鄭汝蕓，羅鵬飛，王金泉，舒 展，李愛(ài)巧，趙玉康，王海燕，張 芳

(1.新疆阿勒泰地區(qū)動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆 阿勒泰 836500；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；3.新疆烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心，烏魯木齊 830063)

牛結(jié)核病主要由牛分枝桿菌引起的一種人畜共患慢性傳染病[1]，該病在全球范圍內(nèi)廣泛流行[2]，牛結(jié)核病可以通過(guò)病畜傳染給其他動(dòng)物或人[3]，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B 類動(dòng)物疾病[4]。 目前，牛結(jié)核病的發(fā)病率在我國(guó)一些省份呈上升趨勢(shì)，有的已達(dá)到6%甚至更高的陽(yáng)性檢出率[5]，該病在新疆各地州的發(fā)病率一直都比較高，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全,尤其是在農(nóng)牧區(qū)[6]。 因此，建立可靠的診斷檢測(cè)技術(shù)對(duì)防控該病至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)動(dòng)物：按照牛存欄密度、養(yǎng)殖方式和養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)、散養(yǎng)戶的數(shù)量及農(nóng)牧民配合程度，在阿勒泰地區(qū)對(duì)A-H 共8 個(gè)區(qū)域內(nèi)的8580 頭牛進(jìn)行牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)， 排除滿3 月齡以內(nèi)犢牛、剛配種或臨產(chǎn)母牛、瘦弱病牛一律不檢測(cè)。

受試血清： 隨機(jī)選取牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)結(jié)果為陰性的100 頭牛進(jìn)行肝素抗凝血采集， 且對(duì)牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)初篩結(jié)果為陽(yáng)性的6 頭牛采集全血， 以上合計(jì)共106份，分離血清待檢。

試驗(yàn)材料：牛結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)病原由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；提純牛型結(jié)核菌素由阿勒泰地區(qū)動(dòng)物疾病控制與診斷中心提供(哈藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn))；牛結(jié)核γ-干擾素ELSIA 檢測(cè)試劑盒(青島瑞爾生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))；DNA 提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司生產(chǎn))。

試驗(yàn)器材：20 μL 加樣槍、24 孔培養(yǎng)板、塑料吸頭、酒精棉、連續(xù)注射器、生物安全柜、電子天平、超純化水機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、移液器、微量振蕩器、電子游標(biāo)卡尺、注射器、個(gè)人防護(hù)用品等。

1.2 方法

1.2.1 牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)

檢測(cè)所用方法參照國(guó)標(biāo)《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》(GB/T 18645-2002)[7]操作。

將待檢牛只全部編號(hào)后，在頸側(cè)中部上1/3 處剪毛，直徑約10 cm。 用游標(biāo)卡尺測(cè)量注射部位中央皮皺厚度，做好記錄。用75%的酒精棉消毒注射部位，然后皮內(nèi)注射0.1 mL 的結(jié)核菌素原液，注射后局部應(yīng)出現(xiàn)小泡。

皮內(nèi)注射后經(jīng)過(guò)72 h 判定結(jié)果，觀察注射部位局部有無(wú)紅腫熱痛的炎性反應(yīng)，并以游標(biāo)卡尺測(cè)量術(shù)部腫脹區(qū)域(或部位)的大小和皮皺的厚度,做好記錄。 在72 h 觀察后呈陰性和可疑反應(yīng)的牛須在第1 次注射的部位，以同樣的劑量進(jìn)行第二次注射，再經(jīng)過(guò)48 h 觀察結(jié)果。 對(duì)于陰性牛和疑似反應(yīng)牛，在注射96 h 和120 h 再觀察一次，以防止個(gè)別牛出現(xiàn)較晚的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，所有結(jié)果全部進(jìn)行記錄。

判定標(biāo)準(zhǔn):(1)陰性反應(yīng)：注射部位無(wú)炎性反應(yīng)，皮厚差(指注射PPD 前后皮皺測(cè)量厚度的差值)在2 mm 以下。(2)疑似陽(yáng)性反應(yīng)：局部炎性反應(yīng)不明顯，皮厚差≥2.0 mm，＜4 mm。(3)陽(yáng)性反應(yīng)：局部出現(xiàn)明顯的炎性反應(yīng)，皮厚差≥4.0 mm。 凡判定為疑似陽(yáng)性反應(yīng)的牛，于第一次檢疫后60 d 進(jìn)行復(fù)檢，其結(jié)果仍為可疑，經(jīng)60 d 再?gòu)?fù)檢，如仍為疑似反應(yīng)，則直接判定為陽(yáng)性。

