楊樹法，劉妍，王天鐸，秦朗，閆有圣，陰赪宏

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院北京婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，北京100026

先天性腎臟疾病嚴(yán)重影響患兒生活質(zhì)量，預(yù)防先天性腎病能夠有效降低社會和家庭的負擔(dān)?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的臨床應(yīng)用使得更多類型的染色體微缺失/重復(fù)、點突變等基因組變異被檢出，提高了先天性腎病發(fā)育相關(guān)基因突變的檢出率。與成人遺傳咨詢相比，產(chǎn)前階段胎兒臨床資料相對缺失，使得正確闡釋這些基因組變異的臨床意義面臨挑戰(zhàn)。研究表明，與胎兒發(fā)育相關(guān)的基因信息存在于羊水游離RNA（AfcfRNA）中［1-3］，分析AfcfRNA 中基因變化有助于解讀基因突變的致病性。但是，AfcfRNA 中基因來源組織的多樣性和泌尿系統(tǒng)發(fā)育的復(fù)雜性，增加了從AfcfRNA 中獲取泌尿系統(tǒng)發(fā)育信息的難度。因此，2020 年1 月—2021 年1 月，本研究分析了孕中期正常胎兒AfcfRNA 轉(zhuǎn)錄組，試圖從AfcfRNA轉(zhuǎn)錄組中篩選泌尿系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因，為AfcfRNA 在產(chǎn)前胎兒泌尿系統(tǒng)發(fā)育評估中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)來源 從GEO 數(shù)據(jù)庫中按照入選和排除標(biāo)準(zhǔn)下載胎兒AfcfRNA 的芯片檢測數(shù)據(jù)。共獲取56 例 胎 兒AfcfRNA 的 檢 測 結(jié) 果（GSE101141，GSE16176， GSE25634， GSE33168， GSE47394，GSE48521，GSE49893，GSE58435），芯 片 類 型 為Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0芯片。56例標(biāo)本均為孕中期（孕13～27 周）羊水，孕婦無妊娠并發(fā)癥，單胎妊娠，胎兒發(fā)育正常，染色體核型正常。排除胎兒B超檢查結(jié)果異常者。

1.2 基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析 采用Olgio軟件對芯片檢測結(jié)果進行讀取、背景校正以及歸一化。在獲取基因表達量后，利用SVA 軟件包去除批次效應(yīng)，使不同芯片檢測結(jié)果具有相似的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。在不同樣品的檢測結(jié)果具有可比性的基礎(chǔ)上，利用WGCNA 軟件的動態(tài)樹形剪切算法建立基因共表達模塊，進行基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析，軟閾值設(shè)為12，最小類的大小設(shè)置為30。篩選得到的基因共表達模塊以不同顏色名稱表示。通過分析AfcfRNA 轉(zhuǎn)錄組中基因平均表達量和變異系數(shù)（CV%），顯示不同模塊基因表達量情況。CV 值為基因在所有研究樣品的表達量的標(biāo)準(zhǔn)差除均值再乘100得出。

1.3 泌尿組織特異基因篩選 從Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫［4］下載正常組織的基因表達量數(shù)據(jù)（https：//www.proteinatlas.org/download/rna_tissue_consensus.tsv.zip）。編寫R 語言腳本，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)所涉及組織和基因類別。將在泌尿組織中的表達量高于所有組織中平均表達量10 倍以上的基因判定為泌尿組織特異基因。

