張文韜 楊皓 毛國豪 莊家堯 陳新峰

摘要：從野生大豆根瘤內(nèi)分離出菌株Y1并對其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，觀察其特性以及對大豆的促生作用。16S rDNA鑒定表明，菌株Y1為高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）;采用Salkowski法驗(yàn)證該菌株產(chǎn)生長素（IAA）的能力，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)IAA的量為38.49 mg/L。同時該內(nèi)生菌具有解有機(jī)磷和無機(jī)磷的能力，溶磷量分別為71.48、152.36 mg/L。將菌劑接種到大豆幼苗后觀察其促生能力，結(jié)果顯示，接種該菌株可顯著增加大豆的株高和根長，同時，大豆葉片光合參數(shù)也有所提升。該結(jié)果可為研發(fā)新型微生物肥料提供優(yōu)質(zhì)菌種，為進(jìn)一步研究芽孢桿菌屬促生潛力提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：高地芽孢桿菌;16S rDNA;鑒定;促生潛力

中圖分類號： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）05-0225-04

收稿日期：2021-09-29

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號：2017YFC0505500）;江蘇省教育廳資助項(xiàng)目（編號：2019JSJG247）;江蘇省高等學(xué)校林學(xué)優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（編號：164010641）。

作者簡介：張文韜（1998—），女，山東濟(jì)南人，碩士研究生，研究方向?yàn)樗帘３峙c荒漠化防治。E-mail：szdl123456@sina.cn。

通信作者：莊家堯，博士，副教授，研究方向?yàn)樗帘３峙c荒漠化防治。 E-mail： nlzjiayao@njfu.edu.cn。

近代以來人口急劇增加，隨之而來的糧食短缺這一問題日益嚴(yán)峻，而糧食作物生長過程中農(nóng)藥化肥的使用不可避免。同時，農(nóng)藥化肥過度使用也帶來了環(huán)境污染、土壤板結(jié)鹽漬化等許多問題。近年來，微生物菌肥因其高效、綠色的特點(diǎn)走入了大眾視線。微生物菌肥是以微生物的生命活動導(dǎo)致作物得到特定肥料效應(yīng)的一種制品[1]，通過微生物自身分解作用，可以起到增加土壤肥力、供給植物養(yǎng)分等作用。相較于傳統(tǒng)化肥，微生物菌肥有以下明顯優(yōu)勢：（1）促進(jìn)植物生長，提高產(chǎn)量品質(zhì)?？梢酝ㄟ^促進(jìn)營養(yǎng)獲取或改變植物激素水平來直接促進(jìn)生長，也可以通過減少各種病原體對植物生長的抑制作用來間接促進(jìn)生長發(fā)育，根瘤菌、巨大芽孢桿菌、多黏芽孢桿菌等是非常常見的植物生長促進(jìn)細(xì)菌，有助于大幅提高作物產(chǎn)量和整個植物的生長[2]。（2）減少連作障礙，防范病蟲害。微生物菌肥能夠?qū)ν寥乐械牟≡置谖镞M(jìn)行分解和抑制，來幫助土壤中有益微生物進(jìn)行繁殖[3]，起到生物防治的效果。（3）改良土壤，增加土壤肥力。施用微生物菌肥可以增加土壤中的有益菌數(shù)量，提高土壤的保水保溫能力。同時部分菌肥可以起到固氮作用，一些微生物可以活化土壤里磷鉀礦物，幫助植物溶解磷鉀元素，從而增加土壤肥力[4]。

在我國已經(jīng)登記在冊的有7 608種微生物菌肥商品，應(yīng)用最廣泛的為鏈霉菌屬（Streptomyces）、芽孢桿菌屬（Bacillus） 和乳酸桿菌屬（Lacto bacillus） 的菌種，其中又以芽孢桿菌屬應(yīng)用率最高。李銘東等研究了多黏類芽孢桿菌菌劑對于玉米生長的影響，發(fā)現(xiàn)在施用多黏類芽孢桿菌菌劑和正?；瘜W(xué)肥料混合的處理比單獨(dú)施用正?；瘜W(xué)肥料的處理，玉米的出苗率和苗高更高，同時發(fā)現(xiàn)使用菌劑的處理比沒有添加菌劑的處理根腐病發(fā)病率更低，玉米的產(chǎn)量更高[5]。高加明等從土壤中分離篩選1種高效解鉀菌菌株NGW1并應(yīng)用于煙草栽培，發(fā)現(xiàn)添加菌種的植株其有效葉數(shù)、株高、最大葉寬、莖圍指標(biāo)均高于對照組[6]。鐘松等通過在土壤施加膠質(zhì)芽孢桿菌菌肥，發(fā)現(xiàn)該菌肥可有效提升高寒草原土速效養(yǎng)分，促進(jìn)高寒草原牧草的根系生長[7]。

