潘燕珊 胡錦興 王維勇

廣州市胸科醫(yī)院(廣州 510095)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性潛在致命性傳染病，2019年全球估計1 000萬人感染結(jié)核病，140萬人死于結(jié)核病[1]。肺結(jié)核是最常見且具有傳染性的結(jié)核病分型，初治敏感型肺結(jié)核需要至少六個月的標(biāo)準(zhǔn)化一線抗結(jié)核藥物治療，而一線抗結(jié)核藥物中利福平作為廣譜抗生素，需要足量全程使用，異煙肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇作為針對分枝桿菌的窄譜抗生素，亦需要長期使用，如此長時間持續(xù)使用抗生素，必將對機體的微生物群產(chǎn)生影響。長時間口服抗結(jié)核藥物，會持續(xù)作用在胃腸道，對腸道微生物群產(chǎn)生影響。我們知道，腸道微生態(tài)系統(tǒng)作為五大微生物系統(tǒng)之一，其微生物含量最大、最復(fù)雜[2]，該系統(tǒng)在免疫調(diào)節(jié)[3]、病原體防御、物質(zhì)代謝等中起核心作用[4]。抗結(jié)核藥物的使用會打破腸道微生物群的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致某些特定腸道菌群的改變，進(jìn)而可能削弱巨噬細(xì)胞、CD4+細(xì)胞免疫防御作用，同時也會影響到短鏈脂肪酸產(chǎn)生，該代謝產(chǎn)物減少可抑制機體促炎和抗炎反應(yīng)[5]，最終可能對肺結(jié)核治療產(chǎn)生負(fù)面影響，目前對肺結(jié)核與腸道微生態(tài)相互關(guān)系的研究[6]仍不多，且研究主要集中在結(jié)核病患者與健康對照組的對比，很少有臨床研究同一患者不同治療階段微生物變化，本文主要研究同一患者早期抗結(jié)核治療不同時間節(jié)點的腸道微生物變化。

1 資料與方法

1.1 肺結(jié)核患者入組和糞便收集流程

本研究招募廣州市胸科醫(yī)院20名志愿者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合臨床診療指南菌陽肺結(jié)核初治診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②接受標(biāo)準(zhǔn)異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇方案治療的患者(如出現(xiàn)明顯胃腸道反應(yīng)，利福平可調(diào)整為利福噴汀[8- 9])；③年齡大于等于18周歲；④治療前2月未使用過抗生素治療；⑤所有受試者均為HIV陰性；⑥簽署書面知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①診斷為胃腸道疾?。虎趪?yán)重肝腎功能不全或疾??；③糖尿病；④長期使用全身激素或免疫抑制劑者；⑤DST確認(rèn)為耐藥結(jié)核??；⑥懷孕。這項研究經(jīng)中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查委員會批準(zhǔn)(編號：中大公衛(wèi)醫(yī)倫[2019]第063號)，并獲得所有參與者的書面知情同意。

本研究入組肺結(jié)核初治患者共20例，分2個時間節(jié)點收取標(biāo)本，強化期方案抗結(jié)核治療1周者歸為A組，完成強化期治療者歸為B組，20例患者均無合并腸結(jié)核，無粉塵接觸史。肺部病灶局限在單側(cè)肺患者有7例，雙側(cè)肺部均有病灶患者有13例。抗結(jié)核治療1周內(nèi)出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)調(diào)整利福平為利福噴丁患者有3例，調(diào)整后能完成強化期全程治療，全程使用利福平患者有17例，強化期結(jié)束患者癥狀、影像學(xué)、痰病原學(xué)均有好轉(zhuǎn)。入組人口特征：男10例，女10例，年齡(37.8±15.6)歲，體質(zhì)量指數(shù)(19.3±2.96)kg/m2，吸煙指數(shù)(3±7.14)支/年，治療1周后DNA序列(91882.8±17631)，治療方案結(jié)束時DNA序列數(shù)(79114.7±7589)。樣本采集：使用《糞便微生物基因組保護(hù)液套裝》(LS-R-P- 003,Longsee)，按照產(chǎn)品說明進(jìn)行采樣，采取新鮮糞便樣本后立刻送實驗室-20 ℃儲存直至DNA提取。

