陳滿靜 任艷 彭秋 李青風(fēng) 高杰 鄧小鋒

摘要：高粱炭疽病是威脅高粱生長的主要病害之一，挖掘高粱抗炭疽病相關(guān)基因能夠為高粱抗性品種育種打下基礎(chǔ)。利用前期田間試驗鑒定出的高粱高抗材料F41和高感材料B57進行雜交構(gòu)建F2：3代分離群體，挑選高梁高抗炭疽病植株和高感炭疽病植株各30株，分別構(gòu)建2個極端性狀的DNA混合池，利用高通量測序技術(shù)與集團分離分析法相結(jié)合的方法（BSA-seq）進行全基因組重測序和關(guān)聯(lián)分析，定位和抗性性狀相關(guān)的基因組區(qū)段。通過SNP-index及InDel-index方法進行關(guān)聯(lián)分析及對候選區(qū)域進行基因注釋，共注釋到基因143個，其中非同義突變基因49個，移碼突變基因16個。研究結(jié)果為高粱抗炭疽病分子機制及抗性相關(guān)基因的克隆奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：高粱;炭疽病;抗性;候選區(qū)段;BSA-seq

中圖分類號：S435.14 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）05-0028-07

收稿日期：2021-09-08

基金項目：國家科技支撐計劃（編號：2014BAD07B02-2-4）;黔農(nóng)科院青年基金（ 編號：[2018]57號）。

作者簡介：陳滿靜（1991—），女，貴州三穗人，碩士，助理研究員，主要從事高粱作物栽培技術(shù)研究。E-mail：nkycmj@yeah.net。

通信作者：鄧小鋒，博士，助理研究員，主要從事高粱育種研究。E-mail：dixifor@yeah.net。

高粱[Sorghum bicolor （L.） Moench]作為全球重要的禾谷作物，其耐旱、耐瘠薄的生長優(yōu)勢深受種植人的喜愛。一直以來，高粱主要用于糧食、飼料和釀造加工業(yè)，近年來，以高粱為原料開發(fā)綠色能源的研究也正在興起[1]。白酒釀造作為貴州省的主打產(chǎn)業(yè)，其原料就是有機酒用高粱，據(jù)統(tǒng)計，全貴州省在2018年種植的高粱面積不少于8.67萬hm2，其中有機高粱面積占總面積的50%[2]。高粱炭疽病是危害高粱生長的主要病害之一，侵染源是禾生炭疽菌（Colletotrichum sublineolum P. Henn.，Kabát and Bubák）[3-4]，它能夠侵染高粱所有地上部分組織，包括高粱葉片、莖稈、花序等，病害嚴重時可發(fā)生植株干枯死亡，感病品種生物學(xué)產(chǎn)量減產(chǎn)可達67%，在我國北方甚至能減產(chǎn)78%，嚴重影響高粱的產(chǎn)量和品質(zhì)[5-7]。該病害易在高溫潮濕地區(qū)發(fā)生，但近年來其流行區(qū)域不斷擴展，在貴州省的高粱栽種區(qū)均有發(fā)生。在炭疽病的防治措施中最穩(wěn)定可靠的方法是選育抗炭疽病高粱品種，但因炭疽病病株存在高度變異的生理小種，增加了抗性資源篩選與抗性選育的難度[8-9]。

