周煒凱 劉萍茹 陳心怡 吳曉梅 薛斌

摘 要：微生物間的拮抗作用可以抑制其中一種微生物的生長(zhǎng)，抑制率高且不會(huì)引入其他成分。芒果作為一種熱帶經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的水果，一直飽受炭疽病的侵害。本文以巨大芽孢桿菌為例探討拮抗微生物及其次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)芒果炭疽病的抑制作用。抑菌實(shí)驗(yàn)和果實(shí)噴淋實(shí)驗(yàn)表明，巨大芽孢桿菌可以抑制炭疽病的發(fā)生，其次級(jí)代謝產(chǎn)物也可以延緩芒果的成熟，從而減小芒果在運(yùn)輸和保藏過(guò)程中的腐爛率。延長(zhǎng)貯藏期和完善保鮮度可以提高經(jīng)濟(jì)效益以及水果食用價(jià)值，為消費(fèi)者提供安全、健康的水果產(chǎn)品。

關(guān)鍵詞：拮抗微生物;芒果;巨大芽孢桿菌;冷鏈保鮮

Exploring the Effects of Antagonistic Microorganisms and Their Secondary Metabolites on the Cold Chain Preservation of Mango

ZHOU Weikai， LIU Pingru， CHEN Xinyi， WU Xiaomei， XUE Bin*

（Guangzhou College of Technology and Business， Faculty of Engineering， Guangzhou 510850， China）

Abstract： A large number of studies have shown that the antagonism between microorganisms can inhibit the growth of one of the microorganisms with a high inhibition rate without introducing other components. As a tropical fruit with high economic value， mango has been suffering from anthracnose. In this paper， Bacillus megaterium was used as an example to investigate the inhibitory effect of antagonistic microorganisms and their secondary metabolites on mango anthracnose. Bacillus megaterium can inhibit the occurrence of anthracnose， and its secondary metabolites can also delay the ripening of mangoes， thereby reducing the decay rate of mangoes during transportation and storage. Extending the storage period and improving the freshness can improve economic efficiency and fruit edible value， and provide consumers with safe and healthy fruit products.

Keywords： antagonistic microorganisms; mango; Bacillus megaterium; cold chain preservation

芒果，為漆樹科（Anacardiaceae）芒果屬（Mangifera）熱帶常綠大喬木，又稱“庵羅果、悶果”，原產(chǎn)于印度及馬來(lái)西亞，為漿果狀核果，果肉細(xì)膩，因其獨(dú)特的香味和口感深受消費(fèi)者的青睞。芒果果實(shí)富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，尤其是維生素A的含量遠(yuǎn)高于其他水果，其原料可供直接使用或經(jīng)加工后做成果汁、果漿等產(chǎn)品出售[1]。近年來(lái)，芒果的栽培面積不斷擴(kuò)大，產(chǎn)量也逐年上升。中國(guó)作為世界主要芒果生產(chǎn)國(guó)之一，產(chǎn)量龐大。芒果產(chǎn)業(yè)也逐漸成為中國(guó)熱帶地區(qū)農(nóng)民主要收入來(lái)源之一。

芒果采收的季節(jié)一般在高溫高濕的夏季，而芒果屬于呼吸躍變型果實(shí)，其在采后易因后熟而腐爛，這不僅直接損害了農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)利益，還造成了巨大的資源浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重限制了芒果產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展[2]。芒果炭疽病是芒果腐敗的重要病癥之一，病原為盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢菌，屬半知菌亞門黑盤孢目炭疽菌屬（Colletotrichum gloeosporioides）。成熟的芒果果實(shí)容易受到病菌的侵染，開始時(shí)會(huì)形成黑褐色圓形病斑，隨后逐漸擴(kuò)展成圓形或接近圓形的黑褐色凹陷斑點(diǎn)。在后期，多個(gè)病斑合并成較大的不規(guī)則斑點(diǎn)，整個(gè)果實(shí)逐漸腐爛。如何保持芒果的采后品質(zhì)，特別是防治炭疽病對(duì)果實(shí)侵染造成的腐敗，是當(dāng)前芒果保鮮領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題[3]。