1.2 方法

1.2.1 糞便樣本菌群核酸提取 取1 mL含有樣本的保護(hù)液，12 000 r/min離心15 min，棄上清。按照《糞便微生物基因組DNA提取試劑盒》(LS-R-N- 015，Longsee)操作說明提取糞便菌群DNA，核酸總量至少達(dá)1 μg。1%瓊脂糖凝膠120 V電泳30 min觀察條帶完整性。

1.2.2 16S rDNA測序文庫構(gòu)建和測序 使用338F、806R引物并添加樣本特異性Barcode序列擴增16S rRNA基因V3-V4高度可變區(qū)。338F: 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA- 3′, 806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′(Barcode序列未顯示)。PCR試劑盒采用Q5?High-Fidelity DNA Polymerase (M0491, NEB)擴增。PCR擴增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并對目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收，回收采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AP-GX- 50G, Axygen)。將PCR擴增回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，根據(jù)熒光定量結(jié)果，對各樣本按相應(yīng)比例進(jìn)行混合。采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit(FC-121- 4001, Illumina)制備測序文庫。首先對上述擴增產(chǎn)物進(jìn)行序列末端修復(fù)，通過試劑盒中的End Repair Mix2切除DNA序列5′端的突出堿基，同時添加一個磷酸基團、補齊3′端的缺失堿基；在DNA序列的3′端添加A堿基以防止DNA片段自連，同時保證目標(biāo)序列能與測序接頭相連(測序接頭3′端有一個突出的T堿基)；在序列5′端添加含有文庫特異性標(biāo)簽(即Index序列)的測序接頭，使DNA分子能被固定在Flow Cell上；采用BECKMAN AMPure XP Beads，通過磁珠篩選去除接頭自連片段，純化添加接頭后的文庫體系；對上述連上接頭的DNA片段進(jìn)行PCR擴增，從而富集測序文庫模板，并采用BECKMAN AMPure XP Beads再次純化文庫富集產(chǎn)物；通過2%瓊脂糖凝膠電泳，對文庫做最終的片段選擇與純化。采用Agilent High Sensitivity DNA Kit(5067- 4626, Agilent)對文庫在Agilent Bioanalyzer上進(jìn)行質(zhì)檢。質(zhì)檢及格后采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(P11496, InvitrogenTM)在Promega QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)上對文庫進(jìn)行定量，將合格的各上機測序文庫(Index序列不可重復(fù))梯度稀釋后，根據(jù)所需測序量按相應(yīng)比例混合，并經(jīng)NaOH變性為單鏈進(jìn)行上機測序；測序試劑采用MiSeq Reagent Kit V3 (600 cycles)(MS-102- 3003, Illumina)，使用MiSeq-PE250測序儀進(jìn)行2×300 bp的雙端測序。最后對 Illumina Miseq 測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 測序數(shù)據(jù)

A、B 2個對比組共40個樣品測序共獲得3 932 908序列，雙端序列拼接，過濾低質(zhì)量序列后共產(chǎn)生3 419 950序列，每個樣品平均產(chǎn)生85 499條優(yōu)化序列，至少產(chǎn)生60 074條優(yōu)化的序列(使用軟件為fastp v0.20.0)。所有樣品文庫的覆蓋率為99%，說明每個樣品的測序量已經(jīng)飽和。

2.2 2組樣本腸道微生物多樣性分析

Alpha多樣性指標(biāo)衡量樣本中菌群多樣性，代表指數(shù)有Chao1和observed_otus指數(shù)(見圖1a、圖1b)，該指數(shù)值越大，樣本的豐富度及多樣性越大，A、B 2組比較，其值在A組為(81±34.7)和(81±34.7)，B組為(97.8±28.3)和(97.6±28.2)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.056、P=0.04；Z=-2.070、P=0.038)，表明在抗結(jié)核治療1周基礎(chǔ)上繼續(xù)延長強化期方案治療，菌群多樣性會增加。Beta多樣性是衡量樣本間差異大小的指標(biāo)，其中分析的指標(biāo)包括Weighted UniFrac距離和Unweighted UniFrac距離(見圖2a、圖2b)，統(tǒng)計檢驗結(jié)果為P<0.05，A組和B組兩組比較，其P值分別為P=0.922，P=0.198，差異未見統(tǒng)計學(xué)意義，表明規(guī)則抗結(jié)核治療1周及強化期治療結(jié)束時的患者的腸道群落構(gòu)成差異小。

