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        基于BSA-seq方法定位貴州高粱抗炭疽病害關(guān)鍵遺傳區(qū)段

        2022-04-01 11:55:05陳滿靜任艷彭秋李青風(fēng)高杰鄧小鋒
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年5期
        關(guān)鍵詞:炭疽病高粱抗性

        陳滿靜 任艷 彭秋 李青風(fēng) 高杰 鄧小鋒

        摘要:高粱炭疽病是威脅高粱生長的主要病害之一,挖掘高粱抗炭疽病相關(guān)基因能夠為高粱抗性品種育種打下基礎(chǔ)。利用前期田間試驗鑒定出的高粱高抗材料F41和高感材料B57進行雜交構(gòu)建F2:3代分離群體,挑選高梁高抗炭疽病植株和高感炭疽病植株各30株,分別構(gòu)建2個極端性狀的DNA混合池,利用高通量測序技術(shù)與集團分離分析法相結(jié)合的方法(BSA-seq)進行全基因組重測序和關(guān)聯(lián)分析,定位和抗性性狀相關(guān)的基因組區(qū)段。通過SNP-index及InDel-index方法進行關(guān)聯(lián)分析及對候選區(qū)域進行基因注釋,共注釋到基因143個,其中非同義突變基因49個,移碼突變基因16個。研究結(jié)果為高粱抗炭疽病分子機制及抗性相關(guān)基因的克隆奠定了理論基礎(chǔ)。

        關(guān)鍵詞:高粱;炭疽病;抗性;候選區(qū)段;BSA-seq

        中圖分類號:S435.14 文獻標(biāo)志碼: A

        文章編號:1002-1302(2022)05-0028-07

        收稿日期:2021-09-08

        基金項目:國家科技支撐計劃(編號:2014BAD07B02-2-4);黔農(nóng)科院青年基金( 編號:[2018]57號)。

        作者簡介:陳滿靜(1991—),女,貴州三穗人,碩士,助理研究員,主要從事高粱作物栽培技術(shù)研究。E-mail:nkycmj@yeah.net。

        通信作者:鄧小鋒,博士,助理研究員,主要從事高粱育種研究。E-mail:dixifor@yeah.net。

        高粱[Sorghum bicolor (L.) Moench]作為全球重要的禾谷作物,其耐旱、耐瘠薄的生長優(yōu)勢深受種植人的喜愛。一直以來,高粱主要用于糧食、飼料和釀造加工業(yè),近年來,以高粱為原料開發(fā)綠色能源的研究也正在興起[1]。白酒釀造作為貴州省的主打產(chǎn)業(yè),其原料就是有機酒用高粱,據(jù)統(tǒng)計,全貴州省在2018年種植的高粱面積不少于8.67萬hm2,其中有機高粱面積占總面積的50%[2]。高粱炭疽病是危害高粱生長的主要病害之一,侵染源是禾生炭疽菌(Colletotrichum sublineolum P. Henn.,Kabát and Bubák)[3-4],它能夠侵染高粱所有地上部分組織,包括高粱葉片、莖稈、花序等,病害嚴(yán)重時可發(fā)生植株干枯死亡,感病品種生物學(xué)產(chǎn)量減產(chǎn)可達67%,在我國北方甚至能減產(chǎn)78%,嚴(yán)重影響高粱的產(chǎn)量和品質(zhì)[5-7]。該病害易在高溫潮濕地區(qū)發(fā)生,但近年來其流行區(qū)域不斷擴展,在貴州省的高粱栽種區(qū)均有發(fā)生。在炭疽病的防治措施中最穩(wěn)定可靠的方法是選育抗炭疽病高粱品種,但因炭疽病病株存在高度變異的生理小種,增加了抗性資源篩選與抗性選育的難度[8-9]。