試驗(yàn)菌株Y1是筆者所在課題組前期從野生大豆（Glycine soja）瘤內(nèi)分離純化得到的。首先對其進(jìn)行16S rDNA測序鑒定其菌種，分析該菌種的生物學(xué)地位。隨后分別對其產(chǎn)生長素能力、溶磷能力指標(biāo)進(jìn)行測定，最后將其接種到大豆植株上觀察其促生效應(yīng)，以期發(fā)掘優(yōu)良的植物促生菌種資源，為芽孢桿菌菌肥的開發(fā)和廣泛利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)材料

酵母甘露醇瓊脂（YMA）培養(yǎng)基：甘露醇10 g、七水硫酸鎂 0.2 g、氯化鈉0.1 g、酵母粉3 g、磷酸氫二鉀0.25 g、磷酸二氫鉀 0.25 g、碳酸鈣3 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值7.0（液體培養(yǎng)基內(nèi)不放瓊脂）。

Salkowski比色液：1 mL 0.5 mol/L FeCl3溶解于49 mL 35%濃H2SO4。

無機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、硫酸銨0.5 g、酵母粉0.5 g、氯化鈉0.3 g、氯化鉀0.3 g、硫酸鎂0.3 g、硫酸亞鐵0.03 g、硫酸錳0.03 g;磷酸鈣5 g、瓊脂 15 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值7.0。

有機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、硫酸銨0.5 g、酵母粉0.5 g、氯化鈉0.3 g、氯化鉀0.3 g、硫酸鎂0.3 g、硫酸亞鐵0.03 g、硫酸錳0.03 g、卵磷脂0.2 g、碳酸鈣1 g、瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值7.0。

1.2 菌種16S rDNA序列鑒定

提取Y1的DNA后，進(jìn)行16S DNA的擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠檢測，觀察條帶性狀。利用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0純化試劑盒對產(chǎn)物進(jìn)行純化。將純化后產(chǎn)物送至廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行比對，獲知與該細(xì)菌的16S DNA序列同源性最高的已知序列。細(xì)菌測序所用的引物為通用引物515F/907R，引物序列515F ：5′-GTGCCAGCMGCCGCCG-3′; 907R ：5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′。

1.3 供試菌株分泌生長素（IAA）測定

在滅菌的YMA液體培養(yǎng)液中加入200 mg/L的L-色氨酸，接種Y1菌株后置于28 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，7 d后，取50 μL菌懸液滴于白色塑料比色板上，同時加50 μL Salkowski比色液。將白色陶瓷板放在室溫下避光30 min，若顏色變紅表示Y1具有分泌生長素的能力[8]。菌株Y1產(chǎn)生IAA的濃度參考劉玉珍等的計(jì)算方法[9]。本試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 供試菌株溶磷能力測定

1.4.1 定性測定 將制備的單一菌株活化后，用牙簽點(diǎn)至無機(jī)磷和有機(jī)磷培養(yǎng)基平板中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中7 d，在平板中菌落周圍出現(xiàn)透明圈的即為解磷菌。

1.4.2 定量測定 將菌株Y1接種于新鮮牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d制成菌液，取1 mL加入無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，用鉬銻抗比色法來測定上清液中有效磷含量。具體步驟參照文獻(xiàn)[10]。

1.5 大豆促生試驗(yàn)

試驗(yàn)于2021年4月在南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院簡易大棚內(nèi)進(jìn)行。大豆促生試驗(yàn)參照舒健虹等的方法[11]，并作修改：將花土 ∶蛭石按體積比 3 ∶1 混合滅菌后放入花盆中，每個花盆放6 L混合土。把發(fā)芽程度相似的大豆種子播于盆中，放置在氣候箱內(nèi)，在長出第1張真葉時，每株植物根部各接種 1 mL 菌懸液，以接種1 mL滅菌培養(yǎng)液為對照。每 3 d 噴灑1次營養(yǎng)液保持濕潤。45 d后，測其地上部分與地下部分生長情況。并使用LI-6400便攜式光合儀（Li-Cor Inc.USA）測定大豆葉片的光合數(shù)據(jù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和計(jì)算，利用SPSS 26.0進(jìn)行顯著性差異分析，使用Origin 2018軟件制圖。利用生物信息平臺提供軟件MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 Y1的分子鑒定

Y1的16S區(qū)序列在GenBank對比后發(fā)現(xiàn)該菌株為Bacillus altitudinis（高地芽孢桿菌），將菌株Y1的16S rDNA測序結(jié)果進(jìn)行同源性比較后利用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)其與Bacillus pumilus（AY456263）的同源性最近（圖1）。