圖1 A組與B組Alpha多樣性盒型圖注：藍(lán)色盒型圖代表A組的Chao1指數(shù)及observed_otus指數(shù)，紅色盒型圖代表B組的Chao1指數(shù)及observed_otus指數(shù)，圖a、b中的盒型圖還指示了多樣性指數(shù)的中位數(shù)，最大值、最小值以及上下四分位數(shù)，最大值及最小值以外的點為個別異常值。

圖2 A組和B組PCoA散點圖注：PCoA散點圖上每個點表示每個組中的一個示例。藍(lán)色代表A組組成部分，紅色代表B組組成部分。兩個組聚集在同一區(qū)域的點越多，組間差異越小。圖a為Weighted Unifrac距離分析，圖b為Unweighted Unifrac距離分析。

2.3 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

本研究對20例患者在2個時間節(jié)點，在綱和屬水平上菌種結(jié)構(gòu)的差異進(jìn)行了比較，圖3a顯示了20例患者在抗結(jié)核治療1周及強化期治療結(jié)束時綱水平上每一個標(biāo)本的菌種組成，圖3b顯示了20例患者在抗結(jié)核治療1周及強化期治療結(jié)束時屬水平上每一個標(biāo)本的菌種組成。

圖3 物種分類圖注：圖a表示綱水平菌種分類圖，圖b表示屬水平菌種分類圖，圖中A1、A2...A20代表20例患者強化期1周腸道菌群分類，B1、B2...B20代表20例患者強化期結(jié)束的腸道菌群物種分類。圖中每個顏色代表一個物種，柱狀圖中色塊長度表示物種所占相對豐度比例。

圖4 物種豐度疊積圖(科水平)

我們比較了A、B 2組患者科水平上的相對豐度(圖4)。A組中相對豐度最高的科前十位分別是擬桿菌科(Bacteroidaceae，30.2%)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae，12.8%)、毛螺菌科(Lachnospiraceae，8.9%)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae，7.6%)、普氏菌科(Prevotellaceae，7.1%)、丹毒菌科(Erysipelotrichaceae，6.7%)、韋氏菌科(Veillonellaceae，5.4%)、腸球菌科(Enterococcacea，4.3%)、卟啉單胞菌科(Porphyromonadaceae，3.3%)、梭狀菌科(Fusobacteriaceae，2.0%)。B組相對豐度最高前十位分別是擬桿菌科(Bacteroidaceae，25.2%)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae，15%)、毛螺菌科(Lachnospiraceae，14.1%)、普氏菌科(Prevotellaceae，9.4%)、韋氏菌科(Veillonellaceae，6.6%)、丹毒菌科(Erysipelotrichaceae，5.7%)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae，5.1%)、梭狀菌科(Fusobacteriaceae，4.3%)、卟啉單胞菌科(Porphyromonadaceae，2.3%)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae，1.6%)。A、B組中相對豐度最高菌科類別大致相似，強化期結(jié)束時，擬桿菌科、腸球菌科、腸桿菌科、丹毒菌科、卟啉單胞菌科、雙歧桿菌科等相對豐度下降，毛螺菌科、梭桿菌科、普氏菌科、瘤胃球菌科、韋氏菌科等相對豐度增加。進(jìn)一步通過LEfse分析方案確定2組在各分類水平上顯著性差異，找出優(yōu)勢菌群。在LEfSe分析中，B組相較于A組，厚壁菌門(Firmerticutes)的瘤胃球菌(Ruminococcus);乳桿菌(Lactobacillus)和放線菌門(Actinobacteria)的柯林氏菌(Collinsella)相對豐度明顯增高，成為優(yōu)勢菌群。(P值均小于0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義)，見圖5。

圖5 2組間LEfse分析圖注：a圖為進(jìn)化分支聚類圖。由內(nèi)向外輻射的圓圈代表了由門至種的分類級別，在不同分類級別上的每一個圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈直徑大小與相對豐度大小成正比，無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，明顯差異物種統(tǒng)一著色為紅色。b圖為LDA值分布柱狀圖，使用了屬水平特征表，展示了LDA 效應(yīng)量大于設(shè)定值2的物種，柱狀圖長度代表差異物種的影響大小，上圖表明相較于B組，A組并無明顯的優(yōu)勢菌群。