為研究高粱抗炭疽病機制，定位抗性相關(guān)基因，獲得穩(wěn)定的抗性品種，眾多學(xué)者對各類高粱抗性材料進行了分子連鎖標(biāo)記和抗性基因定位分析。相關(guān)的研究顯示，控制高粱抗炭疽病性狀的基因有呈顯性，也有呈隱性，并且許多材料如 SC414-12E、SC748-5、HC136、Bk7的抗性都受主效數(shù)量性狀座位（QTL）控制[7，10-15]。通過對這些材料進行遺傳分析和連鎖分析后得出抗性主效位點，如利用擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）方法和簡單重復(fù)序列（SSR）方法對材料SC748-5進行關(guān)聯(lián)標(biāo)記，得到1個主效位點，位于5號染色體上，基因長度為1.8 cM;又如利用隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）方法對抗性材料HC136進行關(guān)聯(lián)標(biāo)記，得到1個主效位點;再如單核苷酸多態(tài)性（SNP）法標(biāo)記的Bk7中的抗性性狀主效位點有2個，位于7號染色體48.7 Mb區(qū)間，接近著絲粒;SC414-12E 同樣利用SNP標(biāo)記方法進行關(guān)聯(lián)后，得到3個主效位點，分別位于4、5、7號染色體上。此外，許多學(xué)者利用全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）方法將抗性位點進行基因組定位[16-18]。如Cuevas等通過GWAS方法分析材料群體SAP，在染色體1號與5號上挖掘出5個與抗性性狀相關(guān)的位點，位點注釋分別為Sobic01G37720葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、Sobic01G379400過氧化物酶、obic05G172300：F-box結(jié)構(gòu)域、Sobic05G182400蛋白酪氨酸激酶、obic05G228400咪唑甲合成[16];Cuevas等對NPGS Sudan core collection群體進行GWAS分析，得到4個抗性為點，位于2號染色體上[17];而在2019年，Cuevas等對NPGS Ethiopian sorghum collection進行分析后得到3個抗性位點，位于9號染色體上，位點注釋為Sobic09G012500復(fù)制蛋白A：DNA結(jié)合亞基內(nèi)含子區(qū)、Sobic09G012900：亮氨酸重復(fù)序列、Sobic09G013300：R基因[18]。

集團分離分析法（BSA）技術(shù)是能夠快速準(zhǔn)確地尋找與質(zhì)量性狀基因連鎖分子標(biāo)記的主要途徑之一，其方法在不同作物農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因挖掘上取得了較大進展。曾維英等利用高通量測序技術(shù)與集團分離分析法相結(jié)合（BSA-seq）的方法挖掘到12個大豆抗豆卷葉螟候選基因[19];張之昊等基于BSA-seq技術(shù)定位到了大豆突變體中控制黃622的多小葉的1對不完全顯性基因[20]。本研究在前期試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用BSA技術(shù)快速挖掘貴州高粱抗炭疽病害關(guān)鍵遺傳區(qū)段，為進一步分子連鎖標(biāo)記開發(fā)和育種應(yīng)用及研究高粱對植物真菌葉部病害的抗性機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用2019年田間鑒定出來的高抗炭疽病高粱材料F41與高感炭疽病高粱材料B57雜交，得到F2：3群體種子，群體共約500個株系。炭疽菌菌株收集于貴州省惠水縣好花紅鄉(xiāng)試驗地，在實驗室內(nèi)分離培養(yǎng)，配制炭疽菌侵染的高粱種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 構(gòu)建極端混合池 將F41與B57雜交得到的F2：3群體種子全部播種于貴州省黔南州惠水縣好花紅鄉(xiāng)（26°0′39.29″N，106°34′25.80″E），該區(qū)域常年溫度高、雨水充沛，適合真菌病害的接種試驗。播種時群體內(nèi)的每個株系種植為1個小區(qū)，在拔節(jié)期后進行炭疽病病菌接種，2次重復(fù)。接種時在每個單株的喇叭口中投4～5粒種子，同時田間種植高感材料作為誘導(dǎo)行，2周后田間觀察鑒定，確定高感和高抗材料的純合株小區(qū)，從純合小區(qū)各取30株極端抗性單株葉片和極端感性單株葉片構(gòu)建子代高抗混合池和高感混合池。對2個親本和2個混合池進行重測序和關(guān)聯(lián)分析，定位與抗性性狀相關(guān)聯(lián)的基因組區(qū)段。

1.2.2 混合池DNA提取與測序 采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）提取法將2個親本的葉片樣品及2個極端混合池的葉片樣品的DNA提取出來，將不同群體的DNA逐一等量混合后構(gòu)建4個混合池，分別是2個親本（編號為F41、B57）的高抗混合池和高感混合池，待DNA濃度和質(zhì)量檢測合格之后，交由北京百邁克生物科技有限公司進行樣品文庫構(gòu)建及上機測序，利用Illunima Casava 1.8進行堿基識別分析，測序參數(shù)為雙端測序，讀長為150 bp，參考基因組為Sorghum_bicolor_JGI_v3.1.1版本的高粱基因組，具體操作流程見圖1。

