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        三種不同試驗(yàn)方法在牛結(jié)核檢測(cè)應(yīng)用中的比較

        2022-04-01 08:24:44鄭汝蕓羅鵬飛王金泉李愛(ài)巧趙玉康王海燕
        草食家畜 2022年2期
        關(guān)鍵詞:干擾素符合率結(jié)核

        鄭汝蕓,羅鵬飛,王金泉,舒 展,李愛(ài)巧,趙玉康,王海燕,張 芳

        (1.新疆阿勒泰地區(qū)動(dòng)物疾病控制與診斷中心,新疆 阿勒泰 836500;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052;3.新疆烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心,烏魯木齊 830063)

        牛結(jié)核病主要由牛分枝桿菌引起的一種人畜共患慢性傳染病[1],該病在全球范圍內(nèi)廣泛流行[2],牛結(jié)核病可以通過(guò)病畜傳染給其他動(dòng)物或人[3],世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B 類動(dòng)物疾病[4]。 目前,牛結(jié)核病的發(fā)病率在我國(guó)一些省份呈上升趨勢(shì),有的已達(dá)到6%甚至更高的陽(yáng)性檢出率[5],該病在新疆各地州的發(fā)病率一直都比較高,嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全,尤其是在農(nóng)牧區(qū)[6]。 因此,建立可靠的診斷檢測(cè)技術(shù)對(duì)防控該病至關(guān)重要。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        試驗(yàn)動(dòng)物:按照牛存欄密度、養(yǎng)殖方式和養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)、散養(yǎng)戶的數(shù)量及農(nóng)牧民配合程度,在阿勒泰地區(qū)對(duì)A-H 共8 個(gè)區(qū)域內(nèi)的8580 頭牛進(jìn)行牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn), 排除滿3 月齡以內(nèi)犢牛、剛配種或臨產(chǎn)母牛、瘦弱病牛一律不檢測(cè)。

        受試血清: 隨機(jī)選取牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)結(jié)果為陰性的100 頭牛進(jìn)行肝素抗凝血采集, 且對(duì)牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)初篩結(jié)果為陽(yáng)性的6 頭牛采集全血, 以上合計(jì)共106份,分離血清待檢。

        試驗(yàn)材料:牛結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)病原由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)提供;提純牛型結(jié)核菌素由阿勒泰地區(qū)動(dòng)物疾病控制與診斷中心提供(哈藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn));牛結(jié)核γ-干擾素ELSIA 檢測(cè)試劑盒(青島瑞爾生物技術(shù)有限公司生產(chǎn));DNA 提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司生產(chǎn))。

        試驗(yàn)器材:20 μL 加樣槍、24 孔培養(yǎng)板、塑料吸頭、酒精棉、連續(xù)注射器、生物安全柜、電子天平、超純化水機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、移液器、微量振蕩器、電子游標(biāo)卡尺、注射器、個(gè)人防護(hù)用品等。

        1.2 方法

        1.2.1 牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)

        檢測(cè)所用方法參照國(guó)標(biāo)《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》(GB/T 18645-2002)[7]操作。

        將待檢牛只全部編號(hào)后,在頸側(cè)中部上1/3 處剪毛,直徑約10 cm。 用游標(biāo)卡尺測(cè)量注射部位中央皮皺厚度,做好記錄。用75%的酒精棉消毒注射部位,然后皮內(nèi)注射0.1 mL 的結(jié)核菌素原液,注射后局部應(yīng)出現(xiàn)小泡。

        皮內(nèi)注射后經(jīng)過(guò)72 h 判定結(jié)果,觀察注射部位局部有無(wú)紅腫熱痛的炎性反應(yīng),并以游標(biāo)卡尺測(cè)量術(shù)部腫脹區(qū)域(或部位)的大小和皮皺的厚度,做好記錄。 在72 h 觀察后呈陰性和可疑反應(yīng)的牛須在第1 次注射的部位,以同樣的劑量進(jìn)行第二次注射,再經(jīng)過(guò)48 h 觀察結(jié)果。 對(duì)于陰性牛和疑似反應(yīng)牛,在注射96 h 和120 h 再觀察一次,以防止個(gè)別牛出現(xiàn)較晚的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng),所有結(jié)果全部進(jìn)行記錄。

        判定標(biāo)準(zhǔn):(1)陰性反應(yīng):注射部位無(wú)炎性反應(yīng),皮厚差(指注射PPD 前后皮皺測(cè)量厚度的差值)在2 mm 以下。(2)疑似陽(yáng)性反應(yīng):局部炎性反應(yīng)不明顯,皮厚差≥2.0 mm,<4 mm。(3)陽(yáng)性反應(yīng):局部出現(xiàn)明顯的炎性反應(yīng),皮厚差≥4.0 mm。 凡判定為疑似陽(yáng)性反應(yīng)的牛,于第一次檢疫后60 d 進(jìn)行復(fù)檢,其結(jié)果仍為可疑,經(jīng)60 d 再?gòu)?fù)檢,如仍為疑似反應(yīng),則直接判定為陽(yáng)性。

