hù)AutoDock 4.2軟件進(jìn)行的，通過上述“1.4”項(xiàng)下步驟篩選出富集交集靶點(diǎn)最多的有效活性成分，將其作為配體，其三維結(jié)構(gòu)通過PubChem數(shù)據(jù)庫搜集。步驟“1.5”項(xiàng)中“degree”值最大的蛋白為受體，其蛋白結(jié)構(gòu)通過PDB數(shù)據(jù)庫搜集，將搜集到的蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入OpenBabel 2.4.1軟件中進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換等操作后，利用AutoDock 4.2軟件行分子對(duì)接[9]。

1.7 觀察項(xiàng)目

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)“乳香-沒藥”藥對(duì)治療KOA的機(jī)制靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，選取的觀察指標(biāo)主要包括藥對(duì)的關(guān)鍵有效活性成分、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的核心靶蛋白、GO及KEGG通路富集分析結(jié)果以及藥對(duì)核心有效化合物與靶蛋白的對(duì)接活性。

2 結(jié)果

2.1 “乳香-沒藥”有效成分及其靶點(diǎn)篩選結(jié)果

經(jīng)先前設(shè)定的條件進(jìn)行篩選，藥對(duì)中共有40個(gè)有效成分最終納入，其中乳香32個(gè)，沒藥8個(gè)。對(duì)這40個(gè)有效成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，去重后共獲得靶點(diǎn)基因162個(gè)。見表1。

表1 “乳香-沒藥”藥對(duì)活性成分列表

2.2 KOA疾病靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

檢索GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫，獲取共1 646個(gè)KOA相關(guān)的疾病基因，通過使用Uniprot數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)對(duì)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行人類基因名注釋轉(zhuǎn)換。利用R語言程序提取KOA相關(guān)靶基因與藥對(duì)中有效成分的交集靶點(diǎn)83個(gè)，并繪制維恩圖，見圖1。

圖1 “乳香-沒藥”藥對(duì)與疾病靶點(diǎn)的韋恩圖

2.3 “藥物-成分-疾病-靶標(biāo)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果

將83個(gè)“乳香-沒藥”藥對(duì)治療KOA的交集靶基因分別與3個(gè)乳香，17個(gè)沒藥活性成分進(jìn)行映射，建立它們之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中繪制“藥物-成分-疾病-靶標(biāo)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。借助CentiScape插件，分析出不同節(jié)點(diǎn)的degree值，其值越大意味著該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮越重要的作用。通過計(jì)算結(jié)果可知：沒藥中排名前3的有效成分分別為槲皮素(Quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol β)、豆甾醇(Stigmasterol)，對(duì)應(yīng)的degree值分別為77、14、6。乳香中排名前三的是乳香脂酸(Boswellic acid)、扁枝杉烯(phyllocladene)、3-氧代-酪氨酸(3-oxo-tirucallic acid)，對(duì)應(yīng)的degree值分別為2、2、2。

注：菱形節(jié)點(diǎn)代表“乳香-沒藥”藥對(duì)，六邊形節(jié)點(diǎn)代表KOA疾病，三角形節(jié)點(diǎn)分別代表乳香、沒藥有效成分，圓形節(jié)點(diǎn)代表交集靶標(biāo)，連線代表靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。

圖2 “乳香-沒藥”治療KOA的“藥物-成分-疾病-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析結(jié)果

篩選得到的83個(gè)疾病與藥物交集靶標(biāo)導(dǎo)入STRING平臺(tái)，限定物種為人類，設(shè)置最小互作分?jǐn)?shù)值為0.9(最高置信度)進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析，分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件中繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3所示。網(wǎng)絡(luò)中共有83個(gè)節(jié)點(diǎn)，相互間的連線代表存在相互作用。節(jié)點(diǎn)的大小和顏色深淺隨degree值大小變化，即靶基因的degree值越大，則對(duì)應(yīng)的節(jié)點(diǎn)越大和顏色越濃。排名前五的為：白細(xì)胞介素-6(IL-6)、Jun激酶(JNK)、白細(xì)胞介素-1B (IL-1B)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)，degree值分別為：28、23、21、17、16，表明其在網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位。