1.4 泌尿組織特異基因共表達模塊的功能富集分析 編寫R 腳本，從共表達模塊中選取泌尿組織特異基因，建立泌尿組織特異基因共表達模塊。利用Cluster Profiler 軟件包對每個泌尿組織特異基因共表達模塊中的基因進行GO 功能富集分析［5］。用Benjamini-Hochberg 法進行P值調(diào)整，校正P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 共表達基因的蛋白—蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵基因篩選 從STRING數(shù)據(jù)庫下載PPI數(shù)據(jù)（https：//stringdb-static.org/download/protein.links.v11.0/9606.protein.links.v11.0.txt.gz）［6］，Igraph軟件包進行PPI網(wǎng)絡(luò)制圖，編寫R語言腳本，統(tǒng)計泌尿組織特異基因共表達模塊中基因編碼蛋白的相互作用關(guān)系，將combine_score 設(shè)為150，統(tǒng)計每個基因的degree，選擇degree＞20的基因作為關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 正常AfcfRNA 中基因共表達模塊 利用WGCNA 軟件共建立20 個共表達模塊，以不同的顏色表示模塊名稱（black，blue，brown，cyan，green，greenyellow，grey60，lightcyan，lightgreen，lightyellow，magenta，midnightblue，pink，purple，red，royalblue，salmon，tan，turquoise 及yellow）。具有共表達關(guān)系的基因具有更高的表達量。

2.2 泌尿組織特異基因共表達模塊的功能富集分析結(jié)果 Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫中泌尿組織包括腎臟和膀胱。篩選出270 個基因為泌尿組織特異基因。分別將這270 個泌尿組織特異基因與共表達模塊中的基因取交集，建立泌尿組織特異基因的共表達模塊。在brown，green 及turquoise 模塊中富集到泌尿系統(tǒng)功能相關(guān)的GO 分析項目（表1）。這些功能涉及中腎發(fā)生和發(fā)育、腎單位發(fā)生、腎小球、腎小管生成及腎上皮發(fā)育等腎臟發(fā)育相關(guān)功能。

表1 泌尿組織特異基因共表達模塊的功能富集分析結(jié)果

2.3 泌尿組織特異基因共表達模塊中關(guān)鍵基因篩選結(jié)果 將brown、green 及turquoise 模塊內(nèi)的泌尿組織特異基因進行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，確定各個模塊的關(guān)鍵基因。在combine_score 為150、degree 為20 時，共篩選到18 個關(guān)鍵基因，分別為CLCNKB、MIOX、NAT8、SLC13A3、SLC3A1、SLC6A18、UGT1A6、REN、AQP2、BSND、CYP24A1、CYP4A11、FOXI1、FXYD2、SLC17A1、SLC34A1、SLC7A9 及TRPV5。計算各基因在所有樣品中的平均表達量，得到P25為3.09，利用該閾值將孕中期AfcfRNA 中表達量偏低的關(guān)鍵基因刪除，得到孕中期高表達的13個關(guān)鍵基因，其中5個基因來自brown 模塊（CLCNKB、SLC6A18、NAT8、MIOX 及SLC3A1）、8 個 基 因 來 自turquoise 模 塊（AQP2、CYP4A11、SLC7A9、SLC13A3、FXYD2、TRPV5、SLC17A1 及BSND）。各關(guān)鍵基因的來源模塊、degree、平均表達量及CV%見表2。

表2 18個泌尿系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵基因分析結(jié)果

3 討論

泌尿系統(tǒng)主要由腎臟、膀胱和尿道組成。B 超是篩查腎臟先天畸形的主要手段，但對于腎小球、腎小管等微小結(jié)構(gòu)病變及腎泌尿和排泄功能的異常，產(chǎn)前B超篩查難以檢出。獲取與腎臟發(fā)育密切相關(guān)的分子標(biāo)志物具有重要臨床意義。

AfcfRNA 來源于孕婦羊水，是可安全獲取的胎兒組分。本研究利用WGCNA 分析將AfcfRNA 中的基因歸為20 個共表達模塊。在共表達關(guān)系建立過程中，部分低表達量基因被過濾。AfcfRNA 來源于胎兒多個組織，針對此特點，研究中利用基因表達數(shù)據(jù)庫，篩選了泌尿組織特異基因，將其與共表達模塊相結(jié)合，建立了泌尿組織特異基因共表達模塊。通過GO 分析發(fā)現(xiàn)，泌尿組織特異模塊中的基因與中腎發(fā)生和發(fā)育、腎單位發(fā)生、腎小球生成、腎小管生成及腎上皮發(fā)育等腎臟發(fā)育相關(guān)功能密切相關(guān)，從功能上驗證了研究中建立的模塊與腎臟發(fā)育有關(guān)。