在芒果的保鮮方法中，主要包括物理保鮮法、化學(xué)保鮮法和生物保鮮法。其中生物保鮮法是近幾年更安全、更經(jīng)濟(jì)一種保鮮技術(shù)。它主要是利用拮抗微生物對(duì)果蔬病原菌的抑制作用從而達(dá)到保鮮效果。巨大芽孢桿菌作為拮抗微生物中的一種，已被證明對(duì)水稻紋枯病菌、花生黃曲霉病、魔芋軟腐病菌等有較顯著的防治作用，但目前將巨大芽孢桿菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物應(yīng)用到芒果炭疽病防治中的報(bào)道較少。本文通過(guò)提取巨大芽孢桿菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行培養(yǎng)皿實(shí)驗(yàn)和直接作用至芒果表皮，觀察并對(duì)比其抑菌效果，為芒果的生物保鮮技術(shù)提供依據(jù)。

1 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

巨大芽孢桿菌由廣東省微生物菌種保藏中心提供（菌株編號(hào)為GDMCC）;LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨5.0 g，酵母浸粉2.5 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0;營(yíng)養(yǎng)肉湯：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0;營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 000 mL，pH值調(diào)至7.0[4]。

1.1.2 儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)所用儀器設(shè)備如表1所示。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)菌液制備

（1）巨大芽孢桿菌發(fā)酵液的制備。巨大芽孢桿菌粉末倒入LB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，在搖床上以150 r/min的轉(zhuǎn)速37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h;無(wú)菌操作將活化后的菌株接種在斜面上，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;無(wú)菌操作挑取斜面上的菌斑接種在營(yíng)養(yǎng)肉湯中，在搖床上以150 r/min的轉(zhuǎn)速37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，即得到巨大芽孢桿菌發(fā)酵液。

（2）巨大芽孢桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵液的制備。將以上巨大芽孢桿菌發(fā)酵液于超聲波中振搖30 min，再于恒溫水浴鍋中以75 ℃水浴1 h，可起到滅菌的作用，同時(shí)保留次級(jí)代謝產(chǎn)物，即得巨大芽孢桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵液[5]。

（3）芒果炭疽病菌菌液的制備。按1 cm×1 cm尺寸剪下芒果果實(shí)上的黑斑5塊，放入經(jīng)過(guò)滅菌的0.9%生理鹽水中，攪拌均勻，吸取上清液，即得芒果炭疽病菌菌液。

1.2.2 抑菌活性測(cè)定方法

（1）巨大芽孢桿菌抑菌活性測(cè)定。采用濾紙片擴(kuò)散法，用移液槍取1 mL上述芒果炭疽病菌菌液于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的平板上，搖晃培養(yǎng)基使菌液分布均勻，將直徑2 cm的濾紙片浸泡在上述巨大芽孢桿菌發(fā)酵液中，待濾紙片完全浸濕后，將其置于平板中間，每組做3個(gè)平板，在培養(yǎng)箱中以27 ℃培養(yǎng)。24 h后取出濾紙片，再以27 ℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h，觀察抑菌圈。

（2）巨大芽孢桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物抑菌活性測(cè)定。采用濾紙片擴(kuò)散法，用移液槍取1 mL上述芒果炭疽病菌菌液于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的平板上，搖晃培養(yǎng)基使菌液分布均勻，將直徑2 cm的濾紙片浸泡在上述巨大芽孢桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵液中，待濾紙片完全浸濕后，將其置于平板中間，每組做3個(gè)平板，在培養(yǎng)箱中以27 ℃培養(yǎng)。24 h后取出再以27 ℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h，觀察抑菌圈[6]。

2 芒果噴淋實(shí)驗(yàn)

2.1 材料與試劑

供試芒果，小臺(tái)農(nóng)一號(hào)芒果，原產(chǎn)于印度，我國(guó)主要在廣西、云南、臺(tái)灣、福建及廣東等地種植，市售，挑選大小相當(dāng)、沒(méi)有病蟲害和沒(méi)有機(jī)械損傷的芒果。巨大芽孢桿菌發(fā)酵液，巨大芽孢桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵液。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

將處理好的芒果果實(shí)分別噴淋巨大芽孢桿菌發(fā)酵液和巨大芽孢桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵液，置于冰箱4 ℃下保存，同時(shí)做空白對(duì)照組，根據(jù)表2和表3隔天觀察芒果果皮顏色和黑斑。

3 結(jié)果與分析

3.1 巨大芽孢桿菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)炭疽病菌在培養(yǎng)基中的影響

空白組：培養(yǎng)基中長(zhǎng)滿炭疽病菌;實(shí)驗(yàn)組1（巨大芽孢桿菌發(fā)酵液）：抑菌圈內(nèi)無(wú)炭疽病菌生長(zhǎng)，抑菌圈外遍布炭疽病菌;實(shí)驗(yàn)組2（巨大芽孢桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵液）：抑菌圈內(nèi)無(wú)炭疽病菌生長(zhǎng)，抑菌圈外遍布炭疽病菌。以上結(jié)果表明巨大芽孢桿菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)芒果炭疽病菌均產(chǎn)生抑制作用。

