陳滿靜 任艷 彭秋 李青風 高杰 鄧小鋒

摘要：高粱炭疽病是威脅高粱生長的主要病害之一，挖掘高粱抗炭疽病相關基因能夠為高粱抗性品種育種打下基礎。利用前期田間試驗鑒定出的高粱高抗材料F41和高感材料B57進行雜交構建F2：3代分離群體，挑選高梁高抗炭疽病植株和高感炭疽病植株各30株，分別構建2個極端性狀的DNA混合池，利用高通量測序技術與集團分離分析法相結合的方法（BSA-seq）進行全基因組重測序和關聯分析，定位和抗性性狀相關的基因組區(qū)段。通過SNP-index及InDel-index方法進行關聯分析及對候選區(qū)域進行基因注釋，共注釋到基因143個，其中非同義突變基因49個，移碼突變基因16個。研究結果為高粱抗炭疽病分子機制及抗性相關基因的克隆奠定了理論基礎。

關鍵詞：高粱;炭疽病;抗性;候選區(qū)段;BSA-seq

中圖分類號：S435.14 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）05-0028-07

收稿日期：2021-09-08

基金項目：國家科技支撐計劃（編號：2014BAD07B02-2-4）;黔農科院青年基金（ 編號：[2018]57號）。

作者簡介：陳滿靜（1991—），女，貴州三穗人，碩士，助理研究員，主要從事高粱作物栽培技術研究。E-mail：nkycmj@yeah.net。

通信作者：鄧小鋒，博士，助理研究員，主要從事高粱育種研究。E-mail：dixifor@yeah.net。

高粱[Sorghum bicolor （L.） Moench]作為全球重要的禾谷作物，其耐旱、耐瘠薄的生長優(yōu)勢深受種植人的喜愛。一直以來，高粱主要用于糧食、飼料和釀造加工業(yè)，近年來，以高粱為原料開發(fā)綠色能源的研究也正在興起[1]。白酒釀造作為貴州省的主打產業(yè)，其原料就是有機酒用高粱，據統計，全貴州省在2018年種植的高粱面積不少于8.67萬hm2，其中有機高粱面積占總面積的50%[2]。高粱炭疽病是危害高粱生長的主要病害之一，侵染源是禾生炭疽菌（Colletotrichum sublineolum P. Henn.，Kabát and Bubák）[3-4]，它能夠侵染高粱所有地上部分組織，包括高粱葉片、莖稈、花序等，病害嚴重時可發(fā)生植株干枯死亡，感病品種生物學產量減產可達67%，在我國北方甚至能減產78%，嚴重影響高粱的產量和品質[5-7]。該病害易在高溫潮濕地區(qū)發(fā)生，但近年來其流行區(qū)域不斷擴展，在貴州省的高粱栽種區(qū)均有發(fā)生。在炭疽病的防治措施中最穩(wěn)定可靠的方法是選育抗炭疽病高粱品種，但因炭疽病病株存在高度變異的生理小種，增加了抗性資源篩選與抗性選育的難度[8-9]。

為研究高粱抗炭疽病機制，定位抗性相關基因，獲得穩(wěn)定的抗性品種，眾多學者對各類高粱抗性材料進行了分子連鎖標記和抗性基因定位分析。相關的研究顯示，控制高粱抗炭疽病性狀的基因有呈顯性，也有呈隱性，并且許多材料如 SC414-12E、SC748-5、HC136、Bk7的抗性都受主效數量性狀座位（QTL）控制[7，10-15]。通過對這些材料進行遺傳分析和連鎖分析后得出抗性主效位點，如利用擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）方法和簡單重復序列（SSR）方法對材料SC748-5進行關聯標記，得到1個主效位點，位于5號染色體上，基因長度為1.8 cM;又如利用隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）方法對抗性材料HC136進行關聯標記，得到1個主效位點;再如單核苷酸多態(tài)性（SNP）法標記的Bk7中的抗性性狀主效位點有2個，位于7號染色體48.7 Mb區(qū)間，接近著絲粒;SC414-12E 同樣利用SNP標記方法進行關聯后，得到3個主效位點，分別位于4、5、7號染色體上。此外，許多學者利用全基因組關聯分析（GWAS）方法將抗性位點進行基因組定位[16-18]。如Cuevas等通過GWAS方法分析材料群體SAP，在染色體1號與5號上挖掘出5個與抗性性狀相關的位點，位點注釋分別為Sobic01G37720葡萄糖醛酸轉移酶、Sobic01G379400過氧化物酶、obic05G172300：F-box結構域、Sobic05G182400蛋白酪氨酸激酶、obic05G228400咪唑甲合成[16];Cuevas等對NPGS Sudan core collection群體進行GWAS分析，得到4個抗性為點，位于2號染色體上[17];而在2019年，Cuevas等對NPGS Ethiopian sorghum collection進行分析后得到3個抗性位點，位于9號染色體上，位點注釋為Sobic09G012500復制蛋白A：DNA結合亞基內含子區(qū)、Sobic09G012900：亮氨酸重復序列、Sobic09G013300：R基因[18]。

