孟祥熙，溫海玲，鄭金光，吳忠隱，胡森，孫奎

1 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形科，河北承德067000；2 解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心燒傷整形醫(yī)學(xué)部；3 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血管外科；4 解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究部創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生研究中心

嚴(yán)重?zé)齻缙?，心肌結(jié)構(gòu)損傷，心肌細(xì)胞凋亡，心功能降低，誘發(fā)或加重休克，早期心肌損害和功能減退也是缺血缺氧的啟動(dòng)因素之一［1-2］。早期心肌細(xì)胞凋亡是心肌損傷及其并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的重要病理機(jī)制［3］。嚴(yán)重?zé)齻缙谛墓δ苁軗p，進(jìn)一步加重休克，如果早期給予抗休克維持藥物，保護(hù)心臟功能，能為后續(xù)治療爭取時(shí)間，提高救治成功率及生存率。伏立諾他（SAHA）是一種組蛋白去乙?；敢种苿?。組蛋白3 第9 位乙?；馁嚢彼幔ˋc-H3K9）是反映機(jī)體組蛋白乙酰化水平的一個(gè)可靠指標(biāo)。以往研究證實(shí)，SAHA 能提高膿毒性休克小鼠的生存率，延長生存時(shí)間［4］，保護(hù)致死性燙傷大鼠心臟功能［5］，預(yù)防缺血—再灌注引起的心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體功能障礙［6］，但具體機(jī)制仍不明確。2018 年7 月—2020 年9 月，本研究觀察了SAHA 對(duì)50% TBSA Ⅲ°燙傷大鼠心肌損傷和心肌細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用，并探討相應(yīng)機(jī)制，為SAHA 在嚴(yán)重?zé)齻缙诒Ｗo(hù)心臟功能、抑制心肌細(xì)胞凋亡的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 雄性SD 大鼠24 只，60～70日齡，體質(zhì)量240～260 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周以上，室溫22 ～25 ℃，自由飲食。實(shí)驗(yàn)前12 h 禁食，自由飲水。SAHA、戊巴比妥鈉購自Sigma 公司。Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb 購 自Cell Signaling 公司。TUNEL檢測陽性對(duì)照制備試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。一氧化氮（NO）檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司。誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）抗體購自Abcam 公司。兔抗大鼠Ac-H3K9 抗體購自英國Abcam 公司。小鼠抗大鼠GAPDH 抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。肌酸激酶同工酶（CK-MB）測定試劑盒購自上海執(zhí)誠生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及造模、給藥方法 取24 只大鼠，隨機(jī)分為假燙組、燙傷組和SAHA 組，每組8 只大鼠。戊巴比妥鈉50 mg/kg 腹腔麻醉，剪除背部和腹部毛發(fā)，將大鼠放置在預(yù)制模板的矩形開口，露出裸露皮膚，同時(shí)保護(hù)剩余皮膚。燙傷組、SAHA 組建立燙傷大鼠模型：于100 ℃水浴中背部浸泡15 s、腹部浸泡8 s造成50%TBSA Ⅲ°燙傷（燙傷深度經(jīng)病理組織切片檢查證實(shí)）。燙傷組和SAHA 組傷后分別于腹腔內(nèi)注射0.25 mL 生理鹽水和7.5 mg/kg 的SAHA（溶于0.25 mL 生理鹽水）。假燙組采用37 ℃水浴，背部15 s，腹部8 s，處理后腹腔內(nèi)注射0.25 mL 生理鹽水。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 血漿CK-MB 檢測 各組于傷后6 h 抽取腹主動(dòng)脈血標(biāo)本，離心后取血漿，全自動(dòng)生化分析儀測定血漿CK-MB，評(píng)價(jià)心肌損傷程度。

1.4 心肌細(xì)胞凋亡率測算 各組于傷后6 h行腹主動(dòng)脈穿刺，抽取血標(biāo)本，然后處死動(dòng)物，胸正中線剖開取心肌組織，TUNEL 法檢測凋亡心肌細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取心肌組織區(qū)域中5 個(gè)非重疊高倍鏡視野，計(jì)數(shù)凋亡心肌細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率。