注：圖中節(jié)點(diǎn)表示PPI網(wǎng)絡(luò)中的靶蛋白，節(jié)點(diǎn)的面積越大且顏色越深則該蛋白的“degree”值越大，在網(wǎng)絡(luò)中的地位越重要。

2.5 基因功能與通路分析

本次研究GO分析劃分為生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)以及分子功能(MF)3類，對(duì)排名前5的GO富集分析進(jìn)行展示。BP分析結(jié)果主要集中于脂多糖反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、活性氧的反應(yīng)、細(xì)菌來源分子反應(yīng)等生物過程，見表2。CC分析結(jié)果主要集中于膜筏、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)等細(xì)胞組分，見表3。MF分析結(jié)果主要集中于細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等分子功能。見表4。

表2 “乳香-沒藥”藥對(duì)治療KOA潛在靶點(diǎn)的GO富集分析(BP)

表3 “乳香-沒藥”藥對(duì)治療KOA潛在靶點(diǎn)的GO富集分析(CC)

表4 “乳香-沒藥”藥對(duì)治療KOA潛在靶點(diǎn)的GO富集分析(MF)

KEGG通路分析結(jié)果顯示，見圖4?！叭橄?沒藥”干預(yù)KOA主要涉及糖尿病并發(fā)癥信號(hào)通路、黏液剪切應(yīng)激及動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等信號(hào)通路。以上結(jié)果提示“乳香-沒藥”包含的主要活性成分其作用靶點(diǎn)在不同的代謝通路分布廣泛，其干預(yù)KOA可能是通過多成分、多靶點(diǎn)相互調(diào)節(jié)的。

圖4 “乳香-沒藥”藥對(duì)主要活性成分干預(yù)KOA的靶基因-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對(duì)接分析結(jié)果

基于以上結(jié)果分析，活性成分槲皮素涉及的疾病靶點(diǎn)最多，PPI網(wǎng)絡(luò)中分析得出“degree”值排名最前的靶點(diǎn)為IL-6，因此，分別選擇Quercetin和IL-6作為配體和受體用于本次分子對(duì)接。通過在PubChem上檢索，得到到槲皮素三維結(jié)構(gòu)及其CID：5280343，圖5A。通過在PDB上檢索，得到IL-6蛋白ID為4NI7并下載其結(jié)構(gòu)，剔除所有配體及水分子(圖5B)。經(jīng)Autodock軟件進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示槲皮素(quercetin)被“埋在了”受體IL-6蛋白結(jié)構(gòu)4NI7的活性口袋中，這樣的結(jié)構(gòu)大大增加了兩者結(jié)合的可能性，圖5C。通過PYMOL軟件顯示槲皮素與受體IL-6相對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基分別是第93、97位：氨基酸GLU-93(谷氨酸-93)、TYR-97(酪氨酸-97)、而槲皮素與IL-6之間最短距離為2A，圖5D。

注：圖5A所示為槲皮素的化合物分子結(jié)構(gòu)；圖5B為IL-6的蛋白飄帶模型；圖5C為槲皮素被包裹在IL-6靶蛋白的活性口袋中；圖5D所示化合物槲皮素與受體IL-6的氨基酸(GLU-93、TYR97)殘基，虛線表示兩者之間的氫鍵。

3 討論

3.1 “乳香-沒藥”的配伍應(yīng)用具有現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)