1.2.2 體外檢測(cè)γ-干擾素法

檢測(cè)所用方法參照國(guó)標(biāo)《牛結(jié)核病診斷體外檢測(cè)γ-IFN》(GB/T 32945-2016)[8]操作。

1.2.3 PCR 檢測(cè)方法

將抗凝血按照DNA 提取試劑盒提取DNA。(1)吸取200 μL 血樣于1.5 mL EP 管中，200 μL GA 緩沖液，震蕩；(2)200 μL GB，顛倒混勻，70 ℃、10 min；(3)200 μL 無(wú)水乙醇，混勻，全部加入到吸附柱CB 3，10000 rpm、1 min，棄濾液；(4)500 μL 的GD 緩沖液于CB 3，10000 rpm、1 min，棄濾液；(5)600 μL PW漂洗液于CB 3，10000 rpm、1 min，棄濾液，重復(fù)1 次，棄濾液；(6)將吸附柱放入全新高壓EP 管中，靜置10 min，吸附柱膜正中加入60 μL TE 洗脫液，放置4 min，13000 rpm、2 min，收集EP 管內(nèi)的DNA，-20 ℃保存。

PCR 參照段旭基等[9]牛結(jié)核桿菌和結(jié)核分枝桿菌IS 1081 基因(IS-1：CGACGCTCTGACCGACAAACT；IS-2：TGCTTGGCGGGTTCTTCG；324 bp) 擴(kuò)增目的片段；PCR 擴(kuò)增體系為：95 ℃5 min；94 ℃2 min，58 ℃1.5 min，72 ℃2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min；PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 將陽(yáng)性產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

文中Kappa 系數(shù)計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

2020年，對(duì)阿勒泰地區(qū)A-H 共8 個(gè)不同區(qū)域內(nèi)的8580 頭牛應(yīng)用牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行普檢。 由表1 可以看出，該地區(qū)8 個(gè)不同區(qū)域內(nèi)共完成牛結(jié)核檢測(cè)8580 頭，結(jié)核陽(yáng)性牛6頭(含2 份可疑品)，陽(yáng)性率為0.07%(6/8580)。 其中，C 區(qū)域、D 區(qū)域、G 區(qū)域和H 區(qū)域牛結(jié)核檢測(cè)陽(yáng)性檢出率均為0.00%，達(dá)到國(guó)家農(nóng)業(yè)部?jī)艋瘶?biāo)準(zhǔn)(0.05%)；其余區(qū)域牛結(jié)核檢測(cè)陽(yáng)性檢出率分別為A(0.14%，2/1430)、B(0.15%，0.08/1200)、E(0.08%，1/1300)、F(0.14%，2/1450)，陽(yáng)性率均高于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部?jī)艋瘶?biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果表明，阿勒泰地區(qū)不同區(qū)域內(nèi)牛結(jié)核病防控效果存在明顯差異。

表1 2020 年阿勒泰地區(qū)不同區(qū)域牛結(jié)核檢測(cè)結(jié)果

2.2 三種不同方法檢測(cè)比對(duì)結(jié)果

對(duì)106 頭份牛血清樣本應(yīng)用體外檢測(cè)γ-干擾素法、PCR 檢測(cè)方法分別于牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比。 由表2 可以看出，使用牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢出結(jié)核陽(yáng)性牛6 頭，陽(yáng)性率為5.66%(6/106)；體外檢測(cè)γ-干擾素試驗(yàn)檢與PCR 方法檢出結(jié)核陽(yáng)性均為5 頭，陽(yáng)性率為4.72%(5/106)，與牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢測(cè)之間的Kappa 值為0.81。體外檢測(cè)γ-干擾素法、PCR 檢測(cè)方法分別與牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)對(duì)比的陽(yáng)性符合率均為83.33%(5/6)，陰性符合率為99.00%(99/100)，牛型結(jié)核菌素PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)敏感性高于體外檢測(cè)γ-干擾素試驗(yàn)、PCR 檢測(cè)方法。 從試驗(yàn)結(jié)果看,Kappa 值≥0.8，檢驗(yàn)結(jié)果一致性很好。

表2 PCR 方法、體外檢測(cè)γ-干擾素法與牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)比對(duì)結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)共檢測(cè)106 頭份樣品，牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試檢測(cè)陽(yáng)性率為5.66%(6/106)，體外檢測(cè)γ-干擾素試驗(yàn)檢與PCR 方法檢測(cè)陽(yáng)性率均為4.72%(5/106)，與牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)之間的Kappa 值為0.81。 Kappa 系數(shù)用于一致性檢驗(yàn)，當(dāng)Kappa 值≥0.80，說(shuō)明檢驗(yàn)結(jié)果一致性很好， 體外檢測(cè)γ-干擾素法、PCR 檢測(cè)方法分別與牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)對(duì)比的陽(yáng)性符合率均為83.33%(5/6)，陰性符合率為99.00%(99/100)，而符合率為兩種方法共同檢測(cè)一致的結(jié)果，符合率高于85.00%，說(shuō)明方法的檢測(cè)結(jié)果較好。 牛型結(jié)核菌素PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)敏感性高于體外檢測(cè)γ-干擾素試驗(yàn)、PCR 檢測(cè)方法,以上方法的結(jié)果較為可靠，故這三種方法均可用于牛結(jié)核的檢測(cè)。

