張欣雨，李 明，紀(jì) 翔

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肛腸科，安徽 合肥 230038)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)患者癥狀痛苦，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，且具有癌變傾向，因此及時(shí)控制病情并緩解癥狀為臨床治療目標(biāo)，但該病反復(fù)發(fā)作，遷延難愈，且發(fā)病機(jī)制尚未十分明確，臨床治療存在長期用藥副作用多，停藥后復(fù)發(fā)率高，患者依從性差等問題。中醫(yī)藥治療UC各階段均有其治療原則及方法，具有癥狀緩解持久，復(fù)發(fā)率相對較低及副作用小等優(yōu)勢。腸愈灌腸方在臨床上多用于治療證屬大腸濕熱型UC，但卻鮮有對其作用機(jī)制和路徑的研究。研究表明，P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen activated protein kinase，P38MAPK)參與并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，在UC的發(fā)生發(fā)展中具有重要影響[1]。本研究采取現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察腸愈灌腸方對UC大鼠P38MAPK及相關(guān)細(xì)胞因子的調(diào)控，從免疫炎癥反應(yīng)角度探析其治療UC的作用機(jī)理，豐富該經(jīng)驗(yàn)方治療UC的理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 SPF實(shí)驗(yàn)大鼠

本實(shí)驗(yàn)選用 62 只健康 Wistar 大鼠(2月齡)，來源于安徽省實(shí)驗(yàn)動物中心(動物生產(chǎn)許可證：SCXK(皖)2011-002)，雌雄各半，體質(zhì)量(160±20)g。實(shí)驗(yàn)室為SPF級，空調(diào)恒溫23 ℃，濕度50%±5%，明暗交替12 h/12 h，室內(nèi)通風(fēng)換氣，食滅菌固體飼料和標(biāo)準(zhǔn)飲用水。

1.2 藥材

柳氮磺吡啶腸溶片1 g，購于安徽省中醫(yī)院藥房，產(chǎn)自上海福達(dá)制藥有限公司(批號：國藥準(zhǔn)字H31020840)；腸愈灌腸方：黃柏6 g(濃縮顆粒劑0.5 g)、白及10 g(濃縮顆粒劑1.3 g)、苦參6 g(濃縮顆粒劑0.5 g)、仙鶴草15 g(濃縮顆粒劑0.9 g)。濃縮顆粒劑供自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司。加錫類散1 g(購自杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及器材

2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS，Sigma公司)、50% 乙醇、生理鹽水、水合氯醛；TNF-α ELISA 試劑盒(批號：93556038)、IL-4 ELISA 試劑盒(批號：230441235)及IL-10 ELISA 試劑盒(批號：10369R)；BCA 蛋白定量試劑盒購自上海 BestBio 公司。一抗：兔抗鼠P38MAPK一抗；二抗：IgG-HRP羊抗兔二抗(上海生工生物工程股份有限公司)。VELOCI-TY 高速低溫離心機(jī)(美國伯樂公司)；組織勻漿機(jī)(上海凈信Tissuelyser-192)；Western-blot所用電泳槽及轉(zhuǎn)運(yùn)槽(Bio-Rad 公司)。

2 方法

2.1 造模方法[2]

環(huán)境與飲食干預(yù)，聯(lián)合TNBS/乙醇混合試劑灌腸法，空白組12只大鼠予常規(guī)飼養(yǎng)，余50只大鼠給予肥甘飲食(普通飼料摻入12%動物脂肪、10%糖漿融合加工)，隔日交替灌喂56度白酒20 mL/kg，后將大鼠放入人工氣候箱(參數(shù)：高溫35 ℃、高濕95%)中，共21 d，以建立內(nèi)因濕熱型模型。造模前一天，大鼠僅飲水，并用棉簽擦凈肛周穢物，促進(jìn)排空大便，之后用水合氯醛麻醉，固定大鼠背部于解剖臺上，取直徑約2 mm灌腸管用石蠟油潤滑后，經(jīng)肛緣緩慢插至結(jié)腸約8 cm處，再把TNBS和乙醇混合物注入肛門上段，將大鼠頭低腳高位傾斜倒置45°，時(shí)間持續(xù)2 min，使得溶液能充分進(jìn)入腸腔內(nèi)，清醒后自由飲食，觀察并記錄大鼠情況。3周后評估被抽取大鼠造模水平。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠結(jié)腸黏膜充血水腫明顯，紋理模糊，部分節(jié)段見散在潰瘍、糜爛及出血點(diǎn)，甚者附著白色偽膜，與周圍臟器有不同程度黏連，腸腔梗阻或狹窄，結(jié)腸長度縮短明顯。

2.2 分組與藥物干預(yù)