乳香、沒藥配伍成方應(yīng)用多見于傷科疾病中，目前現(xiàn)代藥理學(xué)已被證實(shí)的主要成分為揮發(fā)油類，包括單萜、倍半萜、烯醇和酯類等成分[10-11]。乳香、沒藥所含活性成分較多，其干預(yù)KOA靶點(diǎn)及機(jī)制尚不完全明確。通過TCMSP數(shù)據(jù)量基于ADME標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥對(duì)的活性成分進(jìn)行篩選，得出在沒藥的活性成分中槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇干預(yù)KOA靶標(biāo)的基因富集性較高、即成發(fā)揮關(guān)鍵作用概率最大。槲皮素通過體內(nèi)代謝生成的代謝產(chǎn)物所具有的強(qiáng)氧化作用是其發(fā)揮抗炎活性的關(guān)鍵[12]。β-谷甾醇可明顯刺激成骨細(xì)胞OPGm RNA表達(dá)，不僅直接促進(jìn)成骨作用，而且通過有效地抑制破骨作用達(dá)到護(hù)骨效果[13]。有報(bào)道稱，豆甾醇可作為治療KOA的一個(gè)可能的治療劑，其能通過阻礙制促炎性介質(zhì)(TNF-α，IL-6，IL-1β，iNOS和COX-2)并通過下調(diào)關(guān)節(jié)中NF-κBp65(抑制p-IκB-α激活)和p38MAPK的表達(dá)來增加抗炎細(xì)胞因子(IL-10)的表達(dá)，從而減少軟骨退化[14]。在乳香的活性成分中，乳香脂酸能抑制促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ)的釋放，減輕膝關(guān)節(jié)的疼痛和僵硬，改善其活動(dòng)度[10，15]?！叭橄?沒藥”配伍干預(yù)的KOA的活性成分多且復(fù)雜，且兩者的活性成分均對(duì)KOA的炎癥效應(yīng)均具有抑制作用，從一定程度上印證二者配伍應(yīng)用的科學(xué)性。

3.2 “乳香-沒藥”干預(yù)KOA的靶點(diǎn)與炎性靶蛋白關(guān)系密切

通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖中得到“乳香-沒藥”干預(yù)KOA的核心靶基因，其中IL-6、JUN、IL1β的度值較高，是“乳香-沒藥”干預(yù)KOA的主要作用靶點(diǎn)。IL-6生物活性復(fù)雜多樣，能夠作用于骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展病理過程中諸多環(huán)節(jié)，如促使淋巴細(xì)胞分泌相關(guān)免疫球蛋白，加重關(guān)節(jié)的炎癥程度等最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞增強(qiáng)，使病變進(jìn)一步發(fā)展，部分研究表明KOA患者關(guān)節(jié)損傷程度與血清中IL-6因子水平顯著相關(guān)[16]。IL-1β屬于經(jīng)典的IL-1家族，為KOA進(jìn)展過程中涉及的重要促炎細(xì)胞因子，在OA的炎癥反應(yīng)過程中不可忽視，IL-1可提高軟骨、滑膜等關(guān)節(jié)組織中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，刺激膠原酶和中性蛋白酶等在滑膜細(xì)胞中合成，進(jìn)而滑膜周圍發(fā)生炎性病變[17-18]。JUN是AP-1家族主要成員之一，其亞類c-Jun是KOA發(fā)病的重要基因，已有研究指出一定程度的應(yīng)激刺激可激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)蛋白通路加速軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解，引起關(guān)節(jié)軟骨退變，從而加速KOA的進(jìn)展[19-20]?！叭橄?沒藥”干預(yù)KOA的靶點(diǎn)與炎性靶蛋白關(guān)系密切，這可能與其無菌性炎癥反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制不謀而合，本研究預(yù)測(cè)的相關(guān)炎性靶點(diǎn)可為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供指導(dǎo)。

3.3 “乳香-沒藥”干預(yù)KOA的生物學(xué)過程具有多組分、多途徑的特點(diǎn)