基于STRING 數(shù)據(jù)庫［6］，本研究篩選了共表達模塊中的關(guān)鍵基因，以此來集中體現(xiàn)共表達模塊的生物學(xué)功能。在brown、green 及turquoise 共表達模塊中共篩選到18個關(guān)鍵基因。這18個關(guān)鍵基因中，共有13個基因在正常AfcfRNA 中表達量高于P25，具有高表達特點。關(guān)鍵基因中，5 個來自brown 模塊（CLCNKB、SLC6A18、NAT8、MIOX 及SLC3A1），8 個來 自turquoise 模 塊（AQP2、CYP4A11、SLC7A9、SLC13A3、FXYD2、TRPV5、SLC17A1及BSND）。

CLCNKB 編碼管基底氯通道ClC-Kb，其突變可以導(dǎo)致Ⅲ型Bartter綜合征，表現(xiàn)為低血鉀性堿中毒、腎素和醛固酮增高、腎小球旁器增生和肥大［7］。SLC6A18 是高表達在腎臟和小腸的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白［8］，有研究表明其與中性氨基酸的吸收有關(guān)［9］。NAT8 編碼腎臟和肝臟特異的乙酰轉(zhuǎn)移酶，在腎小球功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［10］，其突變與腎功能衰竭的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11］。MIOX 編碼肌醇加氧酶，其升高可以增強細胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)，造成腎小管損傷［12］。SLC3A1編碼胱氨酸攝取轉(zhuǎn)運體，在腎臟表達量最高，期次是小腸和肝臟［13］，其突變可以導(dǎo)致胱氨酸尿和胱氨酸結(jié)石［14］。AQP2 是一種水通道蛋白，負責(zé)腎臟收集管水的重吸收，其突變可以導(dǎo)致嚴(yán)重的腎源性尿崩癥［15-16］。CYP4A11 在腎遠端小管高表 達［17］，其 基 因 多 態(tài) 性 與 高 血 壓 密 切 相 關(guān)［18］。SLC7A9編碼異二聚體氨基酸轉(zhuǎn)運體蛋白，在腎臟遠端小管胱氨酸重吸收中發(fā)揮重要作用，其突變與尿石癥密切相關(guān)［19］。FXYD2 是Na+-K+-ATP 酶的γ 亞單位，與鎂離子在腎臟的重吸收功能密切相關(guān)，其突變會導(dǎo)致高鎂尿癥和低鎂血癥［20］。TRPV5 編碼腎臟瞬時受體電位香草酸5 亞型受體，是高選擇性鈣離子通道，參與腎臟鈣離子的重吸收并維持鈣離子穩(wěn)態(tài)，其突變體是尿石癥的遺傳學(xué)基礎(chǔ)［21］。SLC17A1 是腎臟尿酸轉(zhuǎn)運蛋白，其無義突變會增加尿酸鹽的排泄［22］。BSND 突變會導(dǎo)致Ⅳ型Bartter 綜合征，表現(xiàn)為低鉀血癥、代謝性堿中毒、血清腎素活性升高及醛固酮增多癥等［23］。

綜上所述，本研究利用共表達網(wǎng)絡(luò)分析和組織特異基因篩選的方法，分析孕中期正常胎兒AfcfRNA轉(zhuǎn)錄組，建立了泌尿系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的共表達網(wǎng)絡(luò)；關(guān)鍵基因功能涉及中腎發(fā)生和發(fā)育、腎泡的發(fā)育、腎單位發(fā)生、腎小管生成、腎臟發(fā)育及泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)生等。這些關(guān)鍵基因有望成為產(chǎn)前診斷中評估泌尿系統(tǒng)發(fā)育的標(biāo)志物。