1.5 心肌細(xì)胞中Caspase-3、iNOS、Ac-H3K9、NO 檢測 采用Western blotting 法檢測心肌細(xì)胞中的Caspase-3、iNOS、Ac-H3K9蛋白。取100 mg 大鼠心肌組織，加入1 mL 的RIPA 裂解液勻漿，于冰上靜置20 min 后12 000 g 離心20 min，吸取上清并用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定。行常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉60 min 后分別加入相應(yīng)一抗（GAPDH 抗體1∶5 000，iNOS 抗體1∶400，Caspase-3 抗體1∶1 000，Ac-H3K9 抗體1∶400），4 ℃孵育過夜。TBST 洗15 min、共3 次，分別加入相應(yīng)二抗（1∶5 000），室溫孵育30 min，TBST 洗15 min、共3次。用超敏ECL 發(fā)光液發(fā)光、曝光、顯影、定影，用Image J 軟件分析條帶灰度，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶灰度值比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。采用NO 檢測試劑盒測定心肌細(xì)胞中的NO，按照試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血漿CK-MB 水平比較 假燙組、燙傷組、SAHA 組血漿CK-MB 水平分別為（585.6 ±46.1）、（5418.7 ± 292.9）、（3 475.3 ± 187.5）U/L。燙傷組血漿CK-MB 水平高于假燙組，SAHA 組血漿CK-MB水平低于燙傷組（P均＜0.05）。

2.2 各組心肌細(xì)胞凋亡情況比較 正常心肌組織結(jié)構(gòu)排列整齊、緊密。燙傷后，心肌纖維出現(xiàn)扭曲、變形，間質(zhì)出現(xiàn)充血、水腫，甚至肌纖維斷裂，心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。給予SAHA 處理后，心肌病理變化和間質(zhì)水腫較燙傷組明顯減輕，心肌纖維排列較整齊。假燙組、燙傷組、SAHA 組心肌細(xì)胞凋亡率分別為0.6%±0.1%、21.5%±1.2%、15.1%±0.9%，燙傷組心肌細(xì)胞凋亡率高于假燙組，SAHA 組心肌細(xì)胞凋亡率低于燙傷組（P均＜0.05）。

2.3 各組心肌細(xì)胞中Caspase-3、iNOS、Ac-H3K9、NO 表達(dá)比較 燙傷組心肌細(xì)胞中Caspase-3、iNOS、NO蛋白表達(dá)高于假燙組，Ac-H3K9蛋白表達(dá)低于假燙組（P均＜0.05）；SAHA 組Caspase-3、iNOS、NO 表達(dá)低于燙傷組，Ac-H3K9 表達(dá)高于燙傷組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞中Caspase-3、iNOS、Ac-H3K9、NO表達(dá)比較（xˉ± s）

3 討論

嚴(yán)重?zé)齻缙?，大量液體滲出，有效循環(huán)血量銳減，組織缺血，影響細(xì)胞代謝和臟器功能，直接導(dǎo)致心肌損傷；同時(shí)由應(yīng)激反應(yīng)、再灌注損傷、失控性炎癥反應(yīng)等，致血管內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變，進(jìn)一步引起微循環(huán)障礙，由此加重心肌的缺血缺氧和心肌損害［7-9］。嚴(yán)重?zé)齻缙诩闯霈F(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡，造成心肌不可逆損傷，是心肌損傷的病理基礎(chǔ)。在燒傷休克早期，如果給予抗休克維持藥物，提高心肌細(xì)胞對(duì)缺血缺氧的耐受能力、抑制心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而保護(hù)心臟功能，有助于提高患者生存率，降低后期救治難度。