3 討 論

腸道微生物種類繁多，單從細(xì)菌而言，主要由厚壁菌、擬桿菌、放線菌和變形桿菌4個門類的細(xì)菌組成，自門以下還可按照綱、目、科、屬 和種進(jìn)行分類，超過1 000個種類[2]，其中許多腸道微生物被證明在機體的物質(zhì)代謝、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、衰老、生長發(fā)育等多個方面起著核心作用，人體淋巴細(xì)胞總體約40%位于腸道內(nèi)[10]，胃腸道淋巴組織富含先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，這是保護(hù)宿主免受病原體入侵所必需的[11]。有研究表明幽門螺旋桿菌等腸道微生物與結(jié)核病的免疫保護(hù)有關(guān)[12]，并且這一機制是潛在的治療靶點[13]，肺結(jié)核好發(fā)于免疫力低下人群，腸道菌群的免疫調(diào)節(jié)作用可能被證明對宿主抵抗結(jié)核病至關(guān)重要。另外，已知短鏈脂肪酸能促進(jìn)鈣、鐵和維生素D吸收[14]，并具有維持腸道穩(wěn)態(tài)、抑制腫瘤、抗炎性反應(yīng)、抗氧化、增強腸道屏障功能等作用，而結(jié)核病患者的腸道菌群主要表現(xiàn)為產(chǎn)生短鏈脂肪酸的細(xì)菌(梭菌、雙歧桿菌、瘤胃球菌等)數(shù)量以及相關(guān)代謝異常，Hu Yongfei等[15]研究表明健康對照組和肺結(jié)核病患者比較，發(fā)現(xiàn)了25個物種在兩組中富集程度不同，其中23 個在健康對照中富集，其中有 9 種被報道為產(chǎn)生短鏈脂肪酸的細(xì)菌，包括丁酸鹽生產(chǎn)者食葡糖羅斯拜瑞氏菌(Roseburiainulinivorans)、羅氏菌屬(R.hominis)、羅氏菌屬(R.canceris)、直腸真桿菌(Eubacteriumrectale) 和 伴生糞球菌(Coprococcuscomes)，乳酸和醋酸鹽生產(chǎn)者青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)和長雙岐桿菌(B.longum)，以及兩種醋酸鹽和丙酸鹽生產(chǎn)者卵瘤胃球菌(Ruminococcusobeum)和嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila)，而一種未分類的糞芽孢菌屬(Coprobacillus)細(xì)菌和梭菌屬(Clostridiumboltaee)被發(fā)現(xiàn)在在患者體內(nèi)富集，這些菌種在不同人群富集不一致，我們大膽的推測，這些病原菌可能幫助我們鑒別個體是否獲得肺結(jié)核，甚至可能可以通過某些特定菌群富集程度的動態(tài)變化評估抗結(jié)核治療療效，本研究中，強化期治療1周與強化期結(jié)束時對比，毛螺菌科(Lachnospiraceae)相對豐度增加，食葡糖羅斯拜瑞氏菌(Roseburiainulinivorans)、羅氏菌屬(R.hominis)、羅氏菌屬(R.canceris)屬于毛螺菌科，瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)相對豐度增加，卵瘤胃球菌(Ruminococcusobeum)屬于此科，這些菌群的豐度增加，而這些菌群在健康對照組中富集，可能提示患者病情好轉(zhuǎn)，而在實際觀察中，規(guī)則完成強化期治療的患者病情改善，由此可見腸道微生物菌群的變化與肺結(jié)核的發(fā)展有著一定聯(lián)系。