1.2.3 信息分析 將構(gòu)建的樣品文庫上機測序得到原始測序數(shù)據(jù)（raw reads），過濾后得到待分析測序數(shù)據(jù)（clean reads），將clean reads通過BWA軟件與高粱基因組進行比對，根據(jù)clean reads的比對結(jié)果，利用GATK軟件檢測和過濾得到檢測樣品與參考基因組之間高質(zhì)量的可信SNP位點和序列插入與缺失（InDel）位點。

利用歐式距離法（Euclidean distance，簡稱ED）和SNP-index法計算與性狀關(guān)聯(lián)的候選區(qū)域。歐式距離是通過混池間存在的顯著差異標(biāo)記來評估與性狀關(guān)聯(lián)區(qū)域的方法[21]。SNP-index是通過混池間的基因型頻率存在的顯著差異標(biāo)記來進行關(guān)聯(lián)分析的方法[21-22]，用Δ（SNP-index）值統(tǒng)計。

通過BLAST軟件[23]對SNP和InDel結(jié)果的交集區(qū)域中可編碼基因進行深度注釋，準(zhǔn)確挖掘高粱抗炭疽病選候選基因區(qū)段。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

利用Illunima HiSeq高通量測序平臺對2個子代極端混合池和2個親本進行全基因組重測序，過濾后得到40 Gbp高質(zhì)量的clean reads數(shù)據(jù)，Q30≥93.55%，GC含量在42.44%～43.32%之間，插入片段長度呈正態(tài)分布，樣品與參考基因組平均比對效率為97.23%，基因組平均覆蓋深度約為18.50X，基因組覆蓋率約為95.42%（至少覆蓋1X）（表1）。研究結(jié)果表明，該數(shù)據(jù)符合分析標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 SNP和InDel變異檢測與注釋

通過SNP檢測分析，親本之間共獲得1 520 997個SNP，其中非同義突變的SNP共29 661個，混合池之間共獲得1 095 653個SNP，引起非同義突變的SNP共19 086個;通過InDel檢測，親本之間共獲得323 821個小片段插入與缺失（small InDel）;混合池之間共獲得229 420個small InDel（圖2）。

2.3 SNP關(guān)聯(lián)分析

對SNP進行過濾之后得到質(zhì)量高的可信SNP位點754 261個。采用ED算法和SNP-index算法對這些位點數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析。

根據(jù)ED算法關(guān)聯(lián)閾值判定，共得到2個與高粱抗炭疽病相關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域，關(guān)聯(lián)值分布見圖3，區(qū)域所注釋到的基因總長度為1.30 Mb，共包含154個基因，其中非同義突變位點的基因共49個;根據(jù)SNP-index算法關(guān)聯(lián)閾值判定，共得到4個與高粱抗炭疽病相關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域，關(guān)聯(lián)分布見圖4，區(qū)域注釋到的基因總長度為6.77 Mb，共包含896個基因，其中非同義突變位點的基因共179個。2種關(guān)聯(lián)分析方法取交集，得到1個交集區(qū)域，區(qū)域總長度為1.30 Mb，共包含154個基因（表2）。

2.4 InDel關(guān)聯(lián)分析

對InDel位點進行過濾，得到質(zhì)量高的可信InDel位點170 725個。同樣采用ED算法和SNP-index算法對這些位點數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)。根據(jù)ED算法和 SNP-Index 算法分析得到的結(jié)果取交集，共得到2個區(qū)域，區(qū)域總長度為1.82 Mb，共包含基因213個（表3）。

2.5 候選區(qū)段篩選與基因注釋

本研究將SNP關(guān)聯(lián)分析結(jié)果與InDel關(guān)聯(lián)結(jié)果進行分析統(tǒng)計后取交集，最終鎖定高粱抗炭疽病的候選區(qū)域在5號染色體上，候選區(qū)域基因全長為 1.30 Mb，共有基因154個。利用GO[24]、KEGG[25]等數(shù)據(jù)庫對候選區(qū)間內(nèi)的基因進行注釋后，共143個基因被注釋，其中非同義突變基因有49個，移碼突變基因有16個。