伏立諾他是一種組蛋白去乙?；敢种苿驯幻绹鳩DA批準(zhǔn)用于皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的治療。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙酰化酶抑制劑能夠調(diào)節(jié)組蛋白乙?；?，調(diào)控基因表達(dá)。在嚴(yán)重?zé)齻笆а孕菘说膭?dòng)物模型中，組蛋白去乙?；敢种苿┠芴岣邉?dòng)物生存率、提高心肌內(nèi)組蛋白的乙酰化修飾水平、保護(hù)心臟功能［10-12］。在大鼠心肌梗死模型中，SAHA 能抑制組蛋白去乙?；富钚?，誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)，維持心肌細(xì)胞穩(wěn)定［13］。在小鼠缺血—再灌注損傷模型中，SAHA 能阻止缺血—再灌注引起的心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體功能障礙和丟失［6］。

SAHA 對(duì)致死性燙傷大鼠心臟保護(hù)作用的相關(guān)研究較少。本研究建立了無靜脈補(bǔ)液條件下致死性燙傷大鼠模型，結(jié)果顯示，在大鼠致死性燙傷后，血漿CK-MB 水平明顯升高，心肌纖維排列紊亂、斷裂，間質(zhì)充血、水腫，心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高；給予SAHA 治療后，CK-MB 水平降低，心肌損傷及間質(zhì)水腫減輕，心肌細(xì)胞凋亡率下降。這提示SAHA 能保護(hù)心肌結(jié)構(gòu)完整，抑制嚴(yán)重燙傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而保護(hù)心臟功能。

組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；竿ㄟ^調(diào)節(jié)組蛋白乙?；剑瑢?duì)維持細(xì)胞正常功能有重要作用。正常情況下，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙酰化酶蛋白的結(jié)構(gòu)和酶活性保持高度平衡，稱為乙?；瘎?dòng)態(tài)平衡。當(dāng)機(jī)體在創(chuàng)傷、缺血缺氧的情況下，這種平衡被打破［14］。研究表明，在心肌梗死與缺血再灌注損傷過程中，組蛋白去乙酰化酶活性降低，而給予組蛋白去乙?；敢种苿┖螅娠@著減少心肌梗死面積，減輕心臟損傷［15］。以往研究顯示，Ac-H3K9 能反映心肌組織中組蛋白乙酰化水平［16］。本研究結(jié)果顯示，燙傷組傷后6 h，心肌細(xì)胞中Ac-H3K9 蛋白表達(dá)較假燙組降低，而給予SAHA 處理的大鼠心肌細(xì)胞中Ac-H3K9 表達(dá)升高，表明SAHA 可能通過提高燙傷后大鼠心肌內(nèi)組蛋白乙酰化水平，維持心肌細(xì)胞穩(wěn)定，抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心臟結(jié)構(gòu)。

Caspase-3 是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要因子，其活化后剪切PARP，使核小體間的DNA 裂解，引起心肌細(xì)胞凋亡，造成心肌細(xì)胞的不可逆損傷，進(jìn)而影響心臟功能［17］。在本研究中，燙傷組傷后心肌細(xì)胞Caspase-3 蛋白表達(dá)增高，SAHA 組Caspase-3 表達(dá)較燙傷組降低，表明SAHA 有助于抑制Caspase-3 生成，從而減少心肌細(xì)胞凋亡。在心衰、心肌缺血—再灌注損傷、嚴(yán)重?zé)齻^程中，心肌細(xì)胞缺血缺氧，早期心肌細(xì)胞p53 激酶明顯活化［18］，上調(diào)iNOS 表達(dá)，引起心肌細(xì)胞凋亡［19］；iNOS 高表達(dá)進(jìn)一步誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)NO 生成增多，NO 通過調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的多個(gè)途徑來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究表明，高水平的NO 可以直接誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡［20］。本研究結(jié)果顯示，與假燙組比較，燙傷組在傷后心肌細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)及NO 水平明顯增加，而給予SAHA 處理后，iNOS、NO 水平均顯著降低，提示SAHA 可能通過減少心肌細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)及NO生成從而減少心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，SAHA 能夠抑制50% TBSA Ⅲ°嚴(yán)重燙傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)心臟功能。其作用機(jī)制可能與增加心肌細(xì)胞中組蛋白乙?；剑抡{(diào)Caspase-3、iNOS蛋白表達(dá)及NO含量有關(guān)。