除上述研究結(jié)果以外，目前越來越多的研究揭示了結(jié)核分枝桿菌感染后腸道菌群變化(Dubourg G等[16]，Winglee Kathryn等[17]，Matthew F等[18]，Luo Mei等[19]，Sivaranjani Namasivayam等[20])，大部分研究提示結(jié)核分支桿菌感染僅能引起腸道菌群的微小變化，而長時間的使用抗結(jié)核藥物會引起腸道微生物多樣性改變或菌群失衡，并且這些影響會貫穿治療全過程，甚至延長至停藥后的數(shù)月到1年，這些研究基本都是通過橫向?qū)Ρ确椒ㄟM(jìn)行，而腸道微生態(tài)會隨著不同宿主的生活環(huán)境、年齡、發(fā)育階段、疾病的狀態(tài)、飲食習(xí)慣等因素影響呈動態(tài)變化[2]。在本研究中，我們首次介紹在標(biāo)準(zhǔn)化治療方案下，縱向分析強化期不同階段的腸道微生物群的變化情況，結(jié)果顯示強化期方案治療1周及其基礎(chǔ)上繼續(xù)使用抗結(jié)核藥物直至強化期治療結(jié)束，腸道微生物多樣性增加，菌種結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)失衡。Namasivayam[20]等人通過鼠模型，給予小鼠HRZ方案處理，得出實驗數(shù)據(jù)提示抗結(jié)核治療1天已出現(xiàn)明顯多樣性變化，減少的菌類主要為厚壁菌門的梭菌綱，增加的菌為丹毒梭菌。孫玉霞[21]等人研究強化期四周抗結(jié)核治療微生物多樣性下降，菌種結(jié)構(gòu)失衡，腸道毛螺旋桿菌科豐度減少，擬桿菌屬豐度增加。Wipperman[18]等人給予HRZE治療數(shù)月，結(jié)果表明治療過程中改變腸道微生物群的分類組合，而不影響整體多樣性，與健康人群相比，減少菌為Blautia、乳桿菌、糞球菌、瘤胃球菌，雙歧桿菌，增加菌丹毒梭菌，梭桿菌，普氏桿菌。本研究與Namasivayam、Wipperma、孫玉霞等人研究結(jié)果不完全一致，上述研究對照組為健康人群，本研究為同一患者強化期治療不同階段的對比，根據(jù)研究結(jié)果分析，我們可以推測，患者開始抗結(jié)核治療1天以及1周內(nèi)，腸道微生物多樣性短時間、迅速下降，隨著抗結(jié)核治療時間的延長，部分腸道菌群開始恢復(fù)，并逐步趨于穩(wěn)態(tài)，某些菌群顯示出先減少后增加趨勢，提示強化期早期抗結(jié)核藥物對腸道微生態(tài)擾動明顯。本研究中強化期結(jié)束后減少的菌為擬桿菌科、卟啉單胞菌科、丹毒菌科、腸桿菌科、雙歧桿菌科等，增加菌為普氏菌科、毛螺菌科、韋氏菌科及梭桿菌科等，與上述其他研究不一致，考慮各個研究結(jié)果之間的差異，或許跟宿主本身、采樣時間、樣品數(shù)量、地域差異、對藥物不良反應(yīng)、入組條件、甚至測序及分析方法不同等因素有關(guān)，強化期治療是抗結(jié)核治療療程的關(guān)鍵階段，各研究均提示腸道微生態(tài)在此階段存在多樣性或結(jié)構(gòu)變化，而治療療效的反饋及藥物不良反應(yīng)在此階段尤為明顯[22]，是否腸道微生態(tài)與抗結(jié)核療效評價及藥物不良反應(yīng)間存在一定聯(lián)系，我們能否通過益生菌、益生元等營養(yǎng)制劑的使用改善腸道微環(huán)境達(dá)到改善疾病狀況的效果[23]，從而改善機體的免疫力，提高患者依從性，提高治愈率，這些均有待深入研究。本研究采取同一患者不同治療時間節(jié)點的方法去研究菌群變化，減少了因宿主、地域、飲食、疾病等因素導(dǎo)致的差異，然而，研究樣品量較少，今后擬擴大樣品量，并對同一患者進(jìn)行全療程的分析，有助于更系統(tǒng)地了解整個用藥階段、停藥階段等腸道微生物變化及對機體各個功能產(chǎn)生的影響。

綜上所述，與強化期治療1周腸道微生物群對比，強化期結(jié)束時腸道微生態(tài)多樣性增加，菌種結(jié)構(gòu)改變不明顯，是否能夠通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，從而增強宿主免疫力，減少不良反應(yīng)，提高強化期治療有效率，仍需進(jìn)一步研究。