        為研究高粱抗炭疽病機制,定位抗性相關(guān)基因,獲得穩(wěn)定的抗性品種,眾多學(xué)者對各類高粱抗性材料進行了分子連鎖標(biāo)記和抗性基因定位分析。相關(guān)的研究顯示,控制高粱抗炭疽病性狀的基因有呈顯性,也有呈隱性,并且許多材料如 SC414-12E、SC748-5、HC136、Bk7的抗性都受主效數(shù)量性狀座位(QTL)控制[7,10-15]。通過對這些材料進行遺傳分析和連鎖分析后得出抗性主效位點,如利用擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)方法和簡單重復(fù)序列(SSR)方法對材料SC748-5進行關(guān)聯(lián)標(biāo)記,得到1個主效位點,位于5號染色體上,基因長度為1.8 cM;又如利用隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)方法對抗性材料HC136進行關(guān)聯(lián)標(biāo)記,得到1個主效位點;再如單核苷酸多態(tài)性(SNP)法標(biāo)記的Bk7中的抗性性狀主效位點有2個,位于7號染色體48.7 Mb區(qū)間,接近著絲粒;SC414-12E 同樣利用SNP標(biāo)記方法進行關(guān)聯(lián)后,得到3個主效位點,分別位于4、5、7號染色體上。此外,許多學(xué)者利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)方法將抗性位點進行基因組定位[16-18]。如Cuevas等通過GWAS方法分析材料群體SAP,在染色體1號與5號上挖掘出5個與抗性性狀相關(guān)的位點,位點注釋分別為Sobic01G37720葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、Sobic01G379400過氧化物酶、obic05G172300:F-box結(jié)構(gòu)域、Sobic05G182400蛋白酪氨酸激酶、obic05G228400咪唑甲合成[16];Cuevas等對NPGS Sudan core collection群體進行GWAS分析,得到4個抗性為點,位于2號染色體上[17];而在2019年,Cuevas等對NPGS Ethiopian sorghum collection進行分析后得到3個抗性位點,位于9號染色體上,位點注釋為Sobic09G012500復(fù)制蛋白A:DNA結(jié)合亞基內(nèi)含子區(qū)、Sobic09G012900:亮氨酸重復(fù)序列、Sobic09G013300:R基因[18]。

        集團分離分析法(BSA)技術(shù)是能夠快速準(zhǔn)確地尋找與質(zhì)量性狀基因連鎖分子標(biāo)記的主要途徑之一,其方法在不同作物農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因挖掘上取得了較大進展。曾維英等利用高通量測序技術(shù)與集團分離分析法相結(jié)合(BSA-seq)的方法挖掘到12個大豆抗豆卷葉螟候選基因[19];張之昊等基于BSA-seq技術(shù)定位到了大豆突變體中控制黃622的多小葉的1對不完全顯性基因[20]。本研究在前期試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,利用BSA技術(shù)快速挖掘貴州高粱抗炭疽病害關(guān)鍵遺傳區(qū)段,為進一步分子連鎖標(biāo)記開發(fā)和育種應(yīng)用及研究高粱對植物真菌葉部病害的抗性機制奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        利用2019年田間鑒定出來的高抗炭疽病高粱材料F41與高感炭疽病高粱材料B57雜交,得到F2:3群體種子,群體共約500個株系。炭疽菌菌株收集于貴州省惠水縣好花紅鄉(xiāng)試驗地,在實驗室內(nèi)分離培養(yǎng),配制炭疽菌侵染的高粱種子。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 構(gòu)建極端混合池 將F41與B57雜交得到的F2:3群體種子全部播種于貴州省黔南州惠水縣好花紅鄉(xiāng)(26°0′39.29″N,106°34′25.80″E),該區(qū)域常年溫度高、雨水充沛,適合真菌病害的接種試驗。播種時群體內(nèi)的每個株系種植為1個小區(qū),在拔節(jié)期后進行炭疽病病菌接種,2次重復(fù)。接種時在每個單株的喇叭口中投4~5粒種子,同時田間種植高感材料作為誘導(dǎo)行,2周后田間觀察鑒定,確定高感和高抗材料的純合株小區(qū),從純合小區(qū)各取30株極端抗性單株葉片和極端感性單株葉片構(gòu)建子代高抗混合池和高感混合池。對2個親本和2個混合池進行重測序和關(guān)聯(lián)分析,定位與抗性性狀相關(guān)聯(lián)的基因組區(qū)段。

        1.2.2 混合池DNA提取與測序 采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取法將2個親本的葉片樣品及2個極端混合池的葉片樣品的DNA提取出來,將不同群體的DNA逐一等量混合后構(gòu)建4個混合池,分別是2個親本(編號為F41、B57)的高抗混合池和高感混合池,待DNA濃度和質(zhì)量檢測合格之后,交由北京百邁克生物科技有限公司進行樣品文庫構(gòu)建及上機測序,利用Illunima Casava 1.8進行堿基識別分析,測序參數(shù)為雙端測序,讀長為150 bp,參考基因組為Sorghum_bicolor_JGI_v3.1.1版本的高粱基因組,具體操作流程見圖1。