從GO富集分析結(jié)果表明，“乳香-沒藥”治療KOA生物過程主要涉及脂多糖反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等，細(xì)胞組分主要涉及細(xì)胞膜相關(guān)結(jié)構(gòu)上，分子功能主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、核受體活性等參與，以上諸多生物學(xué)過程和功能在乳香、沒藥活性成分調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)靶基因和通路過程中均有體現(xiàn)。脂多糖可誘導(dǎo)生成一氧化氮(NO)，NO是KOA重要的炎癥介質(zhì)，其可誘導(dǎo)線粒體損傷和胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活化，引發(fā)核內(nèi)染色體降解及凝結(jié)，凋亡小體形成，從而軟骨細(xì)胞凋亡被誘導(dǎo)，加重了軟骨損傷的進(jìn)展[21-22]，“乳香-沒藥”藥對(duì)可能通過阻斷這一惡性過程來干預(yù)KOA。大量的KOA相關(guān)的信號(hào)通路受體聚集在細(xì)胞膜上，如TGF-β信號(hào)通路中主要通過在細(xì)胞膜上形成Ⅰ型受體和Ⅱ型受體的復(fù)合體來啟動(dòng)信號(hào)的發(fā)生[23]。抑制細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路是分子治療KOA的重要方式，其包括細(xì)胞因子中和、受體阻滯、細(xì)胞因子過程抑制、細(xì)胞因子合成、反應(yīng)抑制以及聯(lián)合的治療[24]。

3.4 “乳香-沒藥”干預(yù)KOA的涉及炎癥、代謝以及腫瘤多種信號(hào)通路

從信號(hào)通路來看，“乳香-沒藥”治療KOA主要涉及代謝、炎癥、感染以及腫瘤等相關(guān)信號(hào)通路。其中AGE-RAGE排名最靠前，對(duì)于晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的深入研究，使人們認(rèn)識(shí)到AGEs可以誘導(dǎo)人OA滑膜細(xì)胞COX-2的表達(dá)和前列腺素E2(PGE2)、IL-6和MMP-13的產(chǎn)生，另外AGEs受體中和抗體(RAGE)能有效逆轉(zhuǎn)人滑膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和VEGF生成，提示RAGE在滑膜細(xì)胞活化中起重要作用，從而促進(jìn)OA的進(jìn)展[25-26]。IL-17信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白(IL-17RA、IL-17RC、ACT1、TRAF6和RELA)過度表達(dá)和活化，在關(guān)節(jié)軟骨炎癥具有重要作用。 IL-17還能與炎癥因子發(fā)揮協(xié)同作用，放大加強(qiáng)如TNF-α等的致炎效應(yīng)[27-28]。TNF在體內(nèi)介導(dǎo)了廣泛的細(xì)胞反應(yīng)，TNF-α可以激活JNK和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB等信號(hào)通路，JNK信號(hào)通路參與軟骨細(xì)胞凋亡過程，并可抑制Sox-9的表達(dá)，通過阻斷NO降低軟骨細(xì)胞的凋亡水平[29]。NF-κB信號(hào)通路被激活，可快速誘導(dǎo)IL-1β、TNF-α、IL-17等相關(guān)炎癥因子釋放加速炎癥反應(yīng)發(fā)生[30]。同時(shí)，在分子對(duì)接結(jié)果中，槲皮素與IL-6蛋白之間對(duì)接匹配度較適宜，同時(shí)它們之間形成的氫鍵數(shù)目較多且距離較短，這說明槲皮素干預(yù)KOA作用機(jī)制很可能與此氨基酸的殘基相關(guān)，槲皮素與IL-6關(guān)鍵靶蛋白間的對(duì)接具有一定的適配性，從分子角度剖析本研究預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.5 本研究的不足與展望

本研究仍存在一些局限性。首先，藥物活性成分的獲取基于現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)，而非液相色譜、質(zhì)譜或其他實(shí)驗(yàn)方法來獲取。其次，本研究中篩選后的乳香有效成分較少，在匹配靶基因過程中沒藥有效成分占大部分比例，這與兩者配伍用于臨床的干預(yù)KOA的過程的實(shí)際情況可能存在偏倚。同時(shí)，本次研究分析得到的部分關(guān)鍵目標(biāo)和路徑尚缺乏實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證，可為今后相關(guān)研究提供新的思路。