集團分離分析法（BSA）技術是能夠快速準確地尋找與質量性狀基因連鎖分子標記的主要途徑之一，其方法在不同作物農藝性狀相關的基因挖掘上取得了較大進展。曾維英等利用高通量測序技術與集團分離分析法相結合（BSA-seq）的方法挖掘到12個大豆抗豆卷葉螟候選基因[19];張之昊等基于BSA-seq技術定位到了大豆突變體中控制黃622的多小葉的1對不完全顯性基因[20]。本研究在前期試驗結果的基礎上，利用BSA技術快速挖掘貴州高粱抗炭疽病害關鍵遺傳區(qū)段，為進一步分子連鎖標記開發(fā)和育種應用及研究高粱對植物真菌葉部病害的抗性機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用2019年田間鑒定出來的高抗炭疽病高粱材料F41與高感炭疽病高粱材料B57雜交，得到F2：3群體種子，群體共約500個株系。炭疽菌菌株收集于貴州省惠水縣好花紅鄉(xiāng)試驗地，在實驗室內分離培養(yǎng)，配制炭疽菌侵染的高粱種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 構建極端混合池 將F41與B57雜交得到的F2：3群體種子全部播種于貴州省黔南州惠水縣好花紅鄉(xiāng)（26°0′39.29″N，106°34′25.80″E），該區(qū)域常年溫度高、雨水充沛，適合真菌病害的接種試驗。播種時群體內的每個株系種植為1個小區(qū)，在拔節(jié)期后進行炭疽病病菌接種，2次重復。接種時在每個單株的喇叭口中投4～5粒種子，同時田間種植高感材料作為誘導行，2周后田間觀察鑒定，確定高感和高抗材料的純合株小區(qū)，從純合小區(qū)各取30株極端抗性單株葉片和極端感性單株葉片構建子代高抗混合池和高感混合池。對2個親本和2個混合池進行重測序和關聯分析，定位與抗性性狀相關聯的基因組區(qū)段。

1.2.2 混合池DNA提取與測序 采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）提取法將2個親本的葉片樣品及2個極端混合池的葉片樣品的DNA提取出來，將不同群體的DNA逐一等量混合后構建4個混合池，分別是2個親本（編號為F41、B57）的高抗混合池和高感混合池，待DNA濃度和質量檢測合格之后，交由北京百邁克生物科技有限公司進行樣品文庫構建及上機測序，利用Illunima Casava 1.8進行堿基識別分析，測序參數為雙端測序，讀長為150 bp，參考基因組為Sorghum_bicolor_JGI_v3.1.1版本的高粱基因組，具體操作流程見圖1。

1.2.3 信息分析 將構建的樣品文庫上機測序得到原始測序數據（raw reads），過濾后得到待分析測序數據（clean reads），將clean reads通過BWA軟件與高粱基因組進行比對，根據clean reads的比對結果，利用GATK軟件檢測和過濾得到檢測樣品與參考基因組之間高質量的可信SNP位點和序列插入與缺失（InDel）位點。

利用歐式距離法（Euclidean distance，簡稱ED）和SNP-index法計算與性狀關聯的候選區(qū)域。歐式距離是通過混池間存在的顯著差異標記來評估與性狀關聯區(qū)域的方法[21]。SNP-index是通過混池間的基因型頻率存在的顯著差異標記來進行關聯分析的方法[21-22]，用Δ（SNP-index）值統計。

通過BLAST軟件[23]對SNP和InDel結果的交集區(qū)域中可編碼基因進行深度注釋，準確挖掘高粱抗炭疽病選候選基因區(qū)段。

2 結果與分析

2.1 數據質量評估

利用Illunima HiSeq高通量測序平臺對2個子代極端混合池和2個親本進行全基因組重測序，過濾后得到40 Gbp高質量的clean reads數據，Q30≥93.55%，GC含量在42.44%～43.32%之間，插入片段長度呈正態(tài)分布，樣品與參考基因組平均比對效率為97.23%，基因組平均覆蓋深度約為18.50X，基因組覆蓋率約為95.42%（至少覆蓋1X）（表1）。研究結果表明，該數據符合分析標準。

2.2 SNP和InDel變異檢測與注釋

通過SNP檢測分析，親本之間共獲得1 520 997個SNP，其中非同義突變的SNP共29 661個，混合池之間共獲得1 095 653個SNP，引起非同義突變的SNP共19 086個;通過InDel檢測，親本之間共獲得323 821個小片段插入與缺失（small InDel）;混合池之間共獲得229 420個small InDel（圖2）。

2.3 SNP關聯分析

對SNP進行過濾之后得到質量高的可信SNP位點754 261個。采用ED算法和SNP-index算法對這些位點數據進行關聯分析。

根據ED算法關聯閾值判定，共得到2個與高粱抗炭疽病相關聯的染色體區(qū)域，關聯值分布見圖3，區(qū)域所注釋到的基因總長度為1.30 Mb，共包含154個基因，其中非同義突變位點的基因共49個;根據SNP-index算法關聯閾值判定，共得到4個與高粱抗炭疽病相關聯的染色體區(qū)域，關聯分布見圖4，區(qū)域注釋到的基因總長度為6.77 Mb，共包含896個基因，其中非同義突變位點的基因共179個。2種關聯分析方法取交集，得到1個交集區(qū)域，區(qū)域總長度為1.30 Mb，共包含154個基因（表2）。