2.5.1 GO數(shù)據(jù)庫分析 Gene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫能夠?qū)⑷澜缢信c定位基因有關(guān)的研究結(jié)果進行匯總，利用GO數(shù)據(jù)庫可以在生物學(xué)進程、分子功能和細胞組分3個方面對基因和基因產(chǎn)物進行分類注釋。為明確候選基因在細胞上的位置、分子的功能和參與生物學(xué)進程，將候選區(qū)域154個基因進行GO功能注釋，有86個基因分別被注釋到10個細胞組分、7個分子功能和14個生物學(xué)進程中，分類結(jié)果見圖5?；蛟诩毎M分中主要存在于細胞膜以及細胞器膜中;基因在分子功能中主要發(fā)揮催化、轉(zhuǎn)錄以及信號傳遞等功能;在基因生物學(xué)進程中主要參與免疫過程、代謝過程與生物調(diào)節(jié)等。結(jié)合以上結(jié)果，說明高粱炭疽病脅迫下高粱的抗病響應(yīng)可能有生物膜修復(fù)、逆境中相關(guān)的催化代謝、細胞調(diào)節(jié)與蟲害信息的傳遞等。

2.5.2 KEGG數(shù)據(jù)庫分析 生物體中的生物學(xué)功能是由基因之間的相互協(xié)調(diào)來完成的，代謝通路（Pathway）代表不同基因間相同的作用通路，而KEGG是收集Pathway的公共數(shù)據(jù)庫。為了進一步解讀候選基因的功能，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對候選基因區(qū)段進行Pathway富集分析，154個候選基因被注釋到的基因數(shù)為30個，這30個基因所參與的代謝通路主要為植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、核糖體合成、核苷酸合成、RNA降解與碳代謝等（圖6）。表明當(dāng)高粱受到炭疽病病菌侵害時，植物會出現(xiàn)傳導(dǎo)病害信號的響應(yīng)，體內(nèi)合成代謝增加，產(chǎn)生各種蛋白酶與核酸等物質(zhì)，同時進行RNA等分解代謝抵御炭疽病病菌的入侵。

3 結(jié)論與討論

本試驗利用BSA-seq方法快速挖掘到高粱抗炭疽病關(guān)鍵遺傳區(qū)段，通過對材料全基因組重測序共挖掘得到1個與抗性性狀相關(guān)的候選區(qū)域，位于5號染色體上，關(guān)聯(lián)區(qū)域總長度為1.30 Mb，對候選區(qū)域內(nèi)的基因進行生物信息學(xué)分析后，共注釋到基因143個，經(jīng)過多個數(shù)據(jù)庫的分析發(fā)現(xiàn)，這一關(guān)鍵遺傳區(qū)段內(nèi)的基因可能在高粱抗炭疽病害過程中發(fā)揮著重要作用，為后續(xù)抗性基因的克隆與分子研究奠定了基礎(chǔ)。

前人通過連鎖分析研究顯示，高粱抗炭疽病的主效位點位于4、5、7、9號染色體上[25-27]。如高抗材料SC748-5的抗性主效位點位于5號染色體上約42.5 cM（60.77 Mbp）的位置，材料SC112-14的主效位點位于5號染色體上55.0～56.1 cM區(qū)間內(nèi)，材料SC414-12E的1個抗性相關(guān)位點位于5號染色體上116.90～118.10 cM區(qū)間內(nèi)。此外全基因組關(guān)聯(lián)分析也顯示高粱抗炭疽病的一些抗性基因位于5號染色體上65 193 948、66 491 767、71 578 176、65 136 879～65 137 882 bp位置上[18，28]。

本研究結(jié)果顯示，高粱抗性材料F41的抗性位點位于5號染色體上3 200 000～4 750 000 bp區(qū)間內(nèi)，不同于以上任何抗性位點或基因的位置。同時，已報道的高粱5號染色體上抗炭疽病的抗性基因富集區(qū)域位于53.81～62.16、64.53～66.87 Mbp區(qū)間[27，29]，因此F41的位點是一個新發(fā)現(xiàn)的炭疽病抗性位點，其中的相關(guān)基因是新發(fā)現(xiàn)的抗性相關(guān)基因。該新位點的發(fā)現(xiàn)為研究炭疽病抗性機制及新抗性基因聚合奠定了基礎(chǔ)。

本研究利用BSA-seq方法挖掘到了與高粱抗炭疽病相關(guān)的遺傳基因區(qū)段，但未進一步對候選區(qū)段進行基因篩選。后續(xù)試驗中，將結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序及大群體連鎖分析對候選區(qū)段基因進行鑒定，定位到具體抗性基因。

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