3.2 巨大芽孢桿菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的抑菌作用在芒果果實(shí)上的影響

3.2.1 對(duì)芒果果皮顏色變化的影響

果皮顏色變化是芒果成熟過(guò)程中變化最顯著的標(biāo)志，根據(jù)表4可知巨大芽孢桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)芒果果皮轉(zhuǎn)黃有阻礙作用，這可能與降低芒果的呼吸作用有關(guān)。

3.2.2 對(duì)芒果分級(jí)的影響

根據(jù)表4果實(shí)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，擬定1、2級(jí)為優(yōu)秀果級(jí);3級(jí)為可食用果級(jí);4、5級(jí)為不可食用果。其中1、2級(jí)的果數(shù)占總處理果數(shù)的百分率為優(yōu)秀果率;1、2、3級(jí)果數(shù)占總處理果數(shù)的百分率為可食用果率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1和圖2所示。

實(shí)驗(yàn)組a為巨大芽孢桿菌發(fā)酵液處理，實(shí)驗(yàn)組b為巨大芽孢桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵液處理。由圖1可知，對(duì)照組可食用果率低于實(shí)驗(yàn)組，17 d后尤為明顯?？芍薮笱挎邨U菌發(fā)酵液與其次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵液處理組的芒果優(yōu)秀果率和可食用果率均高于對(duì)照組，因此發(fā)酵液可以延長(zhǎng)芒果的保存期，有助于提高芒果的好果率;由圖2可知，8 d時(shí)，未經(jīng)發(fā)酵液處理的對(duì)照組優(yōu)秀果率遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)組，并且逐漸下降，到17 d時(shí)優(yōu)秀果率為零。

4 結(jié)論與討論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)，可以觀察到巨大芽孢桿菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵液對(duì)芒果炭疽病菌和蒂腐病菌都有較為明顯的抑制作用。其中巨大芽孢桿菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵液能夠抑制芒果果皮轉(zhuǎn)黃，且作用較為顯著，是因?yàn)檗卓咕种屏颂烤也〉纳L(zhǎng)，其次級(jí)代謝產(chǎn)物降低了芒果的呼吸強(qiáng)度。

芒果是一種對(duì)乙烯敏感的水果，在衰老過(guò)程中呼吸作用與乙烯產(chǎn)生均顯著增加，乙烯在植物種子萌發(fā)、植物生長(zhǎng)、果實(shí)成熟、器官脫落和衰老以及抗病性等生理過(guò)程中起著重要作用。本文研究的巨大芽孢桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物可能抑制了芒果果實(shí)中乙烯的產(chǎn)生或阻止乙烯與炭疽菌受體的結(jié)合，減少芒果腐爛，使芒果果實(shí)炭疽病的癥狀降低，這有可能是巨大芽孢桿菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)采后芒果的一種保鮮機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1]蘇小軍，蔣躍明，于新，等.芒果采后生物學(xué)及貯運(yùn)保鮮技術(shù)研究進(jìn)展[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001（1）：60-66.

[2]王文靜，羅睿雄，黃建峰，等.杧果炭疽病研究進(jìn)展[J].云南農(nóng)業(yè)科技，2020（6）：42-45.

[3]黃建新.芒果采后病害生物防治研究進(jìn)展[J].南方農(nóng)業(yè)，2014，8（3）：3-4.

[4]秦健.巨大芽孢桿菌B196菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)的發(fā)酵條件優(yōu)化及分離鑒定研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2013.

[5]孔青，劉奇正，耿娟，等.海洋巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉毒素的生物合成[J].食品工業(yè)科技，2010，31（8）：132-134.

[6]趙妗頤，肖洋，楊龍，等.巨大芽孢桿菌L2發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)魔芋軟腐病菌的抑菌機(jī)制[J].食品科學(xué)，2019，40（21）：14-20.

基金項(xiàng)目：探索拮抗微生物及其次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)芒果冷鏈保鮮效果的影響（s202113714007）。

作者簡(jiǎn)介：周煒凱（1999—）男，廣東汕尾人，本科在讀。研究方向：食品質(zhì)量與安全。

通信作者：薛斌（1991—），男，甘肅隴西人，碩士，助教。研究方向：功能性實(shí)物組分。E-mail：370069236@qq.com。