2.4 InDel關聯分析

對InDel位點進行過濾，得到質量高的可信InDel位點170 725個。同樣采用ED算法和SNP-index算法對這些位點數據進行關聯。根據ED算法和 SNP-Index 算法分析得到的結果取交集，共得到2個區(qū)域，區(qū)域總長度為1.82 Mb，共包含基因213個（表3）。

2.5 候選區(qū)段篩選與基因注釋

本研究將SNP關聯分析結果與InDel關聯結果進行分析統計后取交集，最終鎖定高粱抗炭疽病的候選區(qū)域在5號染色體上，候選區(qū)域基因全長為 1.30 Mb，共有基因154個。利用GO[24]、KEGG[25]等數據庫對候選區(qū)間內的基因進行注釋后，共143個基因被注釋，其中非同義突變基因有49個，移碼突變基因有16個。

2.5.1 GO數據庫分析 Gene Ontology（GO）數據庫能夠將全世界所有與定位基因有關的研究結果進行匯總，利用GO數據庫可以在生物學進程、分子功能和細胞組分3個方面對基因和基因產物進行分類注釋。為明確候選基因在細胞上的位置、分子的功能和參與生物學進程，將候選區(qū)域154個基因進行GO功能注釋，有86個基因分別被注釋到10個細胞組分、7個分子功能和14個生物學進程中，分類結果見圖5?；蛟诩毎M分中主要存在于細胞膜以及細胞器膜中;基因在分子功能中主要發(fā)揮催化、轉錄以及信號傳遞等功能;在基因生物學進程中主要參與免疫過程、代謝過程與生物調節(jié)等。結合以上結果，說明高粱炭疽病脅迫下高粱的抗病響應可能有生物膜修復、逆境中相關的催化代謝、細胞調節(jié)與蟲害信息的傳遞等。

2.5.2 KEGG數據庫分析 生物體中的生物學功能是由基因之間的相互協調來完成的，代謝通路（Pathway）代表不同基因間相同的作用通路，而KEGG是收集Pathway的公共數據庫。為了進一步解讀候選基因的功能，利用KEGG數據庫對候選基因區(qū)段進行Pathway富集分析，154個候選基因被注釋到的基因數為30個，這30個基因所參與的代謝通路主要為植物激素信號轉導、核糖體合成、核苷酸合成、RNA降解與碳代謝等（圖6）。表明當高粱受到炭疽病病菌侵害時，植物會出現傳導病害信號的響應，體內合成代謝增加，產生各種蛋白酶與核酸等物質，同時進行RNA等分解代謝抵御炭疽病病菌的入侵。

3 結論與討論

本試驗利用BSA-seq方法快速挖掘到高粱抗炭疽病關鍵遺傳區(qū)段，通過對材料全基因組重測序共挖掘得到1個與抗性性狀相關的候選區(qū)域，位于5號染色體上，關聯區(qū)域總長度為1.30 Mb，對候選區(qū)域內的基因進行生物信息學分析后，共注釋到基因143個，經過多個數據庫的分析發(fā)現，這一關鍵遺傳區(qū)段內的基因可能在高粱抗炭疽病害過程中發(fā)揮著重要作用，為后續(xù)抗性基因的克隆與分子研究奠定了基礎。

前人通過連鎖分析研究顯示，高粱抗炭疽病的主效位點位于4、5、7、9號染色體上[25-27]。如高抗材料SC748-5的抗性主效位點位于5號染色體上約42.5 cM（60.77 Mbp）的位置，材料SC112-14的主效位點位于5號染色體上55.0～56.1 cM區(qū)間內，材料SC414-12E的1個抗性相關位點位于5號染色體上116.90～118.10 cM區(qū)間內。此外全基因組關聯分析也顯示高粱抗炭疽病的一些抗性基因位于5號染色體上65 193 948、66 491 767、71 578 176、65 136 879～65 137 882 bp位置上[18，28]。

本研究結果顯示，高粱抗性材料F41的抗性位點位于5號染色體上3 200 000～4 750 000 bp區(qū)間內，不同于以上任何抗性位點或基因的位置。同時，已報道的高粱5號染色體上抗炭疽病的抗性基因富集區(qū)域位于53.81～62.16、64.53～66.87 Mbp區(qū)間[27，29]，因此F41的位點是一個新發(fā)現的炭疽病抗性位點，其中的相關基因是新發(fā)現的抗性相關基因。該新位點的發(fā)現為研究炭疽病抗性機制及新抗性基因聚合奠定了基礎。

本研究利用BSA-seq方法挖掘到了與高粱抗炭疽病相關的遺傳基因區(qū)段，但未進一步對候選區(qū)段進行基因篩選。后續(xù)試驗中，將結合轉錄組測序及大群體連鎖分析對候選區(qū)段基因進行鑒定，定位到具體抗性基因。

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