        1.2.2 體外檢測(cè)γ-干擾素法

        檢測(cè)所用方法參照國(guó)標(biāo)《牛結(jié)核病診斷體外檢測(cè)γ-IFN》(GB/T 32945-2016)[8]操作。

        1.2.3 PCR 檢測(cè)方法

        將抗凝血按照DNA 提取試劑盒提取DNA。(1)吸取200 μL 血樣于1.5 mL EP 管中,200 μL GA 緩沖液,震蕩;(2)200 μL GB,顛倒混勻,70 ℃、10 min;(3)200 μL 無(wú)水乙醇,混勻,全部加入到吸附柱CB 3,10000 rpm、1 min,棄濾液;(4)500 μL 的GD 緩沖液于CB 3,10000 rpm、1 min,棄濾液;(5)600 μL PW漂洗液于CB 3,10000 rpm、1 min,棄濾液,重復(fù)1 次,棄濾液;(6)將吸附柱放入全新高壓EP 管中,靜置10 min,吸附柱膜正中加入60 μL TE 洗脫液,放置4 min,13000 rpm、2 min,收集EP 管內(nèi)的DNA,-20 ℃保存。

        PCR 參照段旭基等[9]牛結(jié)核桿菌和結(jié)核分枝桿菌IS 1081 基因(IS-1:CGACGCTCTGACCGACAAACT;IS-2:TGCTTGGCGGGTTCTTCG;324 bp) 擴(kuò)增目的片段;PCR 擴(kuò)增體系為:95 ℃5 min;94 ℃2 min,58 ℃1.5 min,72 ℃2 min,35 個(gè)循環(huán);72 ℃10 min;PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 將陽(yáng)性產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。

        1.3 數(shù)據(jù)分析

        文中Kappa 系數(shù)計(jì)算公式如下:

        2 結(jié)果與分析

        2.1 牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

        2020年,對(duì)阿勒泰地區(qū)A-H 共8 個(gè)不同區(qū)域內(nèi)的8580 頭牛應(yīng)用牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行普檢。 由表1 可以看出,該地區(qū)8 個(gè)不同區(qū)域內(nèi)共完成牛結(jié)核檢測(cè)8580 頭,結(jié)核陽(yáng)性牛6頭(含2 份可疑品),陽(yáng)性率為0.07%(6/8580)。 其中,C 區(qū)域、D 區(qū)域、G 區(qū)域和H 區(qū)域牛結(jié)核檢測(cè)陽(yáng)性檢出率均為0.00%,達(dá)到國(guó)家農(nóng)業(yè)部?jī)艋瘶?biāo)準(zhǔn)(0.05%);其余區(qū)域牛結(jié)核檢測(cè)陽(yáng)性檢出率分別為A(0.14%,2/1430)、B(0.15%,0.08/1200)、E(0.08%,1/1300)、F(0.14%,2/1450),陽(yáng)性率均高于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部?jī)艋瘶?biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果表明,阿勒泰地區(qū)不同區(qū)域內(nèi)牛結(jié)核病防控效果存在明顯差異。

        表1 2020 年阿勒泰地區(qū)不同區(qū)域牛結(jié)核檢測(cè)結(jié)果

        2.2 三種不同方法檢測(cè)比對(duì)結(jié)果

        對(duì)106 頭份牛血清樣本應(yīng)用體外檢測(cè)γ-干擾素法、PCR 檢測(cè)方法分別于牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比。 由表2 可以看出,使用牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢出結(jié)核陽(yáng)性牛6 頭,陽(yáng)性率為5.66%(6/106);體外檢測(cè)γ-干擾素試驗(yàn)檢與PCR 方法檢出結(jié)核陽(yáng)性均為5 頭,陽(yáng)性率為4.72%(5/106),與牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢測(cè)之間的Kappa 值為0.81。體外檢測(cè)γ-干擾素法、PCR 檢測(cè)方法分別與牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)對(duì)比的陽(yáng)性符合率均為83.33%(5/6),陰性符合率為99.00%(99/100),牛型結(jié)核菌素PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)敏感性高于體外檢測(cè)γ-干擾素試驗(yàn)、PCR 檢測(cè)方法。 從試驗(yàn)結(jié)果看,Kappa 值≥0.8,檢驗(yàn)結(jié)果一致性很好。

        表2 PCR 方法、體外檢測(cè)γ-干擾素法與牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)比對(duì)結(jié)果