在生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用中，牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)是國(guó)家動(dòng)物結(jié)核病檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[10]，同時(shí)也是被國(guó)際貿(mào)易方指定的檢測(cè)方法之一。但此種方法存在的誤差較大，在大規(guī)模檢測(cè)中，容易出現(xiàn)陽(yáng)性漏檢情況，如果檢出的陽(yáng)性牛一旦未進(jìn)行處理，則會(huì)污染健康的牛群[11，12]。在實(shí)際檢測(cè)工作中，牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)存在一定的非特異性。 測(cè)量注射部位的皮膚厚度時(shí)，游標(biāo)卡尺等測(cè)量?jī)x器需要經(jīng)常核校，認(rèn)為有必要時(shí)還應(yīng)多次測(cè)量，不能僅憑檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)判定結(jié)果，認(rèn)為接種部位沒(méi)有明顯的“凸起”就是正常，陰性結(jié)果，個(gè)別變態(tài)反應(yīng)呈擴(kuò)散狀，表面雖不明顯，但實(shí)際皮膚有增厚反應(yīng)，必須借助游標(biāo)卡尺測(cè)量后再判定。 還有很多天氣因素、人為因素等，都會(huì)影響牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)結(jié)果。 綜上所述，此方法受外界環(huán)境及人為因素的影響較為明顯。

體外檢測(cè)γ-干擾素法可以檢測(cè)早期隱性或無(wú)癥狀感染牛只，敏感性及特異性較高，易于標(biāo)準(zhǔn)化，可以有效降低非特異性反應(yīng)帶來(lái)的假陽(yáng)性問(wèn)題[13]。對(duì)于牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢測(cè)為疑似的?？梢灾苯討?yīng)用體外檢測(cè)γ-干擾素法進(jìn)行復(fù)檢，無(wú)需采用牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)等待60 d 后進(jìn)行復(fù)檢。 但是體外檢測(cè)γ-干擾素法需要在采血后8 h 內(nèi)刺激抗原[14，15]，且試劑盒主要依靠進(jìn)口，且價(jià)格昂貴，開(kāi)展試驗(yàn)檢測(cè)成本高。 除此之外，還需要生物安全柜、移液器、恒溫箱等儀器設(shè)備來(lái)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)操作人員要求也比較高。

PCR 檢測(cè)方法同樣具有高敏感性和強(qiáng)特異性，特別是臨床癥狀不明顯或未出現(xiàn)臨床癥狀的隱性感染等，且牛分枝桿菌IS 1081 具有高度的種屬特異性，PCR 檢測(cè)方法重復(fù)性較好，人為因素相對(duì)較小[16]，但試劑盒成本比體外檢測(cè)γ-干擾素法試劑盒成本還要高。目前，牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)方法仍然是我國(guó)檢疫標(biāo)準(zhǔn)， 體外檢測(cè)γ-干擾素法、PCR 檢測(cè)方法都可以作為牛結(jié)核病的輔助確診方法，可以有效降低非特異性反應(yīng)帶來(lái)的假陽(yáng)性問(wèn)題。

4 結(jié)論

綜合分析，牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)是我國(guó)動(dòng)物結(jié)核病檢疫的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，操作簡(jiǎn)單、成本較低，被廣泛應(yīng)用于基層一線,但從試驗(yàn)結(jié)果的可靠性來(lái)講還需要不斷優(yōu)化，體外檢測(cè)γ-干擾素法和PCR 檢測(cè)方法的敏感性及特異性均較高，都可以作為牛結(jié)核病的輔助確診方法，可以有效降低非特異性反應(yīng)帶來(lái)的假陽(yáng)性問(wèn)題。但從成本上來(lái)講，PCR 檢測(cè)方法成本要高于體外檢測(cè)γ-干擾素法。因此，對(duì)于牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢測(cè)為疑似牛，可以直接應(yīng)用體外檢測(cè)γ-干擾素法或PCR 檢測(cè)方法進(jìn)行復(fù)檢，無(wú)需采用牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)等待60 d 后進(jìn)行復(fù)檢。