        1.2.3 信息分析 將構(gòu)建的樣品文庫上機測序得到原始測序數(shù)據(jù)(raw reads),過濾后得到待分析測序數(shù)據(jù)(clean reads),將clean reads通過BWA軟件與高粱基因組進行比對,根據(jù)clean reads的比對結(jié)果,利用GATK軟件檢測和過濾得到檢測樣品與參考基因組之間高質(zhì)量的可信SNP位點和序列插入與缺失(InDel)位點。

        利用歐式距離法(Euclidean distance,簡稱ED)和SNP-index法計算與性狀關(guān)聯(lián)的候選區(qū)域。歐式距離是通過混池間存在的顯著差異標(biāo)記來評估與性狀關(guān)聯(lián)區(qū)域的方法[21]。SNP-index是通過混池間的基因型頻率存在的顯著差異標(biāo)記來進行關(guān)聯(lián)分析的方法[21-22],用Δ(SNP-index)值統(tǒng)計。

        通過BLAST軟件[23]對SNP和InDel結(jié)果的交集區(qū)域中可編碼基因進行深度注釋,準(zhǔn)確挖掘高粱抗炭疽病選候選基因區(qū)段。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

        利用Illunima HiSeq高通量測序平臺對2個子代極端混合池和2個親本進行全基因組重測序,過濾后得到40 Gbp高質(zhì)量的clean reads數(shù)據(jù),Q30≥93.55%,GC含量在42.44%~43.32%之間,插入片段長度呈正態(tài)分布,樣品與參考基因組平均比對效率為97.23%,基因組平均覆蓋深度約為18.50X,基因組覆蓋率約為95.42%(至少覆蓋1X)(表1)。研究結(jié)果表明,該數(shù)據(jù)符合分析標(biāo)準(zhǔn)。

        2.2 SNP和InDel變異檢測與注釋

        通過SNP檢測分析,親本之間共獲得1 520 997個SNP,其中非同義突變的SNP共29 661個,混合池之間共獲得1 095 653個SNP,引起非同義突變的SNP共19 086個;通過InDel檢測,親本之間共獲得323 821個小片段插入與缺失(small InDel);混合池之間共獲得229 420個small InDel(圖2)。

        2.3 SNP關(guān)聯(lián)分析

        對SNP進行過濾之后得到質(zhì)量高的可信SNP位點754 261個。采用ED算法和SNP-index算法對這些位點數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析。

        根據(jù)ED算法關(guān)聯(lián)閾值判定,共得到2個與高粱抗炭疽病相關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域,關(guān)聯(lián)值分布見圖3,區(qū)域所注釋到的基因總長度為1.30 Mb,共包含154個基因,其中非同義突變位點的基因共49個;根據(jù)SNP-index算法關(guān)聯(lián)閾值判定,共得到4個與高粱抗炭疽病相關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域,關(guān)聯(lián)分布見圖4,區(qū)域注釋到的基因總長度為6.77 Mb,共包含896個基因,其中非同義突變位點的基因共179個。2種關(guān)聯(lián)分析方法取交集,得到1個交集區(qū)域,區(qū)域總長度為1.30 Mb,共包含154個基因(表2)。

        2.4 InDel關(guān)聯(lián)分析

        對InDel位點進行過濾,得到質(zhì)量高的可信InDel位點170 725個。同樣采用ED算法和SNP-index算法對這些位點數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)。根據(jù)ED算法和 SNP-Index 算法分析得到的結(jié)果取交集,共得到2個區(qū)域,區(qū)域總長度為1.82 Mb,共包含基因213個(表3)。

        2.5 候選區(qū)段篩選與基因注釋

        本研究將SNP關(guān)聯(lián)分析結(jié)果與InDel關(guān)聯(lián)結(jié)果進行分析統(tǒng)計后取交集,最終鎖定高粱抗炭疽病的候選區(qū)域在5號染色體上,候選區(qū)域基因全長為 1.30 Mb,共有基因154個。利用GO[24]、KEGG[25]等數(shù)據(jù)庫對候選區(qū)間內(nèi)的基因進行注釋后,共143個基因被注釋,其中非同義突變基因有49個,移碼突變基因有16個。