        3 討論

        本試驗(yàn)共檢測(cè)106 頭份樣品,牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試檢測(cè)陽(yáng)性率為5.66%(6/106),體外檢測(cè)γ-干擾素試驗(yàn)檢與PCR 方法檢測(cè)陽(yáng)性率均為4.72%(5/106),與牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)之間的Kappa 值為0.81。 Kappa 系數(shù)用于一致性檢驗(yàn),當(dāng)Kappa 值≥0.80,說(shuō)明檢驗(yàn)結(jié)果一致性很好, 體外檢測(cè)γ-干擾素法、PCR 檢測(cè)方法分別與牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)對(duì)比的陽(yáng)性符合率均為83.33%(5/6),陰性符合率為99.00%(99/100),而符合率為兩種方法共同檢測(cè)一致的結(jié)果,符合率高于85.00%,說(shuō)明方法的檢測(cè)結(jié)果較好。 牛型結(jié)核菌素PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)敏感性高于體外檢測(cè)γ-干擾素試驗(yàn)、PCR 檢測(cè)方法,以上方法的結(jié)果較為可靠,故這三種方法均可用于牛結(jié)核的檢測(cè)。

        在生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用中,牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)是國(guó)家動(dòng)物結(jié)核病檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[10],同時(shí)也是被國(guó)際貿(mào)易方指定的檢測(cè)方法之一。但此種方法存在的誤差較大,在大規(guī)模檢測(cè)中,容易出現(xiàn)陽(yáng)性漏檢情況,如果檢出的陽(yáng)性牛一旦未進(jìn)行處理,則會(huì)污染健康的牛群[11,12]。在實(shí)際檢測(cè)工作中,牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)存在一定的非特異性。 測(cè)量注射部位的皮膚厚度時(shí),游標(biāo)卡尺等測(cè)量?jī)x器需要經(jīng)常核校,認(rèn)為有必要時(shí)還應(yīng)多次測(cè)量,不能僅憑檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)判定結(jié)果,認(rèn)為接種部位沒(méi)有明顯的“凸起”就是正常,陰性結(jié)果,個(gè)別變態(tài)反應(yīng)呈擴(kuò)散狀,表面雖不明顯,但實(shí)際皮膚有增厚反應(yīng),必須借助游標(biāo)卡尺測(cè)量后再判定。 還有很多天氣因素、人為因素等,都會(huì)影響牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)結(jié)果。 綜上所述,此方法受外界環(huán)境及人為因素的影響較為明顯。

        體外檢測(cè)γ-干擾素法可以檢測(cè)早期隱性或無(wú)癥狀感染牛只,敏感性及特異性較高,易于標(biāo)準(zhǔn)化,可以有效降低非特異性反應(yīng)帶來(lái)的假陽(yáng)性問(wèn)題[13]。對(duì)于牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢測(cè)為疑似的??梢灾苯討?yīng)用體外檢測(cè)γ-干擾素法進(jìn)行復(fù)檢,無(wú)需采用牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)等待60 d 后進(jìn)行復(fù)檢。 但是體外檢測(cè)γ-干擾素法需要在采血后8 h 內(nèi)刺激抗原[14,15],且試劑盒主要依靠進(jìn)口,且價(jià)格昂貴,開(kāi)展試驗(yàn)檢測(cè)成本高。 除此之外,還需要生物安全柜、移液器、恒溫箱等儀器設(shè)備來(lái)開(kāi)展實(shí)驗(yàn),對(duì)試驗(yàn)操作人員要求也比較高。

        PCR 檢測(cè)方法同樣具有高敏感性和強(qiáng)特異性,特別是臨床癥狀不明顯或未出現(xiàn)臨床癥狀的隱性感染等,且牛分枝桿菌IS 1081 具有高度的種屬特異性,PCR 檢測(cè)方法重復(fù)性較好,人為因素相對(duì)較小[16],但試劑盒成本比體外檢測(cè)γ-干擾素法試劑盒成本還要高。目前,牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)方法仍然是我國(guó)檢疫標(biāo)準(zhǔn), 體外檢測(cè)γ-干擾素法、PCR 檢測(cè)方法都可以作為牛結(jié)核病的輔助確診方法,可以有效降低非特異性反應(yīng)帶來(lái)的假陽(yáng)性問(wèn)題。

        4 結(jié)論

        綜合分析,牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)是我國(guó)動(dòng)物結(jié)核病檢疫的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),操作簡(jiǎn)單、成本較低,被廣泛應(yīng)用于基層一線,但從試驗(yàn)結(jié)果的可靠性來(lái)講還需要不斷優(yōu)化,體外檢測(cè)γ-干擾素法和PCR 檢測(cè)方法的敏感性及特異性均較高,都可以作為牛結(jié)核病的輔助確診方法,可以有效降低非特異性反應(yīng)帶來(lái)的假陽(yáng)性問(wèn)題。但從成本上來(lái)講,PCR 檢測(cè)方法成本要高于體外檢測(cè)γ-干擾素法。因此,對(duì)于牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢測(cè)為疑似牛,可以直接應(yīng)用體外檢測(cè)γ-干擾素法或PCR 檢測(cè)方法進(jìn)行復(fù)檢,無(wú)需采用牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)等待60 d 后進(jìn)行復(fù)檢。

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