采用隨機(jī)數(shù)字表法，對62只SPF 級健康大鼠進(jìn)行分組，分別為空白組、模型組、柳氮磺吡啶組，腸愈灌腸方低、中、高劑量組，空白組12只，其余各組均為10只?？瞻捉M(12只大鼠)不作任何干預(yù)措施，每日按時(shí)給予喂養(yǎng)。模型組每日予3 mL生理鹽水灌腸。按照人與實(shí)驗(yàn)大鼠體型換算系數(shù)法[3]，計(jì)算有效給藥劑量，腸愈灌腸方組每日按低劑量(濃度為0.09 g/mL，相當(dāng)于成人臨床日需量的2.5倍)，中劑量(濃度為0.18 g/mL，相當(dāng)于成人臨床日需量的5倍)，高劑量(濃度為0.36 g/mL，相當(dāng)于成人臨床日需量的10倍)，各3 mL灌腸。柳氮磺吡啶組予柳氮磺吡啶，研磨成粉后用蒸餾水稀釋成均勻混懸液，濃度0.02 g/mL(相當(dāng)于成人臨床日需量的5倍)，取3 mL灌腸。每日固定時(shí)間給藥1次，持續(xù)14 d為1治療周期。

2.3 標(biāo)本采集

各組動物經(jīng)相關(guān)灌腸給藥治療14 d后，禁食過夜24 h，期間飲水不限，用異氟烷吸入麻醉，低溫?zé)o菌分離腹主動脈，取血5 mL，離心后取上清-80 ℃保存，用于ELISA檢測。將大鼠斷頸處死，沿縱軸自肛門上端約8 cm處剖開腸腔，取病變最明顯處結(jié)腸組織約6 cm，用4 ℃生理鹽水清洗腸腔并用錫紙包裹，置于液氮冷凍，隨后用無酶凍存管-80 ℃保存，備Western-blot法檢測。

2.4 一般情況觀察

自實(shí)驗(yàn)開始每日逐只稱量大鼠體質(zhì)量，觀察大鼠精神反應(yīng)狀態(tài)，進(jìn)食量，泄瀉程度，毛發(fā)密度及光澤度等，采用鄰甲苯胺法檢測糞便隱血。根據(jù)計(jì)算公式：DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+糞便黏稠度+便潛血)/3，評估UC疾病活動指數(shù)[4]。見表1。

表1 大鼠DAI評分

2.5 Western-blot檢測腸黏膜P38MAPK蛋白水平

截取約50 mg解凍后的腸標(biāo)本研磨破碎并加入200 μL RIPA試劑(含PMSF)，冰浴30 min后低溫離心10 min(4 ℃，12 000 rpm)。取上清，用BAC法進(jìn)行蛋白定量。將總蛋白提取液與1/5的loading buffer均勻稀釋，沸水浴使蛋白變性。每孔上樣20 μL，根據(jù)蛋白分子量大小制備凝膠，隨后開始電泳分析蛋白。濕法電轉(zhuǎn)至0.45 μm的PVDF膜，用5%脫脂奶粉+3% BSA將PVDF膜37 ℃溫育1～2 h。把PVDF膜放于稀釋至1∶2 000的兔抗鼠P38MAPK一抗培育液中，4 ℃靜止過夜，洗膜5次。取出PVDF膜，浸于稀釋至1∶3 000的HRP羊抗兔二抗培育液中，37 ℃結(jié)合反應(yīng)1～2 h，TBST快搖洗膜5次。用化學(xué)發(fā)光(ECL)膠片顯影。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2.6 大鼠血清IL-4、IL-10、TNF-α含量比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將從腹主動脈取得的血液置于離心機(jī)離心10 min(4 ℃，3 000 r/min)，收集上清液于-80 ℃ 保存?zhèn)錅y。按照 ELISA試劑盒操作規(guī)程測定血清IL-4、IL-10以及TNF-α的水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 一般情況

空白組大鼠反應(yīng)快，飲水進(jìn)食排便均正常，皮毛厚而光滑，糞便為深褐色，呈顆粒狀；模型組第2天出現(xiàn)精神不振、嗜睡、毛干枯稀疏，食物攝入量降低，第3天時(shí)有血便，第5天出現(xiàn)膿血便；1星期后大鼠體質(zhì)量明顯降低，出現(xiàn)少食懶動、皮毛松散枯槁、嗜睡、黏液膿血便、反應(yīng)遲鈍等癥狀，生存能力明顯下降；藥物干預(yù)2周后，相較于模型組，各治療組癥狀明顯減輕，動作敏捷，毛發(fā)有光澤、飲食、糞便、體質(zhì)量接近正常，身體發(fā)育良好。實(shí)驗(yàn)期間由于灌腸操作不當(dāng)，模型組大鼠死亡3只，腸愈灌腸方低、中劑量組及柳氮磺吡啶組各死亡2只，空白組及腸愈灌腸方高劑量組未見死亡。腸愈灌腸方中、高劑量組一般情況較好，體質(zhì)量恢復(fù)正常，大便性質(zhì)明顯改善，皮毛有光澤，活動增多，DAI評分比模型組顯著降低(P<0.05)；腸愈灌腸方和柳氮磺吡啶組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但腸愈灌腸方高劑量組DAI評分明顯低于柳氮磺吡啶組。見表2。