2.2 Y1分泌植物生長素能力鑒定

由圖2可知，室溫避光30 min后，白色瓷板上的液體明顯變成粉紅色，說明菌株Y1具有產(chǎn)生長素能力。用3-吲哚乙酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.046 978x（r2=0.99），經(jīng)計(jì)算，菌株Y1產(chǎn)IAA量為38.49 mg/L。

2.3 Y1解磷能力

2.3.1 定性測定 由圖3可知，Y1在無機(jī)磷和有機(jī)磷培養(yǎng)基上均有明顯透明溶磷圈出現(xiàn)。

2.3.2 定量測定 由圖4可知，菌株Y1在無機(jī)磷和有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中的溶磷量隨時間變化呈增加趨勢，且溶解無機(jī)磷的能力高于溶解有機(jī)磷。7 d時，菌株Y1無機(jī)磷和有機(jī)磷中的溶磷量分別為152.36、71.48 mg/L。

2.4 接種菌株Y1對大豆葉片光合作用的影響

由表1可見，加菌組凈光合速率與對照相比顯著增加136.73%，氣孔導(dǎo)度與對照組相比顯著增加120.69%，胞間CO2濃度比對照組顯著提升28.95%，蒸騰速率與對照組相比顯著增加168.57%，達(dá)0.94 mmol/（m2·s），水分利用效率相比對照增加不顯著。

2.5 接種菌株Y1對大豆植株生長指標(biāo)的影響

由表2可見，接種Y1菌株45 d后，株高顯著增加23.82%，根長顯著增加26.98%，地上部分鮮質(zhì)量、地上部分干質(zhì)量、莖粗均有所增加但并不顯著。這可能是由于植株之間這類指標(biāo)的差異本身就小，所以無顯著變化。

3 討論與結(jié)論

吲哚乙酸（IAA）是植物存活過程中不可缺少的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物根部對IAA非常敏感，多數(shù)植物內(nèi)生菌都有產(chǎn)IAA的能力[12]。陳迪等從檳榔根際土壤和檳榔葉柄中分離細(xì)菌，測量它們對檳榔盆栽苗的促生能力，得到了有明顯促生作用的菌株 DC-7，測得吲哚乙酸（IAA）含量為35.78 mg/L，說明菌株DC-7的促生長作用可能來源于它的產(chǎn)IAA能力[13]。姜云等從人參中分離出菌株蘇云金芽孢桿菌JJ5-2的產(chǎn)IAA能力為10.2 mg/L[14]。本試驗(yàn)中，菌株Y1的產(chǎn)IAA量為38.49 mg/L，說明該菌株有較高的產(chǎn)IAA能力。

土壤庫中存在著大量磷素，但能夠直接被植物吸收利用的可溶性磷的含量很低，為實(shí)現(xiàn)環(huán)境友好型的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略目標(biāo)，應(yīng)在增加作物產(chǎn)量的基礎(chǔ)上減少化學(xué)肥料的使用。溶磷菌可以促進(jìn)土壤中有效磷的釋放，提供植物生長發(fā)育所必需的磷元素，促進(jìn)植物的生長發(fā)育[15]。芽孢桿菌屬是目前報(bào)道的溶磷能力較強(qiáng)的菌種之一[16]。Hameeda等將篩選得到的5株解磷菌進(jìn)行了盆栽和大田試驗(yàn)，結(jié)果均表明接菌后能夠促進(jìn)玉米的生長[17]。宋娟等從楓香根際土壤中篩選出4株解磷菌，并將其接種于楓香幼苗，發(fā)現(xiàn)該菌能夠顯著提高楓香的株高和地徑[18]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株Y1在無機(jī)磷和有機(jī)磷培養(yǎng)基板可以產(chǎn)生透明溶磷圈，具有解磷能力。同時，該菌株在無機(jī)磷和有機(jī)磷培養(yǎng)基中的溶磷量分別為152.36、71.48 mg/L。韋宜慧等從杉木林中篩選出溶磷能力最強(qiáng)的3株菌株，其溶解無機(jī)磷量分別為195.61、109.20、78.86 mg/L[19]。Irawan等從油棕（Elaeis quineensis）根際土壤篩選出的溶磷菌溶解無機(jī)磷量為58.6 mg/L[20]。說明Y1菌株的溶磷能力在溶解無機(jī)磷能力中屬于偏上水平，且兼具溶解有機(jī)磷的能力，是一株可以用作微生物肥料的菌株。