        2.5.1 GO數(shù)據(jù)庫分析 Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫能夠?qū)⑷澜缢信c定位基因有關(guān)的研究結(jié)果進行匯總,利用GO數(shù)據(jù)庫可以在生物學(xué)進程、分子功能和細(xì)胞組分3個方面對基因和基因產(chǎn)物進行分類注釋。為明確候選基因在細(xì)胞上的位置、分子的功能和參與生物學(xué)進程,將候選區(qū)域154個基因進行GO功能注釋,有86個基因分別被注釋到10個細(xì)胞組分、7個分子功能和14個生物學(xué)進程中,分類結(jié)果見圖5。基因在細(xì)胞組分中主要存在于細(xì)胞膜以及細(xì)胞器膜中;基因在分子功能中主要發(fā)揮催化、轉(zhuǎn)錄以及信號傳遞等功能;在基因生物學(xué)進程中主要參與免疫過程、代謝過程與生物調(diào)節(jié)等。結(jié)合以上結(jié)果,說明高粱炭疽病脅迫下高粱的抗病響應(yīng)可能有生物膜修復(fù)、逆境中相關(guān)的催化代謝、細(xì)胞調(diào)節(jié)與蟲害信息的傳遞等。

        2.5.2 KEGG數(shù)據(jù)庫分析 生物體中的生物學(xué)功能是由基因之間的相互協(xié)調(diào)來完成的,代謝通路(Pathway)代表不同基因間相同的作用通路,而KEGG是收集Pathway的公共數(shù)據(jù)庫。為了進一步解讀候選基因的功能,利用KEGG數(shù)據(jù)庫對候選基因區(qū)段進行Pathway富集分析,154個候選基因被注釋到的基因數(shù)為30個,這30個基因所參與的代謝通路主要為植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、核糖體合成、核苷酸合成、RNA降解與碳代謝等(圖6)。表明當(dāng)高粱受到炭疽病病菌侵害時,植物會出現(xiàn)傳導(dǎo)病害信號的響應(yīng),體內(nèi)合成代謝增加,產(chǎn)生各種蛋白酶與核酸等物質(zhì),同時進行RNA等分解代謝抵御炭疽病病菌的入侵。

        3 結(jié)論與討論

        本試驗利用BSA-seq方法快速挖掘到高粱抗炭疽病關(guān)鍵遺傳區(qū)段,通過對材料全基因組重測序共挖掘得到1個與抗性性狀相關(guān)的候選區(qū)域,位于5號染色體上,關(guān)聯(lián)區(qū)域總長度為1.30 Mb,對候選區(qū)域內(nèi)的基因進行生物信息學(xué)分析后,共注釋到基因143個,經(jīng)過多個數(shù)據(jù)庫的分析發(fā)現(xiàn),這一關(guān)鍵遺傳區(qū)段內(nèi)的基因可能在高粱抗炭疽病害過程中發(fā)揮著重要作用,為后續(xù)抗性基因的克隆與分子研究奠定了基礎(chǔ)。

        前人通過連鎖分析研究顯示,高粱抗炭疽病的主效位點位于4、5、7、9號染色體上[25-27]。如高抗材料SC748-5的抗性主效位點位于5號染色體上約42.5 cM(60.77 Mbp)的位置,材料SC112-14的主效位點位于5號染色體上55.0~56.1 cM區(qū)間內(nèi),材料SC414-12E的1個抗性相關(guān)位點位于5號染色體上116.90~118.10 cM區(qū)間內(nèi)。此外全基因組關(guān)聯(lián)分析也顯示高粱抗炭疽病的一些抗性基因位于5號染色體上65 193 948、66 491 767、71 578 176、65 136 879~65 137 882 bp位置上[18,28]。

        本研究結(jié)果顯示,高粱抗性材料F41的抗性位點位于5號染色體上3 200 000~4 750 000 bp區(qū)間內(nèi),不同于以上任何抗性位點或基因的位置。同時,已報道的高粱5號染色體上抗炭疽病的抗性基因富集區(qū)域位于53.81~62.16、64.53~66.87 Mbp區(qū)間[27,29],因此F41的位點是一個新發(fā)現(xiàn)的炭疽病抗性位點,其中的相關(guān)基因是新發(fā)現(xiàn)的抗性相關(guān)基因。該新位點的發(fā)現(xiàn)為研究炭疽病抗性機制及新抗性基因聚合奠定了基礎(chǔ)。

        本研究利用BSA-seq方法挖掘到了與高粱抗炭疽病相關(guān)的遺傳基因區(qū)段,但未進一步對候選區(qū)段進行基因篩選。后續(xù)試驗中,將結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序及大群體連鎖分析對候選區(qū)段基因進行鑒定,定位到具體抗性基因。

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