表2 腸愈灌腸方對各組大鼠 DAI 評分影響

3.2 各組大鼠P38MAPK表達(dá)水平比較

相較于空白組，模型組大鼠腸黏膜P38MAPK含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，腸愈灌腸方(0.36 g/mL、0.18 g/mL)組和柳氮磺吡啶(0.02 g/mL)組均可明顯降低結(jié)腸組織P38MAPK蛋白表達(dá)量，組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；各治療組間比較，腸愈灌腸方(0.18 g/mL、0.36 g/mL)組及柳氮磺吡啶組(0.02 g/mL)組均優(yōu)于腸愈灌腸方(0.09 g/mL)組，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠之間P38MAPK蛋白表達(dá)比較

3.3 大鼠血清IL-4、IL-10、TNF-α含量比較

相較于空白組，模型組大鼠的IL-4、IL-10含量較低，TNF-α的含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，柳氮磺吡啶組和腸愈灌腸方組大鼠血清TNF-α顯著降低，IL-4、IL-10 的含量上升，其中以腸愈灌腸方高劑量組最為顯著，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清中細(xì)胞因子含量比較

4 討論

近年來，由分子機(jī)制角度切入，探索炎癥介質(zhì)及其通路在UC腸道病變中的作用成為研究熱門。有關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明[5-6]，UC 的發(fā)生與機(jī)體組織內(nèi)抑炎因子和促炎因子(或基因和蛋白)的紊亂狀態(tài)有密切關(guān)系，這一觀點(diǎn)得到了多數(shù)學(xué)者的認(rèn)同[7]。

諸多研究表明，UC活動期人群的血清TNF-α含量較正常人群該項(xiàng)指標(biāo)升高顯著，病情程度越重，血清TNF-α升高越明顯，經(jīng)治療，血清TNF-α水平會逐漸下降。可見，TNF-α是UC疾病發(fā)展過程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子。IL-4、IL-10與TNF-α不同，這兩種刺激分子在UC的發(fā)病過程中展現(xiàn)降低趨勢，對腸黏膜具有保護(hù)作用。IL-4主要由活化的T細(xì)胞分泌而來，具有抑制炎癥與免疫抑制等多種生物學(xué)效力，在腸道黏膜微環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用[8]。IL-10可抑制部分炎性細(xì)胞因子合成，Th2細(xì)胞是其主要來源。研究表明，將小鼠IL-10基因剔除，可使小鼠誘發(fā)結(jié)腸炎，之后予以IL-10可防治其發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)亦表明，IL-10在保持腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)方面，作用極其重要[9]。此外，對于直腸炎，IL-4、IL-10 具有逆轉(zhuǎn) Th1/Th2 細(xì)胞活化作用，加強(qiáng) Th2型反應(yīng)，使得黏膜修復(fù)得以改善。

P38MAPK主要位于細(xì)胞漿內(nèi)，其活性在正常情況下很低，可被特定細(xì)胞因子刺激而活化，而后通過調(diào)控多種蛋白激酶與轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激免疫炎癥反應(yīng)，與炎癥的發(fā)生發(fā)展過程息息相關(guān)[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，P38MAPK 在 UC 腸黏膜中的蛋白水平顯著提高，可能是通過調(diào)節(jié)下游細(xì)胞因子(如 IL-1β、IL-10、TNF-α)的表達(dá)，從而參與了 UC 的發(fā)生[12]。Li等[13]研究表明，姜黃素可阻斷P38MAPK蛋白產(chǎn)生，下調(diào)下游炎癥因子(IL-6、TNF-α)等的表達(dá)，從而改善結(jié)腸黏膜對促炎癥因子的免疫防御機(jī)能。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腸愈灌腸方中、高劑量組和柳氮磺吡啶組對UC大鼠的生存狀況改善明顯，結(jié)腸P38MAPK蛋白和血清中TNF-α的表達(dá)下調(diào)明顯(P<0.05)，提示腸愈灌腸方治療大腸濕熱型UC具有明顯效果，可能與其降低結(jié)腸組織P38MAPK的蛋白表達(dá)，從而調(diào)控血清各細(xì)胞因子的水平如TNF-α、IL-4、IL-10，以達(dá)到抑制炎癥性反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫平衡，修復(fù)黏膜屏障的效果有關(guān)，今后應(yīng)深入研究該方，為UC治療提供新的思路與方向。