光合作用是植物生長發(fā)育最基本的生理活動之一，能夠?yàn)樽陨硖峁┧枰奈镔|(zhì)和能量[21]。其中凈光合速率是指植物通過葉綠素吸收固定光能輻射，在光合作用過程中積累有機(jī)物質(zhì)，通常用于表征植物的光合效率。蒸騰速率能夠反映植物體內(nèi)礦物質(zhì)和水分運(yùn)輸?shù)膹?qiáng)弱以及葉片在強(qiáng)光下降溫的效果。氣孔導(dǎo)度通常表現(xiàn)為植物葉片細(xì)胞的開合程度，在很大程度上決定了植物對二氧化碳的吸收作用、植被的光合效率以及呼吸速率。水分利用效率能夠反映植物在生長過程中的能量轉(zhuǎn)化效率[22]。本試驗(yàn)中大豆接種菌株Y1后光合參數(shù)提升，能夠提升大豆對光的利用效率，從而促進(jìn)光合作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]武興友.微生物菌肥對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響及研究趨勢分析[J]. 中國果菜，2018，38（4）：9-11，15.

[2]Mahanty T，Bhattacharjee S，Goswami M，et al. Biofertilizers：a potential approach for sustainable agriculture development[J]. Environmental Science and Pollution Research，2017，24（4）：3315-3335.

[3]劉 曉. 微生物菌肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)，2021（17）：14-15.

[4]鄭茗月，李海梅，趙金山，等. 微生物肥料的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，30（11）：52-56.

[5]李銘東，吳成生，沈 彤，等. 多黏類芽孢桿菌菌劑在玉米上的應(yīng)用效果[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（3）：141-143.

[6]高加明，張健行，佘夢林，等. 土壤高效解鉀菌的篩選鑒定及煙草栽培應(yīng)用效果評價(jià)[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，60（7）：34-39，46.

[7]鐘 松，高俊程，董世魁，等. 黃河源區(qū)高寒草原土壤對不同PGPR菌肥的響應(yīng)[J]. 蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2021，57（3）：294-301.

[8]Glickmann E，Dessaux Y.A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology，1995，61（2）：793-796.

[9]劉玉珍，鄧振山，高 飛，等. 一株巨菌草內(nèi)生細(xì)菌的鑒定及其促生特性初步分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，45（3）：88-93，173.

[10]伍善東，劉冬華，郭照輝，等. 1株高效解無機(jī)磷細(xì)菌JP-7的分離、鑒定及溶磷能力分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（12）：374-376.

[11]舒健虹，王子苑，劉曉霞，等. 牧草促生菌分離鑒定及對大豆促生性能的研究[J]. 中國土壤與肥料，2020（4）：215-222.

[12]馬驄毓，張 英，馬文彬，等. 黃芪根際促生菌（PGPR）篩選與特性研究[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2017，26（1）：149-159.

[13]陳 迪，芮 凱，曾 濤，等. 一株具有產(chǎn)IAA能力的解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及功能評價(jià)[J]. 中國熱帶農(nóng)業(yè)，2021（3）：50-58.

[14]姜 云，田 磊，陳長卿，等. 一株人參內(nèi)生產(chǎn)吲哚乙酸細(xì)菌的篩選及鑒定[J]. 中國中藥雜志，2015，40（2）：213-217.

[15]楊海霞，劉希旻，潘奕臣，等. 耐鹽堿溶磷菌Y2R2的分離鑒定及溶磷特性[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2020，36（10）：127-134.

[16]Liu F P，Liu H Q，Zhou H L，et al. Isolation and characterization of phosphate-solubilizing bacteria from betel nut （Areca catechu） and their effects on plant growth and phosphorus mobilization in tropical soils[J]. Biology and Fertility of Soils，2014，50（6）：927-937.

[17]Hameeda B，Harini G，Rupela O P，et al. Growth promotion of maize by phosphate-solubilizing bacteria isolated from composts and macrofauna[J]. Microbiological Research，2008，163（2）：234-242.

[18]宋 娟，徐國芳，趙 邢，等. 楓香根際解有機(jī)磷細(xì)菌篩選及其促生效應(yīng)[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2020，44（3）：95-104.

[19]韋宜慧，陳嘉琪，趙光宇，等. 杉木林土壤和苗木內(nèi)生溶磷細(xì)菌的篩選及其溶磷特性[J]. 林業(yè)科學(xué)，2020，56（12）：1-9.

[20]Irawan A F，Baskara G，Wandri R，et al. Isolation and solubilisation of inorganic phosphate by Burkholderia spp. from the rhizosphere of oil palm[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences，2020，23（5）：667-673.

[21]康偉健. 強(qiáng)光照光時間影響玉米光合作用適應(yīng)的機(jī)制[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[22]馮玉龍，曹坤芳，馮志立. 生長光強(qiáng)對4種熱帶雨林樹苗光合機(jī)構(gòu)的影響[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2002，28（2）：153-160.